BR112020005217A2 - métodos para a engenharia genética de células hospedeiras de kluyveromyces - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos de engenharia genética de Kluyveromyces. Os métodos podem ser usados para modificar geneticamente a Kluyveromyces para produzir e secretar anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos. A invenção também fornece métodos para produção e secreção de anticorpos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS PARA A ENGENHARIA GENÉTICA DE CÉLULAS HOSPEDEI- RAS DE KLUYVEROMYCES".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Os métodos e as composições fornecidos neste documento referem-se aos domínios da biologia molecular e da engenharia gené- tica.

ANTECEDENTES

[0002] Técnicas de engenharia genética para introduzir modifica- ções direcionadas em um genoma da célula hospedeira encontrar uso em uma variedade de campos. Fundamentalmente, a determinação de como o genótipo influencia o fenótipo depende da capacidade de in- troduzir inserções ou deleções direcionadas para prejudicar ou abolir a função do gene nativo. No campo da biologia sintética, a fabricação de micróbios geneticamente modificados capazes de produzir compostos ou proteínas ou interesse requer a inserção de sequências de DNA personalizadas em um cromossomo da célula hospedeira; produção em escala industrial geralmente requer a introdução de múltiplos ge- nes no genoma da célula hospedeira.

[0003] Para determinadas células hospedeiras, particularmente para células de levedura convencional (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), ferramentas genéticas estão bem desenvolvidas para rea- lizar deleções e integrações direcionadas do gene genômico. Uma va- riedade de células de levedura não convencionais são hospedeiras atraentes para aplicações industriais (por exemplo, produção de pe- quena molécula e proteína). No entanto, as ferramentas de engenharia para estas espécies são geralmente pobres. Por exemplo, o gênero Kluyveromyces, em particular, K. marxianus, é um hospedeiro de leve- dura atraente para a produção de produtos industriais e de anticorpos devido a seu rápido crescimento, alta tolerância ácida e alta tolerância de temperatura. No entanto, fazer alterações genômicas direcionadas a K. marxianustem sido historicamente demorado devido à alta taxa basal de ligação das extremidades não homólogas (NHEJ) e a dificul- dade de manter a estabilidade do plasmídeo. A interrupção baseada em CRISPR dos genes em K. marxianus foi relatada recentemente pela primeira vez, mas nenhum gene foi integrado e a interrupção foi baseada em NHEJ. Atualmente, nem integrações genômicas individu- ais, direcionada, mediada por meganuclease nem integrações multi- plexadas têm sido relatadas em K. marxianus. Tais integrações redu- ziriam drasticamente o tempo do ciclo de engenharia genética em pelo menos 50%.

[0004] Seria particularmente desejável usar células de levedura não convencionais para a produção de anticorpos. Atualmente, anti- corpos monoclonais para fins terapêuticos são feitos no ovário de hamster chinês (CHO) ou outras linhagens celulares de mamíferos. Depois de décadas de linhagem celular e desenvolvimento de proces- sos, produtividades de até 0,5 g/L/dia durante 12 dias foram alcança- das. O tempo necessário desde a identificação da construção do DNA até o preenchimento do novo medicamento experimental (IND) para produção em pequena escala) é de cerca de 15 meses. Ver o site da Genentech. Além disso, após décadas de melhoria, a produtividade da linhagem celular de CHO é improvável que seja melhorada significati- vamente, e é esperado o aumento da procura por anticorpos monoclo- nais, assim como terapias para condições mais comuns e crônicas (por exemplo, doença de Alzheimer) são introduzidas. Assim, há dois problemas com células CHO - uma longa linha do tempo para a produ- ção de um novo anticorpo, e capacidade insuficiente para suprir as ne- cessidades futuras. Até à data, anticorpos monoclonais de comprimen- to completo com glicosilação adequada têm sido produzidos por uma levedura Pichia pastoris modificada (por exemplo, Glycofi, adquirida pela Merck).

[0005] Para resolver estes problemas, atualmente, métodos co- nhecidos para modificação genômica para várias células hospedeiras de Kluyveromyces necessitam melhoria. A presente invenção atende a essa e outras necessidades.

SUMÁRIO

[0006] A presente invenção fornece métodos para modificar um local alvo em um genoma da célula hospedeira de Kluyveromyces. Os métodos compreendem colocar uma célula hospedeira de Kluyve- romyces, que tem uma redução da atividade das ligação das extremi- dades não homólogas (NHEJ), em contato com um ácido nucleico co- dificando uma nuclease capaz de clivar o local alvo; e uma molécula de DNA doador capaz de recombinação homóloga no local alvo cliva- do, através da qual a recombinação homóloga na célula hospedeira resulta em integração do ácido nucleico linear doador no local alvo. Uma célula hospedeira transformada em que a molécula de DNA doa- dora é integrada ao local alvo é então selecionado.

[0007] Em algumas modalidades, a nuclease é uma endonuclease de DNA guiada pelo RNA e o método inclui ainda introduzir na célula um RNA guia capaz de guiar a endonucleases guiada pelo RNA para o local alvo. O RNA guia pode ser em um plasmídeo contendo o elemen- to de estabilidade derivado de K. marxianus. À endonuclease do DNA guiada pelo RNA pode ser uma endonuclease Cas9. O ácido nucleico codificando a nuclease pode ser pré-integrado no genoma.

[0008] Em algumas modalidades, a etapa de introdução de um RNA guia para dentro da célula pode ser realizada ao colocar a célula hospedeira em contato com um ácido nucleico linear compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o RNA guia ou RNA guia em si. Nessas modalidades, o ácido nucleico que codifica o RNA guia é colocada entre um promotor e um terminador, e o RNA guia é, transi-

toriamente, expresso a partir do ácido nucleico linear na célula hospe- deira. O ácido nucleico linear pode incluir oligonucleotídeos tracr»RNA e crRNA temperados.

[0009] Em algumas modalidades, os métodos da invenção com- preendem ainda colocar a célula em contato com um ácido nucleico linear capaz de recombinação homóloga com ele mesmo ou com um ou mais ácidos nucleicos lineares adicionais em contato com a célula hospedeira, que na recombinação homóloga na célula hospedeira re- sulta na formação de um ácido nucleico circular extracromossômico compreendendo uma sequência de codificação para um marcador se- lecionável. O ácido nucleico circular extracromossômico pode ainda compreender um elemento de estabilidade derivado de K. marxianus. O elemento de estabilidade pode compreender uma sequência de cen- trômero (CEN) pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2 e uma se- quência de consenso da sequência de replicação autônoma (ARS) pe- lo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em outras modalidades, o elemento de estabilidade é pelo menos 90% idêntico a uma sequência menos de 750 bp de comprimento e compreendendo 202 a 876 resí- duos da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o elemento de estabi- lidade é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 1.

[0010] O ácido nucleico circular extracromossômico pode incluir ainda uma sequência de codificação para um RNA guia capaz de guiar a nuclease para o local alvo. Nessas modalidades, o ácido nucleico extracromossômico circular pode ainda compreender uma sequência que codifica uma atividade de crRNA e uma atividade de tracr»RNA. À atividade de crRNA e a atividade de tracr»RNA podem ser expressadas como uma única molécula de RNA contígua.

[0011] Em algumas modalidades da invenção, a nuclease é um meganuclease, por exemplo, F-Cphl.

[0012] O ácido nucleico doador usado nos métodos da invenção pode incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipep- tídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser uma cadeia leve de anti- corpos, uma cadeia pesada de anticorpos ou uma cadeia leve de anti- corpos ligados a uma cadeia pesada de anticorpos. Em algumas mo- dalidades, os métodos compreendem colocar a célula hospedeira em contato com dois ácidos nucleicos doadores, um primeiro ácido nuclei- co doador codificando uma cadeia leve de anticorpos e um segundo ácido nucleico doador codificando uma cadeia pesada de anticorpos. Os métodos podem incluir ainda a recuperação da célula hospedeira de Kluyveromyces que secreta um anticorpo de comprimento completo formado a partir da cadeia pesada de anticorpos e da cadeia leve de anticorpos. A célula hospedeira recuperada pode ser capaz de secre- tar pelo menos 19 microgramas por mililitro do anticorpo de compri- mento completo.

[0013] Nos métodos da invenção, o ácido nucleico doador pode ser otimizado por códon de acordo com os códons preferenciais de Kluyveromyces. A célula hospedeira de Kluyveromyces pode ser uma célula hospedeira de K. marxianus.

[0014] Em algumas modalidades, a NHEJ é reduzida por integra- ção do ácido nucleico codificando a nuclease nos locais YKU7O ou YKUB80.

[0015] A invenção fornece ainda célula hospedeira de Kluyve- romyces feita pelo método da invenção.

[0016] A invenção fornece métodos adicionais de produzir e secre- tar um anticorpo através da cultura de uma célula hospedeira de Kluy- veromyces da invenção em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono para um primeiro período de tempo, separando a célula hos- pedeira de Kluyveromyces do meio de cultura; adicionando um meio de cultura contendo uma fonte de carbono para a célula hospedeira de Kluyveromyces separada e cultivando a célula hospedeira de Kluyve-

romyces separada no meio de cultura por um segundo período de tempo. Nestes métodos, o anticorpo pode ser um anticorpo de com- primento completo. O primeiro período de tempo pode ser de pelo me- nos 3 dias. Em algumas modalidades, o meio de cultura adicionado é um meio de cultura fresco que não contêm anticorpos.

[0017] Apesar disso, as células CHO são a opção atual de hospe- deiro para produção de anticorpos monoclionais, as principais limita- ções são que leva um longo tempo para a produção de um novo anti- corpo em células CHO principalmente devido ao longo tempo de ciclo de engenharia (cerca de 3 meses) e seu longo tempo de duplicação (cerca de 19-24 horas). Kluyveromyces marxianus é um hospedeiro industrial emergente com potencial para uma ampla variedade de apli- cações. K. marxianus também pode ser o eucariote que cresce mais rápido do planeta, capaz de dobrar em apenas 52 minutos (Gombert et al. 2016) e isso torna K. marxianus um hospedeiro atraente para pro- dução de anticorpos monoclionais devido à sua rápida taxa de cresci- mento e menos tempo que leva para modificar a cepa (tempo de ciclo de engenharia genética de cerca de 2 semanas).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] Figuras 1A e 1B: A análise de Western blot da secreção de Herceptin e Rituxan na cepa de K. marxianus NRRL-7571 em condi- ções de não redução (A) ou redução (B) em glicose a 4%, quer a partir da fonte de xarope de cana-de-açúcar ou quando a glicose pura é usada. Amostras no gel de condição de redução foram tratadas com Endo Hf antes de as amostras serem carregados no gel de proteína.

[0019] Figuras 2A-2C: A análise de Western blot da secreção de Herceptin e Rituxan na cepa de K. marxianus NRRL-7571 em condi- ções de não redução (FIG. 2A), não redução com tratamento com En- do Hf (FIG. 2B) e redução com o tratamento com Endo Hf (FIG. 2C), usando glicose a 4% de fonte de xarope de cana em um processo pa-

drão (72 h) ou um processo de reciclagem celular (conforme descrito aqui).

[0020] Figura 3: A titulação de anticorpos aumenta com a cópia de Herceptin integrado no genoma de K. marxianus. Y366, cepa de K. marxianus do tipo selvagem. Y487 (barra branca), uma cópia de Her- ceptin integrado ao local PRB1. Y486km (barra cinza claro), uma cópia de Herceptin integrado ao local yku80. Y631 (barra cinza escuro), duas cópias de Herceptin integrado ao YKU80 e PEP4. Y629 (barra preta), três cópias de Herceptin integrado ao YKU80, PEP4 e PRB1. Barras de erro = +1 o erro padrão. N=8.

[0021] Figura 4: Análise por espectrometria de massa do padrão de glicosilação do produto produzido pelo Herceptin produtor da cepa Y629.

[0022] Figuras 5A e 5B: Medição da secreção de Herceptin em um biorreator usando análise de Western blot em condições de não redu- ção (FIG. 5A) e de redução (FIG. 5B). O experimento de fermentação do biorreator foi executado por sete dias, e as amostras foram retira- das a cada dia e armazenadas antes da análise. Todas as amostras foram diluídas 1:10 antes do processamento, a fim de evitar a sobre- carga de géis de proteína. Para as amostras tratadas com Endo Hf, a diluição é de 1:20 devido ao procedimento de tratamento com EndoH (ver materiais e métodos). Definições

[0023] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, a menos que o contexto determine claramente o contrário.

[0024] O termo "ácido nucleico" ou "nucleotídeo" refere-se aos áci- dos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polí- meros dos mesmo em qualquer forma de fita simples ou dupla fita. À menos que indicado de outra maneira, uma determinada sequência de ácido nucleico também abrange implicitamente variantes modificadas de forma conservadora (por exemplo, substituições de códon degene- rado), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, substitui- ções de códon degenerados podem ser alcançadas através de gera- ção de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos misturados de ba- se e/ou de desoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rosso- lini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[0025] O termo "gene" pode se referir ao segmento de DNA envol- vido na produção ou codificação de uma cadeia polipeptídica. Isso po- de incluir regiões anteriores e posteriores a região codificadora (líder e reboque), bem como as sequências de intervenção (íntrons) entre os segmentos de codificação individuais (éxons). Alternativamente, o ter- mo "gene" pode se referir ao segmento de DNA envolvido na produção ou na codificação de um RNA não traduzido, como um rRNA, tRNA, RNA guia ou micro RNA.

[0026] Um "promotor" é definido como uma ou mais sequência de controle de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nu- cleico. Como usado aqui, um promotor inclui sequências de ácidos nu- cleicos necessárias perto do local de início da transcrição. Um promo- tor também inclui opcionalmente potencializador distal ou elementos repressores, que podem ser localizados tanto como vários milhares de pares de base do local de início da transcrição.

[0027] Como usado aqui, o termo "sem marcador" refere-se à inte- gração de um DNA doador em um local alvo dentro de um genoma da célula hospedeira sem integração de acompanhamento de um marca- dor selecionável. Em algumas modalidades, o termo também se refere à recuperação de uma célula hospedeira sem usar um esquema de seleção que se baseia na integração de marcador selecionável no ge- noma da célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades, um marcador de seleção que é epissomal ou extracromassomal pode ser usado para selecionar células compreendendo um plasmídeo con- tendo um gRNA. Tal uso é considerado sem marcador, enquanto o marcador selecionável não é integrado no genoma da célula hospedei- ra.

[0028] Como usado aqui, o termo "ligada de maneira funcional" refere-se a uma ligação funcional entre as sequências de ácidos nu- cleicos de modo que as sequências codifiquem uma função desejada. Por exemplo, uma sequência de codificação para um gene de interes- se, como, por exemplo, um marcador selecionável, é uma ligação ope- rável com seu promotor e/ou sequências regulatórias ligadas quando a promotora e/ou região regulatória ligada funcionalmente controla a ex- pressão da sequência de codificação. Também se refere à ligação en- tre as sequências de codificação que podem ser controladas pelo mesmo promotor ligado e/ou região regulatória; tal ligação entre as sequências de codificação pode também ser referida como sendo liga- da na estrutura ou na mesma estrutura de codificação. "Ligada de ma- neira funcional" também se refere a uma ligação de sequências funci- onais, mas não codificantes, como a propagação de uma sequência autônoma ou de origem de replicação. Essas sequências são operaci- onalmente ligadas quando elas são capazes de executar suas funções normais, como, por exemplo, permitindo que a replicação, propagação e/ou segregação de um vetor tendo a sequência em uma célula hos- pedeira.

[0029] Como usado aqui, o termo "transformação" refere-se a uma alteração genética de uma célula hospedeira resultante da introdução de material genético exógeno na célula hospedeira.

[0030] Como usado aqui, o termo "selecionando uma célula hos- pedeira expressando um marcador selecionável" também engloba o enriquecimento para células hospedeiras expressando um marcador selecionável a partir de uma população de células transformadas.

[0031] Como usado aqui, o termo "marcador selecionável" refere- se a um gene que funciona como uma orientação para a seleção de uma célula hospedeira com um marcador, por exemplo, um marcador expressado por um ácido nucleico circular, extracromossômico, na cé- lula hospedeira, como descrito aqui. Os marcadores selecionáveis po- dem incluir, mas não estão limitados a: marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes e marcadores selecionáveis de fármaco, e similares. Os marcadores fluorescentes podem incluir, mas não estão limitados a, genes que codificam as proteínas fluorescentes como a proteína verde fluorescente (GFP), proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente vermelha (dAsRFP) e similares. Os marcadores luminescentes podem incluir, mas não estão limitados a, genes que codificam proteínas luminescentes como luciferases. Marcadores selecionáveis de fármacos adequados para uso com os métodos e as composições fornecidas aqui incluem, mas não estão limitados a, genes de resistência a antibióticos, como ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, te- traciclina, cloranfenicol e neomicina. Em algumas modalidades, a sele- ção pode ser seleção positiva; isto é, as células expressando o marca- dor são isoladas a partir de uma população, como, por exemplo, para criar uma população enriquecida de células compreendendo o marca- dor selecionável. Em outros casos, a seleção pode ser negativa, ou seja, a população está isolada, longe das células, por exemplo, para criar uma população enriquecida de células que não compreendem o marcador selecionável. A separação pode ser por qualquer técnica de separação conveniente, adequada para o marcador selecionável. Por exemplo, se um marcador fluorescente é usado, as células podem ser separadas por seleção de células ativadas por fluorescência, enquanto que se um marcador de superfície celular foi inserido, as células po- dem ser separadas da população heterogênea por técnicas de sepa- ração por afinidade, por exemplo, separação magnética, cromatografia de afinidade, "panning" com um reagente de afinidade acoplado a uma matriz sólida, ou outra técnica conveniente.

[0032] "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alterna- damente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoáci- dos. Como usados aqui, os termos englobam cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento comple- to, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações de peptídeo covalentes.

[0033] Como usado aqui, o termo "complementar" ou "complemen- taridade" refere-se a emparelhamento de base específico entre nucleo- tídeos ou ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, por exemplo, e não como sendo limitando a, emparelhamento de bases entre um RNA guia (gRNA) e um local alvo ou região no genoma de uma célula hos- pedeira é descrito. Nucleotídeos complementares são, geralmente, A e T(ouAeU) eGeC.Os gRNAs descritos aqui podem compreender sequências, por exemplo, uma sequência de direcionamento de DNA que é perfeitamente complementar ou substancialmente complementar (por exemplo, tendo de 1 a 4 disparidades) para uma sequência ge- nômica em uma célula hospedeira.

[0034] O sistema "CRISPR/Cas" refere-se a uma ampla classe de sistemas bacterianos para a defesa contra o ácido nucleico estranho. Os sistemas CRISPR/Cas são encontrados em uma ampla gama de organismos eubacterianos e arqueais. Os sistemas CRISPR/Cas in- cluem tipo |, Il, e subtipos Ill. Os sistemas CRISPR/Cas do tipo selva- gem || usam uma endonuclease de DNA guiado por RNA, Cas9, no complexo com um gRNA para reconhecer e clivar o ácido nucleico es- tranho.

[0035] Como usado aqui, os termos "clivar", "clivando" e/ou "cliva- gem" em relação a endonuclease homing, nuclease dedo de zinco, nuclease efetora TAL ou uma endonuclease guiada por RNA, por exemplo, Cas9, refere-se ao ato de criar uma ruptura em um ácido nu- cleico específico. A ruptura pode deixar uma extremidade cega ou ex- tremidade pegajosa (ou seja, saliência 5' ou 3'), como compreendido por aqueles versados na técnica. Os termos também abrangem que- bras de DNA de fita simples ("nicks") e quebras de DNA de fita dupla.

[0036] Como usado aqui, o termo "Cas9" refere-se a uma nuclease guiada pelo RNA (por exemplo, de origem bacteriana ou arqueal, ou derivados dos mesmos). As nucleases guiadas pelo RNA incluem as Cas9 proteínas e homólogos das mesmas supracitadas, e incluem, mas não estão limitados a, Cpf1 (ver, por exemplo, Zetsche et al., Cell, volume 163, publicação 3, p.759-771, 22 de outubro de 2015).

[0037] Os homólogos de Cas9 são encontrados em uma ampla variedade de eubactérias, incluindo, mas não limitado às bactérias dos seguintes grupos taxonômicos: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroide- tes-Chlorobi, Chlamydiae-Verrucomicrobia, Chliroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes e Thermotogae. Uma proteí- na Cas9 exemplar é a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes. Prote- íÍnas Cas9 adicionais e seu homólogos são descritos em, por exemplo, Chylinksi et al., RNA Biol. 2013 maio 1; 10(5): 726—-737; Nat. Rev. Micro- biol. 2011 junho; 9(6): 467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2013 Set 24;110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 maio 9;497 (7448): 254-7; e Jinek, et al., Science. 2012 agosto 17;337 (6096):816-21. Variantes de qualquer das nucleases Cas9 fornecidas aqui podem ser otimizadas para uma atividade eficiente ou maior es- tabilidade na célula hospedeira. Assim, as nucleases Cas9 modifica-

das, por exemplo, nucleases Cas9 otimizadas por códon para expres- são em Kluyveromyces também são contempladas.

[0038] Como usado aqui, as frases "introdução" ou "colocar em contato" no contexto da introdução de um ácido nucleico ou uma prote- Ína em uma célula hospedeira refere-se a qualquer processo que re- sulta na presença de um ácido nucleico heterólogo ou polipeptídeo dentro da célula hospedeira. Por exemplo, os termos incluem a intro- dução de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo ou um ácido nucleico linear) que codifica o ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma molécula de RNA) ou polipeptídeo de interesse e resulta na transcrição das moléculas de RNA e tradução dos polipeptí- deos. Os termos também englobam a integração do ácido nucleico co- dificando as moléculas de RNA ou polipeptídeos no genoma de uma célula progenitora. O ácido nucleico é então passado através de gera- ções subsequentes à célula hospedeira, para que, por exemplo, um ácido nucleico codificando uma endonuclease guiada pelo RNA seja "pré-integrado" no genoma da célula hospedeira. Em alguns casos, introdução refere-se à translocação de um ácido nucleico ou polipeptí- deo de fora da célula hospedeira para o interior da célula hospedeira. Vários métodos de introdução de ácidos nucleicos, polipeptídeos e ou- tras biomoléculas em células hospedeiras são contemplados, incluin- do, mas não limitado a, à eletroporação, contato com nanofios ou na- notubos, esferoplastos, transformação mediada por PEG 1000, biolís- ticos, transformação de acetato de lítio, transformação de cloreto de lítio e similares.

[0039] Como usado aqui, a frase "heterólogo" refere-se ao que não é normalmente encontrado na natureza. O termo "sequência de nucle- otídeos heteróloga" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que normalmente não se encontra em uma determinada célula da nature- za. Como tal, uma sequência de nucleotídeos heteróloga pode ser: (a)

estranha a sua célula hospedeira (ou seja, é exógena à célula); (b) na- turalmente encontrada na célula hospedeira (ou seja, endógena), mas presente em uma quantidade não natural na célula (ou seja, maior ou menor quantidade do que naturalmente encontrada na célula hospe- deira); ou (c) ser encontrada naturalmente na célula hospedeira, mas posicionada fora do seu local natural.

[0040] Como usado aqui, o termo "recombinação homóloga" refe- re-se a um processo celular em que as sequências de nucleotídeos são trocadas entre duas moléculas suficientemente idênticas de DNA. Duas moléculas de DNA têm identidade de sequência "suficiente", se as duas sequências tiverem pelo menos 70%, pelo menos 75%>, pelo menos 80%>, pelo menos 85%>, pelo menos 90%>, pelo menos 95%>, pelo menos 99%>, ou 100%, de identidade de entre regiões de recombinação, ao longo de um comprimento de, por exemplo, pelo menos 15 pares de base, pelo menos 20 pares de base, pelo menos 50 pares de base, pelo menos 100 pares de base, pelo menos 250 pa- res de base, pelo menos 500 pares de base, ou seja, mais de 500 pa- res de base. Os versados na técnica compreenderão facilmente como determinar a identidade de dois ácidos nucleicos. Por exemplo, a iden- tidade pode ser calculada depois de alinhar as duas sequências, de modo que a identidade esteja em seu nível mais alto. Uma outra ma- neira de calcular a identidade pode ser realizada por algoritmos publi- cados. Por exemplo, o alinhamento ideal de sequências para compa- ração pode ser feito usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970). Para uma discussão de comprimentos efica- zes de homologia de entre regiões de recombinação, consulte Hasty et al. (Mol. Cell Biol. 11:5586-91 (1991)).

[0041] Como usado aqui, o termo "ligação das extremidades não homólogas" ou NHEJ refere-se a um processo celular em que extremi- dades cortadas ou entalhadas de uma fita de DNA estão diretamente ligadas sem a necessidade de um ácido nucleico modelo homólogo. NHEJ pode levar à adição, deleção, substituição, ou uma combinação dos mesmos, de um ou mais nucleotídeos no local de reparação.

[0042] Como usado aqui, o termo reparação dirigida a homologia (HDR) refere-se a um processo celular em que as extremidades corta- das ou entalhadas de uma fita de DNA são reparadas por polimeriza- ção do ácido nucleico modelo homólogo, por exemplo, uma molécula de DNA doador. Assim, a sequência original é substituída com a se- quência do modelo. O ácido nucleico de modelo homólogo pode ser fornecido por sequências homólogas em outras partes do genoma (cromátides irmãs, cromossomos homólogos, ou regiões repetidas no mesmo ou em diferentes cromossomos). Alternativamente, um ácido nucleico modelo exógeno, por exemplo, uma molécula de DNA doa- dor, pode ser introduzido para obter uma determinada mudança indu- zida por HDR da sequência no local alvo. Desta forma, sequências es- pecíficas podem ser introduzidas no local do corte.

[0043] Como usado aqui, o termo "anticorpo" significa um agente de ligação isolado ou recombinante que compreende as sequências de região variável necessárias para se ligar especificamente a um epítopo antigênico. Portanto, um anticorpo é qualquer forma de anticorpo ou fragmento do mesmo que exibe a atividade biológica desejada, por exemplo, ligando o antígeno-alvo específico. Assim, é usado em senti- do amplo e abrange especificamente um anticorpo monoclonal (inclu- indo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos humanos, anticorpos quiméricos, nanocorpos, diacorpos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, incluindo, mas não limitado a ScFv, Fab, e similares, desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

[0044] Como usado aqui, o termo "anticorpo de comprimento com- pleto" inclui quatro polipeptídeos - duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas por pontes dissulfeto para formar uma molécula em forma de "Y". Cada cadeia pesada inclui uma região constante e uma região variável ligadas por uma região de dobradiça. As duas regiões constantes das duas cadeias pesadas formam um domínio de Fc. Um anticorpo de comprimento completo pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), que é definido pela cadeia pesada do anticorpo.

[0045] Como usado aqui, o termo anticorpo de comprimento com- pleto refere-se a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo. Um anticorpo de comprimento completo inclui dois polipeptídeos idênticos de cadeia pesada, dois polipeptídeos idênticos de cadeia leve, ligações dissulfeto conectando os dois polipeptídeos de cadeia leve, e um padrão de gli- cosilação. Cada cadeia pesada inclui uma região constante (por exemplo, CH1, CH2 e CH3) e uma região variável (por exemplo VH) ligadas por uma região de dobradiça. As duas regiões constantes das duas cadeias pesadas formam um domínio de Fc (por exemplo, Fc). Cada cadeia leve inclui uma região constante (por exemplo, CL) e uma região variável (p.ex., VL). Um fragmento de ligação ao antígeno (Fab) é uma região no anticorpo que se liga aos antígenos. Ele é composto de um domínio constante e um domínio variável de cada cadeia pesa- da e leve (por exemplo, VH, CH1, VL e CL). Um fragmento variável (Fv) refere-se a um fragmento contendo uma região variável de uma cadeia pesada e uma região variável de uma cadeia leve (por exem- plo, VH e VL). Além disso, duas regiões constantes das duas cadeias pesadas formam o domínio FC do anticorpo (por exemplo, CH2 e CH3 de cada uma das duas cadeias pesadas). Um anticorpo de compri- mento completo pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, 1gD, IgE, IgG e IgM), que é definido pela cadeia pesada do anticorpo.

[0046] Como usado aqui, o termo "elemento de estabilidade" refe-

re-se a uma sequência de ácido nucleico entre cerca de 200 e cerca de 1300 bp, geralmente entre cerca de 400 e cerca de 900 bp, e, mui- tas vezes, entre cerca de 600 e cerca de 750 pb, compreendendo uma sequência consenso da sequência de replicação autônoma (ARS) e, opcionalmente, uma sequência de centrômeros (CEN). Um elemento de estabilidade permite que uma molécula de DNA extracromossômico (linear ou circular) compreendendo o elemento de estabilidade perma- neça estável em uma célula hospedeira por longos períodos de cultura em meios não seletivos. Os elementos de estabilidade da invenção geralmente fornecem estabilidade da molécula de DNA extracromos- sômico por, pelo menos, cerca de 10 gerações, geralmente cerca de 20, e muitas vezes cerca de 30 ou mais gerações em meios não sele- tivos.

[0047] As sequências de ARS e de CEN têm sido bem estudadas em levedura. ARSs são origens de replicação do DNA em cromosso- mos de levedura e são tipicamente sequências de DNA modular curtas compreendendo um elemento de sequência de núcleo de 11-17 bp chamado de sequência consenso ARS (ACS), bem como as sequên- cias de flanqueamento. As sequências de CEN são parte das estrutu- ras complexas nos cromossomos para os quais as fibras do fuso se fixam durante a meiose e mitose. Essas sequências são tipicamente entre cerca de 100 e cerca de 200 pb e podem ser subdivididas em três elementos de DNA conservados CDEI, CDEII e CDEIII. Sequên- cias de CEN exemplares da invenção incluem as SEQ ID NOs: 2, 5,8, 11, 14, 17, 20 e 23. Sequências de consenso ARS exemplares da in- venção incluem as SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24.

[0048] Elementos de estabilidade exemplares da invenção incluem as SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 e 22. Também são incluídas subsequências destas sequências que compreendem a sequência consenso ARS, opcionalmente, uma sequência de CEN, e qualquer sequências de intervenção. Elementos de estabilidade exemplar deste tipo incluem os resíduos 202-876 ou resíduos 537-1252 da SEQ ID NO: 1 e resíduos 1 a 566 ou resíduos 348 a 1043 da SEQ ID NO: 4.

[0049] Um versado irá reconhecer que as sequências exemplifica- das acima podem ser modificadas e ainda fornecer estabilidade para moléculas de DNA extracromossômico. Por exemplo, as sequências de CEN, sequências consenso ARS, ou elementos de estabilidade tendo, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para as sequências exemplificadoras são contempladas pela invenção. Os versados na técnica compreenderão facilmente como determinar a identidade de dois ácidos nucleicos. Por exemplo, a identidade pode ser calculada depois de alinhar as duas sequências, de modo que a identidade este- ja em seu nível mais alto. Uma outra maneira de calcular a identidade pode ser realizada por algoritmos publicados. Por exemplo, o alinha- mento ideal de sequências para comparação pode ser feito usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970). Descrição detalhada das modalidades

[0050] A presente invenção fornece métodos para modificar um ou mais locais alvo em um genoma da célula hospedeira de Kluyve- romyces. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é usada para produzir e secretar anticorpos de comprimento completo. Reparação da lacuna

[0051] Nos métodos da invenção, a modificação dos locais alvo podem compreender métodos que usam sistemas CRISPR/CAS e montagem in vivo de marcador e/ou vetores gRNA através de repara- ção da lacuna, como descrito em WO2015/095804, que é aqui incor- porado por referência.

[0052] Nesses métodos, a célula hospedeira de Kluyveromyces, que tem atividade de ligação das extremidades não homólogas (NHEJ)

reduzida está em contato com um ácido nucleico linear capaz de re- combinação homóloga com ele mesmo ou com um ou mais ácidos nu- cleicos lineares adicionais em contato com a célula hospedeira, que na recombinação homóloga na célula hospedeira resulta na formação de um ácido nucleico circular extracromossômico compreendendo uma sequência de codificação para um marcador selecionável e/ou um gRNA. O ácido nucleico circular extracromossômico normalmente irá incluir o elemento de estabilidade derivado de Kluyveromyces, particu- larmente como descrito em mais detalhes abaixo.

[0053] A célula também compreende uma nuclease capaz de clivar OS locais alvo e uma molécula doadora. Os locais alvo podem ser qualquer local desejado no genoma hospedeiro. Por exemplo, locais alvo podem ser posicionados dentro de genes que codificam as pro- teases que degradam os produtos de polipeptídeo feitos pela célula hospedeira ou genes que codificam as glicosiltransferases que adicio- nam carboidratos indesejados a um produto de polipeptídeo expressa- do. Direcionando tais genes, atividade de protease e/ou atividade de glicosiltransferase indesejadas podem ser reduzidas ou eliminadas.

[0054] As moléculas de DNA doador são flanqueadas por sequên- cias de nucleotídeos que são homólogos às sequências genômicas flanqueando o local alvo. Em algumas modalidades, a molécula de DNA doador compreende uma sequência homóloga no terminal 5', que é de cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% homóloga a uma região 5' de um local alvo genômico selecionado. Em algumas modalidades, a molécula de DNA doador compreende uma sequência homóloga no terminal 3', que é de cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% homóloga a uma região 3' de um local alvo genô- mico selecionado. Em alguns casos, cada uma das sequências homó- logas flanqueando a molécula de DNA doador compreende cerca de 50 a cerca de 1500 nucleotídeos.

[0055] A molécula de DNA doador pode compreender qualquer ácido nucleico de interesse. Por exemplo, a molécula de DNA doador pode compreender um gene de interesse, que pode ser inativado em um genoma hospedeiro. Em outras modalidades, a molécula de DNA doador funciona como uma construção nocaute que é capaz de inter- romper especificamente um gene alvo sob integração de construir no local alvo do genoma da célula hospedeira, tornando o gene interrom- pido não funcional. Exemplos de ácidos nucleicos de interesse inclu- em, mas não estão limitados a, uma sequência de codificação do poli- peptídeo, um promotor, um potencializador, terminador, ativador trans- cricional, repressor transcricional, ativador transcricional, repressor transcricional, local de ligação do ativador transcricional, íntron, éxon, cauda poli-A, vários locais de clonagem, sinal de localização nuclear, sinal de estabilização de mMRNA, locais de integração, sequência codi- ficadora do marcador de epítopo, sinal de degradação ou qualquer ou- tra molécula de DNA natural ou sintética. Em modalidades específicas, o ácido nucleico de interesse não compreende um ácido nucleico codi- ficando um marcador selecionável.

[0056] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma cadeia leve de anticorpos, uma cadeia pesada de anticorpos ou uma cadeia leve de anticorpos ligados a uma cadeia pesada de anticorpos. Em algu- mas modalidades, uma primeira molécula de DNA doador compreen- dendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma ca- deia leve de anticorpos e uma segunda molécula de DNA doador compreendendo uma segunda sequência de ácido nucleico codifican- do uma cadeia pesada de anticorpos pode ser usada. Ambas as molé- culas de DNA doador são capazes de recombinação homóloga em um local alvo clivado, enquanto a recombinação homóloga na célula hos- pedeira resulta em integração de sequências de ácidos nucleicos codi- ficando cadeias leves e pesadas em dois diferentes locais alvo. Alter-

nativamente, a primeira e a segunda sequência de ácidos nucleicos podem estar presentes em uma única molécula de DNA doador e inte- gradas em um único local alvo. As células transformadas são identifi- cadas pela presença do marcador selecionável, sobre o ácido nucleico circular extracromossômico.

[0057] A atividade de NHEJ na célula hospedeira pode ser pertur- bada em várias maneiras. Normalmente, um local do gene que está envolvido em atividade da NHEJ da célula é interrompido. Por exem- plo, o local do gene YKU7O pode ser interrompido, de tal forma que a atividade da NHEJ é reduzida na célula. Em alguns casos, o local do gene YKU70 é interrompido pela inserção ou integração de um ácido nucleico codificando uma endonucleases guiada por RNA no local do gene YKU7O. A redução na atividade da NHEJ pode ser uma redução de, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou qualquer redução no percentual entre estas percentagens, compa- rado a uma célula de Kluyveromyces que não tenha uma interrupção no gene controlando NHEJ em uma célula.

[0058] Em algumas modalidades, a endonuclease de DNA guiada por RNA é fornecida através da introdução de um ácido nucleico codi- ficando as endonucleases na célula hospedeira. Por exemplo, um áci- do nucleico cromossômico extra (por ex., um plasmídeo ou vetor) compreendendo um elemento de estabilidade da invenção e um ácido nucleico codificando a endonuclease de DNA guiada por RNA pode ser introduzida na célula. Nessas modalidades, o ácido nucleico linear capaz de recombinação homóloga com ele mesmo ou com um ou mais ácidos nucleicos lineares adicionais pode incluir a sequência co- dificando a endonuclease guiada por RNA. A recombinação homóloga resulta na formação de um ácido nucleico circular extracromossômico, compreendendo a sequência de codificação da endonuclease guiada por RNA. Em algumas modalidades, o plasmídeo pode, ainda, com-

preender uma sequência de ácido nucleico de codificação de um mar- cador selecionável para manutenção do plasmídeo na célula hospedei- ra. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de codificação da en- donuclease inclui ainda uma sequência promotora.

[0059] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de codificação da endonuclease de DNA guiada por RNA é integrado no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, a endonuclease de DNA guiada por RNA, por exemplo, Cas9, está integrado no gene YKU70 da célula hospedeira de Kluyveromyces, reduzindo assim a atividade da NHEJ em células de levedura. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de codificação da endonuclease de DNA guiada por RNA está sob o controle do promotor constitutivo. Em algumas modalidades, a endonuclease de DNA guiada por RNA pode ser introduzida na célula hospedeira antes de, simultaneamente com, ou após a introdução do primeiro e do segundo ácido nucleico linear. Em outras modalidades, a endonuclease de DNA guiada por RNA pode ser introduzida na célula hospedeira antes de, simultaneamente com, ou após a introdução do primeiro ácido nucleico linear, o segundo ácido nucleico linear e a mo- lécula de DNA doador.

[0060] Em algumas modalidades, o ácido nucleico linear capaz de recombinação homóloga com ele mesmo ou com um ou mais ácido nucleico linear compreende duas sequências homólogas internas que são capazes de recombinação homóloga uns com os outros, em que a recombinação homóloga de sequências homólogas internas resulta na formação de ácido nucleico circular extracromossômico, compreen- dendo um elemento de estabilidade da invenção e expressando um marcador selecionável. Uma vez circularizado, o ácido nucleico extra- cromossômico inclui uma sequência de codificação para um marcador selecionável e sequências reguladoras adequadas, como um promotor e/ou de um terminal que permite a expressão do marcador na célula hospedeira. Fornecendo o marcador selecionável em um ácido nuclei- co extracromossômico circular, permite a integração sem marcador de uma ou mais moléculas de DNA doador em um genoma da célula hospedeira, evitando a integração de sequências estranhas (ou seja, um marcador selecionável) no genoma e quaisquer efeitos deletérios associados com a expressão do marcador prolongada.

[0061] Em algumas modalidades, os métodos da invenção propor- cionam recuperação sem marcador de uma célula hospedeira trans- formada compreendendo um ácido nucleico doador integrado com su- cesso. Tal célula ocorre dentro de uma frequência de cerca de uma a cada 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ou 100 células hospedeiras contactadas, ou suas populações clonais, triadas. Em modalidades específicas, a recuperação sem marcador de uma célula hospedeira transformada compreendendo um ácido nucleico doador integrado com sucesso ocorre dentro de uma frequência de cerca de uma a cada 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou células do hospedeiro contactadas, ou suas populações clonais, triadas. Em modalidades mais específicas, a recuperação sem marcador de uma célula trans- formada compreendendo um ácido nucleico doador integrado com su- cesso ocorre dentro de uma frequência de cerca de uma a cada 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células hospedeiras contactadas ou suas populações clonais, triadas.

[0062] Uma variedade de métodos está disponível para identificar as células com um genoma alterado em ou perto do local alvo, sem o uso de um marcador selecionável. Em algumas modalidades, tais mé- todos procuram detectar qualquer mudança no local alvo, e incluem, mas não estão limitados a métodos de PCR, métodos de sequencia- mento, digestão de nuclease, por exemplo, restrição de mapeamento, Southern blot, e qualquer combinação destes. Leituras fenotípicas, por exemplo, uma previsão de ganho ou perda de função, também podem ser usadas como um proxy para a realização das modificações genô- mica pretendidas.

[0063] Em outras modalidades, o ácido nucleico linear compreen- dendo um marcador selecionável é capaz de recombinação com um segundo ácido nucleico linear, por exemplo, de codificação de um ou mais gRNAs. Após a introdução do primeiro e do segundo ácidos nu- cleicos linear, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos lineares sofrem recombinação homóloga para formar um ácido nucleico circular, epis- somal ou extracromossômico, compreendendo a sequência de codifi- cação para o marcador selecionável e a um ou mais gRNAs.

[0064] Posteriormente à formação do ácido nucleico extracromos- sômico compreendendo a sequência de codificação para o marcador selecionável e o gRNA, o gRNA é transcrito a partir do ácido nucleico extracromossômico e guia a endonucleases de DNA guiada por RNA expressado na célula hospedeira para um local alvo no genoma da célula hospedeira, onde as endonucleases criam uma ruptura no local alvo.

[0065] Os métodos da invenção podem ser usados para integrar uma pluralidade (ou seja, duas ou mais) de moléculas de DNA doador em uma pluralidade de locais alvo do genoma da célula hospedeira. Assim, a célula hospedeira de Kluyveromyces é colocada em contato com um primeiro ácido nucleico linear e duas ou mais moléculas de um segundo ácido nucleico, em que cada molécula de um segundo ácido nucleico linear compreende um ácido nucleico codificando um gRNA que direciona um local diferente no genoma da célula hospedei- ra. Cada segundo ácido nucleico linear pode recombinar com o primei- ro ácido nucleico linear para formar dois ou mais diferentes ácidos nu- cleicos circular extracromossômico na célula hospedeira. Entende-se que o termo "primeiro ácido nucleico linear" e "segundo ácido nucleico linear" inclui múltiplas cópias da mesma molécula de ácido nucleico.

Por exemplo, a célula hospedeira pode ser colocada em contato com duas ou mais moléculas de um segundo ácido nucleico linear, em que cada molécula de um segundo ácido nucleico linear compreende um ácido nucleico codificando um gRNA diferente para direcionar dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais locais diferentes no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, uma vez que o gRNA guia a endonuclease guiada pelo RNA para dois ou mais locais alvo, a endonuclease cria uma ruptura em dois ou mais locais alvo e duas ou mais moléculas de DNA doador estão integradas no genoma da célula hospedeira através de recombinação homóloga.

[0066] Em algumas modalidades, o ácido nucleico linear compre- endendo um marcador selecionável é um vetor com lacuna compreen- dendo um par de sequências flanqueadoras homólogas que se recom- binam com um par de sequências homólogas flanqueando o cassete de gRNA no segundo ácido nucleico linear para formar um grande ve- tor circular onde a lacuna tem sido reparada, inserindo o segundo áci- do nucleico linear no vetor com lacuna. Em algumas modalidades cada sequência flanqueadora homóloga do par de sequências flanqueado- ras homólogas no primeiro ácido nucleico contém uma região de re- combinação compreendendo uma sequência de nucleotídeos de com- primento suficiente e identidade de sequência que permite a recombi- nação homóloga com o par de sequências flanqueadoras homólogas no segundo ácido nucleico linear, mas não com outras regiões do pri- meiro ou do segundo ácido nucleico linear participando na montagem in vivo, nem com quaisquer regiões genômicas da célula hospedeira. Para a montagem vivo de vetores de marcador/gRNA através da repa- ração da lacuna e para seleção de células capazes de recombinação homóloga e reparação de lacuna, ver, por exemplo, Horwitz et al. (Cell Systems 1:88-96 (2015)) e WO2015/095804, ambos os quais são in- corporados aqui em sua totalidade por esta referência.

[0067] Em algumas modalidades, o gRNA é introduzido na célula em ácido nucleico circular extracromossômico (ou seja, um plasmídeo) que não é formado por recombinação homóloga de moléculas de áci- dos nucleicos lineares. Nessas modalidades, o plasmídeo compreende um elemento de estabilidade da invenção. Essas modalidades são usadas, por exemplo, quando a integração de uma única molécula de DNA doador é desejada.

[0068] Usando os métodos fornecidos aqui, um ou mais locais alvo em um genoma da célula hospedeira pode ser locais para integração de sequências de ácidos nucleicos codificando cadeias leves e pesa- das de anticorpos de comprimento completo com surpreendentemente alta eficiência em relação aos sistemas tradicionais CRISPR/Cas. À eficiência de alteração em uma população de células pode ser, pelo menos, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80%, ou superior, ou qualquer porcentagem entre estas percentagens.

[0069] Como usado em todo o documento, uma sequência de RNA guia (gRNA) é uma sequência que interage com uma endonuclease de DNA guiada por RNA e especificamente se liga ao ou se hibridiza ou a um ácido nucleico alvo dentro do genoma de uma célula, de tal forma que o gRNA e a nuclease alvo se colocalize ao ácido nucleico alvo no genoma da célula. Cada gRNA inclui uma sequência de DNA alvo de cerca de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, que se liga especifi- camente ou se hibridiza a uma sequência de DNA alvo no genoma. Por exemplo, a sequência de DNA alvo é cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nu- cleotídeos de comprimento. Cada gRNA contém uma sequência arca- bouço de gRNA que se liga a endonuclease de DNA guiada por RNA que não compreende a sequência alvo de DNA. Em algumas modali-

dades, o gRNA compreende uma sequência de crRNA e uma sequên- cia transativadora de crRNA (tracrºRNA). Em algumas modalidades, o gRNA não compreende uma sequência de tracrRNA.

[0070] Geralmente, a sequência alvo de DNA é projetada para complementar (por exemplo, complementar perfeitamente) ou com- plementar substancialmente a sequência de DNA alvo. Em alguns ca- sos, a sequência de DNA alvo pode incorporar bases de oscilação ou degeneradas para ligar vários elementos genéticos. Em alguns casos, os 19 nucleotídeos na extremidade 3' ou 5' da região de ligação são perfeitamente complementares para o elemento ou elementos genéti- cos alvo. Em alguns casos, a região de ligação pode ser alterada para aumentar a estabilidade. Por exemplo, os nucleotídeos não naturais podem ser incorporados para aumentar a resistência do RNA à degra- dação. Em alguns casos, a região de ligação pode ser alterada ou pro- jetada para evitar ou reduzir a formação de estrutura secundária na região de ligação. Em alguns casos, a região de ligação pode ser pro- jetada para otimizar o conteúdo G-C. Em alguns casos, o conteúdo G- C é de preferência entre cerca de 40% e cerca de 60% (por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%).

[0071] Qualquer endonuclease de DNA guiada por RNA pode ser usada nos métodos fornecidos aqui. Em algumas modalidades, a en- donuclease de DNA guiada por RNA é uma endonuclease Cas9 ativa que quando ligada a um ácido nucleico alvo como parte de um com- plexo com um gRNA, uma ruptura da fita dupla é introduzida no ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a ruptura da fita dupla é repa- rada pelo HDR para inserir uma molécula de DNA doador no genoma da célula hospedeira. Várias endonucleases Cas9 podem ser usadas nos métodos descritos aqui. Por exemplo, uma nuclease Cas9 que re- quer um motivo adjacente ao protoespaçador NGG (PAM) imediata- mente 3' da região alvo pelo gRNA pode ser usada. Como outro exemplo, as proteínas Cas9 com requisitos de motivos PAM ortogo- nais podem ser usadas para direcionar as sequências que não tenham uma sequência de PAM NGG adjacente. As proteínas Cas9 exempla- res com especificidades de sequência de PAM ortogonais incluem, mas não estão limitados a, as descritas em Esvelt et al. (Nature Me- thods 10: 1116-1121 (2013)).

[0072] Em alguns casos, a proteína Cas9 é uma nickase que quando ligada a um ácido nucleico alvo como parte de um complexo com um gRNA, uma ruptura ou entalhe da fita simples é introduzida no ácido nucleico alvo. Um par de nickases Cas9, cada uma ligada a um gRNA diferente, pode ser direcionado para dois locais proximais de uma região genômica alvo e, assim, introduzir um par de quebras de fita simples proximal na região genômica alvo. Pares de nickase po- dem fornecer maior especificidade porque seus efeitos fora do alvo são susceptíveis de resultar em entalhes simples, que geralmente são reparados sem lesão por mecanismos de reparação de excisão de ba- se. Nickases Cas9 exemplares incluem nucleases Cas9 tendo uma mutação D10A ou H840A (Ver, por exemplo, Ran et al. "Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specifi- city," Cell 154(6): 1380-1389 (2013)). Introdução de RNAs guia na célula hospedeira

[0073] Em algumas modalidades, os métodos CRISPR/Cas9 des- critos acima são realizados sem usar em conjunto in vivo de marcador e/ou vetores de gRNA através de reparo de lacuna, conforme descrito na seção anterior. Nestes métodos, todos os outros aspectos da in- venção são como descritos acima, por exemplo, as células hospedei- ras, os locais alvo, as nucleases guiadas por RNA, os ácidos nucleicos doadores, os RNAs guias, e assim por diante. Nessas modalidades, a célula hospedeira é colocada em contato com um ácido nucleico de codificação do RNA guia ou um RNA guia propriamente dito. O ácido nucleico pode ser, por exemplo, um plasmídeo contendo o elemento de estabilidade derivado de K. marxianus. Uma célula hospedeira transformada compreendendo o ácido nucleico doador integrado ao local alvo é então selecionada. Nessas modalidades, o ácido nucleico doador não é capaz de recombinação homóloga com ele mesmo ou com um ácido nucleico linear em contato com a célula hospedeira. Ca- so contrário, as moléculas doadoras são idênticas às descritas acima.

[0074] A construção do RNA guia pode ser transitoriamente ex- pressado a partir de cassetes de DNA linear acionados por um promo- tor de RNA polimerase Ill. Os cassetes de gRNA e DNAs doadores lineares (em que pelo menos um dos quais compreende uma sequên- cia de codificação do marcador selecionável) são cotransformados em uma célula hospedeira. Como nas modalidades descritas acima, a cé- lula hospedeira pode expressar a endonuclease de DNA guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-integrada em um local cromossômico.

[0075] Nessas modalidades, qualquer método para introduzir áci- dos nucleicos em uma célula hospedeira pode ser usado,por exem- plo, métodos de eletroporação.Em algumas modalidades, os oligos de RNA crRNA e tracrRNA (produtos IDT) são temperados in vitro e cotransformados junto com construções de doadores lineares (pelo menos um marcado) em uma célula hospedeira.

[0076] Nucleases específicas do local

[0077] Em algumas modalidades, a integração de ácidos nucleicos doadores em locais alvo compreende métodos que usam moléculas de DNA extracromossômico, que podem compreender um elemento de estabilidade da invenção e uma ou mais sequência de ácido nucleico codificando uma nuclease, como descrito em WO 2012/149470, que é aqui incorporada por referência. Nestes métodos, todos os outros as- pectos da invenção são como descritos acima, por exemplo, as células hospedeiras, os locais alvo, os ácidos nucleicos doadores, e assim por diante.

[0078] Nestes métodos, as moléculas de DNA doador são introdu- zidas em uma célula hospedeira de Kluyveromyces, onde cada DNA doador compreende uma primeira região de homologia e uma segunda região de homologia. A primeira e a segunda regiões de homologia compartilham homologia com regiões 5' e 3', respectivamente, de lo- cais alvo genômicos.

[0079] Um DNA extracromossômico compreendendo um elemento de estabilidade como descrito abaixo e uma sequência de ácido nu- cleico de codificação de nuclease específica do alvo também podem ser introduzidos à célula hospedeira. A nuclease é capaz de reconhe- cer e clivar uma sequência única dentro do local alvo. Após a indução de uma quebra de fita dupla dentro do local alvo pela nuclease especí- fica do local, máquina de recombinação homóloga endógena integra o DNA doador no local alvo clivado com maior frequência em compara- ção com um local alvo que não compreende uma quebra de fita dupla. Este aumento da frequência da integração evita a necessidade de cointegrar um marcador selecionável para selecionar os transforman- tes submetido a um evento de recombinação.

[0080] Uma variedade de métodos está disponível para identificar as células com um genoma alterado em ou perto do local alvo, sem o uso de um marcador selecionável. Em algumas modalidades, tais mé- todos procuram detectar qualquer mudança no local alvo, e incluem, mas não estão limitados a métodos de PCR, métodos de sequencia- mento, digestão de nuclease, por exemplo, restrição de mapeamento, Southern blot, e qualquer combinação destes.

[0081] Os métodos da invenção podem ser usados para integração genômica simultânea de moléculas de DNA doador usando duas ou mais nucleases específicas do local.

[0082] Como mencionado acima, uma quebra de fita dupla em um local de alvo selecionado é induzida por endonucleases específicas do local, por exemplo, recombinases local-específico, transposases, to- poisomerases e nucleases dedo de zinco, e incluem derivados modifi- cados, variantes, e fragmentos destes. A nuclease cliva o local alvo em uma sequência de reconhecimento, que é expressamente reco- nhecida e/ou ligada por um agente de indução de quebra de fita dupla. O comprimento da sequência do local de reconhecimento pode variar e inclui, por exemplo, sequências que são pelo menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou mais nucle- otídeos de comprimento.

[0083] Em algumas modalidades, a sequência de reconhecimento é palindrômica, isto é, a sequência de uma fita Iê o mesmo no sentido oposto na fita complementar. Em algumas modalidades, o local de en- talhe/clivagem está dentro da sequência de reconhecimento. Em ou- tras modalidades, o local de entalhe/clivagem está fora da sequência de reconhecimento. Em algumas modalidades, a clivagem produz ter- minais de extremidade cega. Em outras modalidades, a clivagem pro- duz saliências de fita simples, ou seja, "extremidades pegajosas", que pode ser tanto saliências 5' ou saliências 3'.

[0084] Em algumas modalidades, a sequência de reconhecimento dentro do local alvo selecionado pode ser endógena ou exógena ao genoma da célula hospedeira. Quando o local de reconhecimento é exógeno ao genoma da célula hospedeira, ele pode ser introduzido no genoma da célula hospedeira por qualquer meio conhecido pelos ver- sados na técnica. Por exemplo, a sequência de reconhecimento pode ser introduzida através de métodos de reparação de lacuna descritos acima. Alternativamente, um local de reconhecimento endógeno pode- ria ser reconhecido e/ou ligado por uma quebra de fita dupla modifica-

da ou submetida à engenharia genética induzindo o agente projetado ou selecionados a especificamente reconhecer a sequência de reco- nhecimento endógena para produzir uma quebra de fita dupla. Em al- gumas modalidades, o agente indutor de quebra de fita dupla modifi- cado é derivado de um agente nativo, de ocorrência natural, induzindo a quebra de fita dupla. Em outras modalidades, o agente indutor de quebra de fita dupla modificado é criado artificialmente ou sintetizado. Métodos para seleção de tais agentes indutores de quebra de fita du- pla modificados ou submetidos a engenharia genética são conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos da(s) proteína(s) podem ser preparadas por mutações no DNA. Méto- dos para mutagênese e alterações da sequência de nucleotídeos in- cluem, por exemplo, Kunkel, (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:488- 92; Kunkel, et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; U.S. Pat. No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências citadas nele. Orientação sobre substituições de aminoácidos não sus- ceptíveis de afetar a atividade biológica da proteína é encontrada, por exemplo, no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequen- ce and Structure (Natl Biomed Res Found, Washington, D.C.). Substi- tuições conservadoras, como a troca de um aminoácido por outro ten- do propriedades semelhantes, podem ser preferíveis. Deleções con- servadoras, inserções e substituições de aminoácidos não são espe- radas para produzir mudanças radicais nas características da proteína, e o efeito de qualquer substituição, deleção, inserção, ou combinação destes pode ser avaliado por ensaios de triagem de rotina. Ensaios para a atividade indutora de quebra da fita dupla são conhecidos e ge- ralmente medem a atividade global e a especificidade do agente em substratos de DNA contendo locais de reconhecimento.

[0085] Endonucleases úteis na presente invenção incluem endo-

nucleases homing, que como endonucleases de restrição, se ligam e cortam uma sequência de reconhecimento específica. No entanto, os locais de reconhecimento para endonucleases homing são geralmente maiores, por exemplo, cerca de 18 bp ou mais. Endonucleases ho- ming, também conhecidas como meganucleases, são bem conhecidas pelos versados na técnica e foram classificadas nas seguintes famílias com base em motivos de sequência conservada: uma endonuclease homing LAGLIDADG, uma endonuclease homing HNH, uma endonu- clease homing caixa de His-Cys, uma endonuclease homing GIY-YIG e uma endonuclease homing de cianobactérias. Exemplos de endonu- clease homing útil na presente invenção incluem, mas não estão limi- tados a: H-Drel, I-Seel, I|-Scell, I-Scelll, |-ScelV, I-SceV, |-See VI, IS- ceVII, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-Crel, |-CrepsbIP, |-CrepsblIIP, I-CrepsblIlIP, 1- CrepsbIVP, I-Tlil, I-Ppol, Pi-Pspl, F-Scel, F-Scell, F-Suvl, F-Cphl, F- Tevl, F-Tevll, I-Amal, I-Anil, I-Chul, ICmoel, I-Cpal, I-Cpall, I-Csml, 1|- Cvul, I-CvuAIP, 1-Ddil, I-Ddill, I-Dirl, --Dmol, I-Hmul, IHmull, I-HsNIP, |- Llal, I-Msol, I-Naal, I-Nanl, I-NclIP, I-NgrlP, I-Nitl, I-Njal, I-Nsp236IP, IPakl, I-PbolP, I-PculP, I-PcuAl, I-PeuvVl, I-PgrlP, I-PobIP, I-Porl, |- PorlIlP, I-PbplIP, ISpBetalP, |I-Seal, I|I-SexlP, I-SnelP, I-Spoml, |- SpomCP, I-SpomlP, I-SpomllP, I-SquiP, ISsp68031, I-SthPhiJP, |- SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I|-TdelP, I-Tevl, I-Tevil, I-Tevill, IVarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, 1-ZbilP, Pl-Mgal, PlI-Mtul, Pl- MtuHIP PIMtuHIIP, PI-Pful, PI-Pfull, PI-Pkol, PI-Pkoll, PI-Rma438121P, PI-SpBetalP, Pl-Seel, Pl-Tful, PI-Tfull, PIl-Thyl, PI-TIil, ou PI-TIill, ou qualquer variante ou derivado destes.

[0086] Em algumas modalidades a nuclease é uma proteína de fusão de nuclease- domínio de ligação ao DNA efetor de TAL (TA- LEN). TAL efetores de bactérias patogênicas de plantas do gênero Xanthomonas desempenham um papel importante na doença ou de- sencadeamento de defesa, pela ligação do DNA hospedeiro e ativação dos genes hospedeiros específicos para efetores. O domínio de liga- ção do DNA efetor -TAL pode ser projetado para se ligar a uma se- quência alvo desejada, e fundido a um domínio de nuclease, por exemplo, de uma endonuclease de restrição do tipo Il, geralmente um domínio de clivagem inespecífico a partir de uma endonuclease de restrição do tipo Il, como Fokl, Hhal, Hindlll, Nod, BbvCI, EcoRI, Ball e Alwl. Assim, em modalidades preferidas, o TALEN compreende um domínio efetor de TAL, compreendendo uma pluralidade de sequên- cias de repetição do efetor de TAL que, em combinação, se ligam a uma determinada sequência de nucleotídeos na sequência de DNA alvo, de tal forma que TALEN cliva o DNA alvo dentro ou adjacente à sequência de nucleotídeos específicos. TALENS úteis para os méto- dos fornecidos aqui incluem aqueles descritos em WO10/079430 e publicação de pedido de patente US nº 2011/0145940.

[0087] Em algumas modalidades a nuclease é uma recombinase sítio-específico. Uma recombinase sítio-específico, também referida como uma recombinase, é um polipeptídeo que catalisa a recombina- ção conservadora específica do local entre seus locais de recombina- ção compatíveis, e inclui polipeptídeos nativo, bem como derivados, variantes e/ou fragmentos que mantêm a atividade, e polinucleotídeos nativos, derivativos, variantes e/ou fragmentos que codificam uma re- combinase que mantém a atividade. Em algumas modalidades, a re- combinase é uma serina recombinase ou uma tirosina recombinase. Em algumas modalidades, a recombinase é das famílias Integrase ou Resolvase. Em algumas modalidades, a recombinase é uma integrase selecionada do grupo consistindo de FLP, Cre, lambda integrase e R.

[0088] Em algumas modalidades, a nuclease é uma transposase. Transposases são polipeptídeos que medeiam a transposição de um transpóson de um local no genoma para outro. Transposases normal- mente induzem quebras de fita dupla para excisar o transpóson, reco-

nhecer repetições subterminais e reunir as extremidades do trans- póson excisado, em alguns sistemas outras proteínas também são obrigadas a unir as extremidades durante a transposição. Exemplos de transpóson e transposases incluem, mas não estão limitados a, ele- mentos Ac/Ds, Dt/rdt, Mu-M1/Mn e Spm(en)/dSpm de milho, os ele- mentos Tam de snapdragon, o transpóson de Mu de bacteriófago, transpóson bacteriano (Tn) e sequências de inserção (IS), elementos Ty de leveduras (Retrotranspóson), elementos Ta 1 de Arabidopsis (Retrotranspóson), o elemento P de transpóson de Drosophila, os elementos Copia, Mariner e Minos de Drosophila, os elementos Her- mes da mosca doméstica, os elementos PiggyBack de Trichplusia ni, elementos Tc1 de C.elegans, e elementos IAP de camundongos (retro- transpóson).

[0089] Em algumas modalidades a nuclease é uma nuclease dedo de zinco (ZFN). ZFNs são agentes indutores de quebra de fita dupla submetidos a engenharia genética compreendido de domínio de liga- ção de DNA dedo de zinco e um domínio agente indutor de quebra de fita dupla. ZFNs submetidos a engenharia genética consistem de duas matrizes de dedo de zinco (ZFAs), cada um dos quais é fundido a uma única subunidade de uma endonuclease não específica, como o domí- nio de nuclease da enzima Fokl, que torna-se ativo durante a dimeri- zação. Elemento de estabilidade

[0090] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos circulares extracromossômicos e outros plasmídeos usados nos métodos da in- venção podem compreender um elemento de estabilidade derivado de K. marxianus. Os elementos de estabilidade podem compreender uma sequência consenso de ARS, e, opcionalmente, uma sequência de CEN, das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 ou 22. Em algumas mo- dalidades, os elementos de estabilidade compreendem uma sequência

CEN pelo menos 95% idênticos à SEQ ID NO: 2 e uma sequência de consenso da ARS pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3. Em al- gumas modalidades, o elemento de estabilidade é pelo menos 90% idêntico a uma sequência menos de 750 bp de comprimento e com- preendendo 202 a 876 ou resíduos 537 a 1252 da SEQ ID NO: 1 e re- síduos 1 a 566 ou resíduos 348 a 1043 da SEQ ID NO: 4. Em outras modalidades, o elemento de estabilidade é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. Células hospedeiras

[0091] Os métodos da invenção podem ser usados para modificar um ou mais locais alvo em um genoma da célula hospedeira de Kluy- veromyces. A célula hospedeira pode ser qualwuer membro do gênero Kluyveromyces, including, for example, K. marxianus, K lactis, K. aes- tuarii K. africanus, K. bacillisporus K. blattae, K. dobzhanskii, K. hu- beiensis, K. lodderae, K. nonfermentans, K. piceae, K. sinensis, K. thermotolerans, K. waltii, K. wickerhamii e K. yarrowii. Culturas celulares

[0092] As células hospedeiras de Kluyveromyces são cultivadas usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Se um marcador de seleção for usado, as células são cultivadas por um período de tempo suficiente para a expressão do marcador selecioná- vel a partir do vetor extracromossômico circularizado. Em algumas modalidades, onde o marcador selecionável é um marcador de resis- tência a fármacos, a cultura é feita por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade de proteína marcadora que o pode su- portar a sobrevivência de células expressando o marcador no meio selecionável. Em certas modalidades, estas condições também seleci- onam contra a sobrevivência de células que não expressam o marca- dor selecionável. Pressão seletiva pode ser aplicada às células usando uma variedade de compostos ou tratamentos que seriam conhecidos por um profissional versado na técnica.

Por exemplo, pressão seletiva pode ser aplicada pela exposição de células hospedeiras a condições que são subótimas ou deletérias para o crescimento, a progressão do ciclo celular ou viabilidade, de tal forma que as células que são tole- rantes ou resistentes a essas condições são selecionadas para com- paração com as células que não são tolerantes ou resistentes a essas condições.

Condições que podem ser usadas para exercer ou aplicar pressão seletiva incluem, mas não estão limitadas a, antibióticos, me- dicamentos, mutagênicos, compostos que reduzem a velocidade ou param o crescimento celular ou a síntese de blocos de construção bio- lógica, compostos que perturbam o RNA, DNA ou síntese de proteí- nas, privação ou limitação de nutrientes, aminoácidos, carboidratos ou compostos necessários para o crescimento celular e a viabilidade do crescimento celular ou meios de cultura, tratamentos, como cresci- mento ou manutenção de células sob condições subótimas para o crescimento celular, por exemplo, temperaturas subótimas, condições atmosféricas (por exemplo, % de dióxido de carbono, oxigênio ou ni- trogênio ou umidade) ou em condições de meio privado.

O nível de pressão seletiva que é usada pode ser determinado por um versado na técnica.

Isto pode ser feito, por exemplo, executando um experi- mento de curva de morte, onde as células de controle e células que compreendem os genes ou marcadores de resistência são testados com níveis crescentes, doses, concentrações ou tratamentos da pres- são seletiva e os intervalos que selecionam contra apenas células ne- gativa ou, preferencialmente, ao longo de um intervalo de tempo dese- jado (por exemplo, de 1 a 24 horas, 1 a 3 dias, 3 a 5 dias, 4 a 7 dias, 5 a 14 dias, 1 a 3 semanas, 2 a 6 semanas). Os níveis exatos, concen- trações, doses, ou tratamentos de pressão seletiva que podem ser usados dependem das células que são usadas, as próprias proprieda- des desejadas, os marcadores, fatores ou genes que conferem resis-

tência ou tolerância à pressão seletiva, bem como os níveis de as pro- priedades desejadas que são desejadas nas células que são selecio- nadas e um versado na técnica entenderia facilmente como determinar os intervalos adequados com base em tais considerações.

[0093] A cultura pode ser realizada em um meio de cultura ade- quado em um recipiente adequado, incluindo mas não limitado a, uma placa de cultura de células, um frasco ou um fermentador. Em algu- mas modalidades, o meio de cultura é um meio aquoso compreenden- do fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato. Tal meio tam- bém pode incluir também sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados. Em algumas modalidades, além do agente de seleção, o meio adequado é suplementado com um ou mais agentes adicionais, como, por exemplo, um indutor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeos codificando um produto do gene estão sob o controle de um promotor induzível), um repressor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeos codificando um pro- duto do gene estão sob o controle de um promotor repressível). Mate- riais e métodos para a manutenção e crescimento de culturas celula- res são bem conhecidos pelos versados na técnica de microbiologia ou da ciência fermentação (ver, por exemplo, Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, segunda edição, McGraw Hill, New York, 1986). A consideração deve ser dada ao meio de cultura apropriado, pH, temperatura, e requisitos para condições aeróbicas, microaeróbi- cas, ou anaeróbicas, dependendo dos requisitos específicos da célula hospedeira, a fermentação e o processo. Em algumas modalidades, a cultura é feita por um período de tempo suficiente para a população transformada se submeter a uma pluralidade de duplicações até uma densidade celular desejada for alcançada. Em algumas modalidades, a cultura é feita por um período de tempo suficiente para a população de células hospedeiras alcançar uma densidade celular (OD600) com-

preendida entre 0,01 e 400 no recipiente de fermentação ou recipiente em que a cultura está sendo realizada. Em outras modalidades, a cul- tura é realizada durante um período de, pelo menos, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais de 96 horas. Em algumas modalidades, a cultu- ra é realizada por um período entre 3 e 20 dias. Em algumas modali- dades, a cultura é feita por um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais de 20 dias.

[0094] Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de eliminar o vetor ex- tracromossômico circularizado da célula hospedeira, por exemplo, uma vez que uma célula hospedeira tem sido identificada como compreen- dendo a integração genômica desejada(s). Sistemas baseados em plasmídeos geralmente requerem pressão seletiva sobre os plasmí- deos para manter o DNA estranho na célula. Em algumas modalida- des, a eliminação de um plasmídeo codificando o marcador seletivo de uma célula selecionada pode ser alcançada, permitindo que as células selecionadas sofram divisões mitóticas suficientes tal que o plasmídeo seja efetivamente diluído da população. Alternativamente, as células livres de plasmídeo podem ser selecionadas pela seleção para a au- sência do plasmídeo, por exemplo, selecionando contra uma con- tramarcador selecionável (como, por exemplo, URA3) ou por plaque- amento de colônias idênticas em ambos os meios seletivos e não sele- tivos e, em seguida, selecionando uma colônia que não cresce em meios seletivos, mas crescem em meios não seletivos.

Métodos para a produção de um produto de interesse

[0095] Como observado acima, o DNA doador pode ser usado in- tegrando qualquer sequência de ácido nucleico desejado no genoma da célula hospedeira de Kluyveromyces. Assim, os métodos da inven- ção poderão compreender a cultura de uma célula hospedeira, com- preendendo uma ou mais moléculas de DNA doador integrado de inte-

resse codificando uma ou mais proteínas de interesse em condições adequadas para produção da proteína e recuperação da proteína pro- duzida pela célula hospedeira. Métodos para preparação de proteínas purificadas a partir de culturas de células são bem conhecidos pelos versados na técnica. Em algumas modalidades, a proteína de interes- se é uma proteína selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, uma enzima, um hormônio, um fator de crescimento, um anticoagulan- te, fatores sanguíneos, uma proteína modificada, um interferon, uma interleucina, um trombolítico, uma proteína viral, ou uma proteína bac- teriana. Por exemplo, as células hospedeiras da invenção podem ser usadas para produzir enzimas capazes de hidrolisar os carboidratos de plantas, como celulases e inulinases.

[0096] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de si- nal de secreção (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oi- to, nove ou dez sequências de sinal de secreção) podem ser inseridas nas moléculas de DNA doador. A sequência de sinal de secreção codi- fica um peptídeo de sinal secreção que é reconhecido pela maquinaria molecular da célula hospedeira, que segrega então as proteínas da célula. A escolha de um peptídeo de sinal de secreção pode depender do tipo de célula hospedeira. Por exemplo, uma sequência de sinal de secreção pode ser usada na produção de anticorpos. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal de secreção pode ser colocada na extremidade 5" da sequência de cadeia leve. Em algumas modali- dades, uma sequência sinal de secreção pode ser colocada na extre- midade 5' da sequência de cadeia pesada. Em um exemplo, quando uma molécula de DNA doador contém uma sequência de cadeia leve e uma sequência de pesada cadeia, uma sequência de sinal de secre- ção pode ser colocada na extremidade 5" de cada uma das sequên- cias de cadeia leve e pesada.

[0097] As células hospedeiras e os métodos da invenção podem ser usadas para produzir altas titulações de um polipeptídeo desejado. Por exemplo, as titulações podem ser entre cerca de 5 mg/L e 30 mg/L, geralmente entre cerca de 10 mg/L e cerca de 25 mg/L e, muitas vezes, entre cerca de 15 mg/L e cerca de 20 mg/L. Em algumas moda- lidades, as titulações de um polipeptídeo desejado (por exemplo, anti- corpos de comprimento completo) pode ser de cerca de 5 mg/L e 50 g/L, ou seja, entre cerca de 15 mg/L e cerca de 10 g/L.

[0098] Em algumas modalidades, a(s) sequência(s) de ácido nu- cleicos codificando o polipeptídeo de interesse pode ser otimizada por códon de acordo com as frequências do códon da célula hospedeira. Usando o códon com a maior frequência de ocorrência na célula hos- pedeira pode reduzir mutações indesejáveis e melhorar a eficiência de tradução. Moléculas de DNA doador também podem incluir elementos de controle de expressão adequados conhecidos na técnica, incluindo promotores, potenciadores, marcadores de seleção e terminadores de transcrição bem conhecidos pelos versados na técnica. Métodos para expressão de proteínas terapêuticas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Ge- ne Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2º ed. 2004 edição (julho 20, 2004); Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Pro- tocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2º ed. 2012 edi- ção (junho 28, 2012).

[0099] Os métodos e as composições descritas aqui também são úteis na introdução de várias modificações no genoma da célula hos- pedeira e, portanto, fornecem vantagens particulares para a constru- ção de organismos recombinantes compreendendo vias biossintéticas otimizadas, por exemplo, para a conversão de biomassa em biocom- bustíveis, produtos farmacêuticos e biomateriais. Vias biológicas não nativas funcionais têm sido construídas com sucesso em hospedeiros microbianos para a produção de um número de produtos valiosos, in- cluindo precursores do fármaco antimalárico artemisinina, combustí- veis derivados de ácidos graxos e de produtos químicos (por exemplo, ésteres graxos, álcoois graxos e ceras), combustíveis e produtos qui- micos derivados de halogeneto de metilo, policetídeos sintases que fazem baixar os fármacos do colesterol e policetídeos.

[00100] São divulgados composições, materiais e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação de, ou são produtos dos métodos e compo- sições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste do- cumento, e entende-se que, quando combinações, subconjuntos, inte- rações, grupos, etc., destes materiais são divulgados que enquanto referência específica de cada um, várias combinações individuais e coletivas e permutações destes compostos podem não ser explicita- mente divulgados, cada um é especificamente contemplado e descrito aqui. Por exemplo, se um método é divulgado e discutido e uma série de modificações que podem ser feitas a uma ou mais moléculas, inclu- indo no método são discutidas, cada e toda a combinação e permuta- ção do método, e as modificações que são possíveis são especifica- mente contempladas, exceto quando especificamente indicado em contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação des- tes também está especificamente contemplada e divulgada. Este con- ceito aplica-se a todos os aspectos de divulgação, incluindo, mas não limitado a, etapas em métodos usando as composições divulgadas. Assim, se há uma variedade de etapas adicionais que podem ser rea- lizadas, entende-se que cada uma destas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer etapas do método específico ou combinação das etapas do método do método divulgado, e que cada uma dessas combinações ou subconjunto de combinação está especificamente contemplada e deve ser considerada divulgada.

Métodos para a produção de anticorpos

[00101] Em algumas modalidades, a célula hospedeira de Kluyve- romyces é um veículo que inclui os componentes celulares necessá- rios para expressar um anticorpo de sua sequência(s) de ácido nuclei- co correspondente. Como mencionado acima, uma ou mais moléculas de DNA doador pode ser usada para fornecer a sequência(s) de ácido nucleico dentro da célula hospedeira. Em algumas modalidades, o an- ticorpo de comprimento completo é produzido. Uma primeira sequên- cia de ácido nucleico codificando uma cadeia leve de anticorpos e uma segunda sequência de ácido nucleico codificando uma cadeia pesada de anticorpos podem ser inseridas na molécula de DNA doador indivi- dual. Em outras modalidades, a primeira e a segunda sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia leve de anticorpos e a cadeia pesada de anticorpos, respectivamente, podem ser inseridas em uma mesma molécula de DNA doador.

[00102] Em algumas modalidades, a(s) sequência(s) de ácido nu- cleicos codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo de com- primento completo pode ser otimizada por códon de acordo com as frequências do códon da célula hospedeira, como descrito acima.

[00103] Quando uma molécula de DNA doador contém uma se- quência de cadeia leve e uma sequência de cadeia pesada, uma se- quência ligante (por exemplo, uma sequência ligante clivável) pode ser colocada entre a sequência de cadeia leve e a sequência de cadeia pesada. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico codificando os anticorpos de comprimento completo pode incluir, em séries em tan- dem nesta ordem a partir da extremidade 5' para a extremidade 3', a sequência de cadeia leve, a sequência ligante (por exemplo, uma se- quência ligante clivável), e a sequência de cadeia pesada. Em outro exemplo, a sequência de ácido nucleico codificando os anticorpos de comprimento completo pode incluir, em séries em tandem nesta ordem a partir da extremidade 5' para a extremidade 3', a sequência de ca- deia pesada, a sequência ligante (por exemplo, a sequência ligante clivável), e a sequência de cadeia leve. Quando a sequência de cadeia leve e a sequência de pesada cadeia são cada uma inserida em uma molécula de DNA doador separada, uma sequência ligante pode ser colocada entre a sequência de sinal de secreção na sequência de ca- deia leve ou pesada. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico codificando a cadeia leve pode incluir, em séries em tandem nesta or- dem a partir da extremidade 5' para a extremidade 3', a sequência de sinais de secreção, a sequência ligante e a sequência de cadeia leve.

[00104] Em modalidades específicas, um ligante pode ser um ligan- te clivável que contém um ou mais elementos que podem ser seleti- vamente clivados, como, por exemplo, depois de uma proteína ser formada. Em algumas modalidades, um ligante clivável pode ser um ligante autoclivável, que pode funcionar fazendo com que o ribossomo pule a síntese de uma ligação do peptídeo entre um aminoácido glicina e um aminoácido prolina perto do C-terminal do ligante autoclivável. Em outras modalidades, um ligante pode ser um ligante clivável da protease, que contém um local de clivagem da protease que é especi- ficamente reconhecido por uma protease, por exemplo, uma serina protease (por exemplo, fator Xa, enteropeptidase, proteinase K, qui- miotripsina, tripsina, elastase, plasmina, trombina, protease acrosso- mal, complemento C1, queratinase, colagenase, fibrinolisina e cocoo- nase), uma cisteína protease (por exemplo, protease VFC3C, papaína, bromelina, catepsina, calpaína, caspase-1, sortase, protease TEV e vírus da hepatite C peptidase 2), uma treonina protease, uma protease aspártica, uma protease glutâmica, uma metaloprotease e um peptí- deo liase de asparagina.

[00105] Em algumas modalidades, a célula hospedeira não com- preende um ácido nucleico que codifica o anticorpo de comprimento completo Herceptin (trastuzumabe), o anticorpo de comprimento com- pleto Rituxan (rituximabe), ou o anticorpo de comprimento completo BIIB. Em algumas modalidades, a célula hospedeira não expressa um anticorpo de comprimento completo Herceptin (trastuzumabe), o anti- corpo de comprimento completo Rituxan (rituximabe), ou o anticorpo de comprimento completo BIIB.

[00106] As células hospedeiras da invenção são capazes de secre- tar uma população de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, onde, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da população de anticorpos ou fragmentos de anticorpos são anticorpos de compri- mento completo. Em algumas modalidades, estas percentagens po- dem ser determinadas pelo peso, quando comparando o peso dos an- ticorpos de comprimento completo ao peso da população de anticor- pos ou fragmentos de anticorpos. Em algumas modalidades, estas percentagens podem ser determinadas por densitometria das bandas de Western blot. Exemplos

[00107] Na presente invenção, secreção de dois anticorpos de comprimento completo, o Herceptin (trastuzumabe) e o Rituxan (ritu- ximabe) em K. marxianus com altas titulações (= 19 ug/mL) foi alcan- çada. As altas titulações foram alcançadas usando otimização de có- don das sequências de aminoácidos para cadeia pesada, cadeia leve e marcador de secreção de acordo com os códons preferidos de K. marxianus. As construções de expressão de DNA foram clonadas em um cassete dividido convergente no mesmo local sob forte promotor constitutivo glicolítico nativo. O número de cópia do cassete (duas/três cópias parecem ser ideais) foi variado. Um processo de reciclagem da célula deu uma melhorada significativa na titulação usando glicose a 4% (a partir fonte de cana-de-açúcar). Além disso, uma cepa de pro- dução de K. marxianus com três números de cópia de Herceptin foi executada em tanque de fermentação de 0,5 L e deu altas titulações de anticorpos de comprimento completo (titulação estimada > 30 upg/mML). As manchas foram construídas usando ferramentas CRISPR e a deleção de vias de NHEJ. Número de cópias de integração do gene e integrações específicas do local foram controladas por realizar a in- tegração genômica alvo. A produção destes dois anticorpos foi gerada no fundo da cepa NRRL-7571. Esses resultados mostram que K. mar- xianus é um hospedeiro emergente atraente para a produção e secre- ção de anticorpos. Materiais e métodos Preparação de cepa hospedeira de K. marxianus para CRISPR-Cas

[00108] A cepa K. marxianus do tipo selvagem (NRRL-7571) foi usada. A versão otimizada por códon de S. cerevisiae do gene Cas9 de Streptococcus pyogenes foi fundida a uma sequência de localiza- ção nuclear SV40 e clonada em um cassete de integração sob a ex- pressão do promotor TEF1 de S. cerevisiae com um terminador CYC1 (Horwitz 2015, DiCarlo et al 2013a). A construção, marcada com um cassete de hphA (resistência a higromicina), foi integrada de forma es- tável no local YKU7O da cepa NRRL-7571 de K. marxianus do tipo sel- vagem. A integração correta no local YKU?7O foi verificada por reações de PCR de colônia. Cassetes de expressão do RNA guia

[00109] A proteína Cas9 é direcionada para locais de corte pela as- sociação com um RNA estrutural genérico e um RNA de direciona- mento específico. A configuração padrão "quimérica" foi adotada, em que os RNAs de direcionamento e estruturais são fundidos para criar um gRNA único. A expressão da construção do gRNA foi impulsionada pelo promotor SNR52 da polimerase Ill, com um terminador SUP4. O cassete de gRNA foi clonado em vetor de cópia baixa e estável usan- do os elementos do cromossomo V CEN de K. marxianus pela repara-

ção da lacuna diretamente em uma cepa hospedeira expressando Cas9 (Orr-Weaver et al., 1983). A fim de reparar a lacuna dos cassetes de gRNA diretamente no vetor de expressão no cepa hospedeira, primei- ro são gerados cassetes de gRNA de comprimento completo com 500 bp de homologia de flanqueamento ao vetor linearizado. Células hospe- deiras foram co-transformadas com fragmentos de DNA únicos ou múlti- plos (para multiplexagem) contendo cassetes de gRNA tendo linear de homologia de flanqueamento com o plasmídeo linear. Plasmídeos e gRNA são fornecidos na Listagem de sequências e na Tabela 1. As composições e os métodos relacionados à reparação de lacuna e outros recursos são descritos em WO2015/095804, que é aqui incorporado por referência. As composições e os métodos de integrações genômicas sem marcador são descritos em WO2012/149470, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade. Ver, também, De Kok et al. (2014) ACS Synth. Biol. 21;3(2):97-106. doi: 10.1021/sb4001992; Serber et al., Patente U.S. No. 8,221,982. Seleção de locais alvo e geração de DNA doador

[00110] Os locais Cas9 foram selecionados como descrito anterior- mente (Horwitz et al. 2015). As construções de expressão para Her- ceptin e Rituxan foram desenhadas como cassetes de expressão con- vergentes, divididos, usando o menor líder pré-alfa. Foi feita a otimização por códon de ambas as sequências de anticorpos monoclionais para K. marxianus. Construções de DNA doador com 500 bp de homologia de flanqueamento foram geradas usando ligantes padronizados para a montagem conforme descrito na Patente dos EUA Nº 8.110.360, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Consultar, também, Horwitz, 2017. Sequências completas são fornecidas na Listagem de sequências. Integrações genômicas de DNA sem marcador

[00111] Afim de integrar as construções de anticorpos no genoma de nossas cepas hospedeiras usando CRISPR, os métodos de S. ce- revisiae LiAc otimizados foram usados para co-transformar o DNA do- ador e os reagentes de gRNA apropriados em cada cepa expressando Cas9 (Gietz e Woods, 2002). As células foram cultivadas durante a noite em meio de extrato de levedura dextrose peptona (YPD) de 300C com agitação, então diluída a uma densidade óptica (DO) 600 de 0,1 em frascos e cultivadas novamente a 300C com agitação para OD600 de 0,6. As células foram giradas para baixo, ressuspensas em água estéril, giradas para baixo, ressuspensas em 100 mM de acetato de lítio, giradas para baixo, e ressuspensas em 100 mM de acetato de lítio (40UL) por transformação. Transformação foi feita em placa PCR e a mistura incluiu o seguinte: 208UuL de PEG 3350 a 50%, 31UL de IM de acetato de lítio, 8,4 ul de DNA de esperma de salmão cozido (10 mg/ml) e 65pL de DNA e células. As células foram recuperadas duran- te a noite em meio YPD não seletivo antes de plaqueamento no meio seletivo contendo nourseotricina para manter o plasmídeo de gRNA. Cada integração sem marcador foi confirmada usando um PCR de co- lônia. Tabela 1 Sequências de gRNA CRISPR Alvo sequência de reconhecimento de 19bp de gRNA AYKU80 GCCGCGGGCAACAGCCCGC SEQ ID NO: 19 APRB1 GATGGTGCCGAGGCGGCGG SEQ ID NO: 20 APEP4 GCTACAAGCGAGCCCGGCT SEQ ID NO: 21 Cultivo de cepas de produção de mAb de K. marxianus

[00112] As colônias de cepas de produção foram colhidas em tubos Falcon de 15 mL contendo 4 mL de meio YPD e cultivadas a 30 ºC du- rante a noite. 10 ul da cultura foram inoculados em 25 mL de meio YPD contendo 4% de glicose (puro ou de fonte de cana-de-açúcar) e cultivadas por 72 horas. As células foram giradas para baixo e sobre-

nadante clarificado foi analisado para produção de mAbs. No processo de "reciclagem da célula", o pélete celular foi ressuspenso com 25 mL de meio YPD contendo 4% de glicose (puro ou de fonte de cana-de- açúcar) e cultivado por outro meio fresco 72 horas a 30 ºC. Tratamento Endo Hf, SDS-PAGE e Western Blot

[00113] O tratamento com endoglicosidases foi feito usando Endo Hf (New England Biolabs, Cat. No. PO703S), de acordo com as instru- ções do fabricante. Para amostras não reduzidas, 1x tampão de des- naturação glicoproteína foi substituído com 5% de solução de SDS. Todas as amostras de anticorpo monoclonal foram misturadas com tampão de amostra NuPAGE LDS (Thermofisher, Cat. Nº NPO008) e desnaturadas em 70 ºC por 10 min antes da execução de amostras não reduzidas em géis de proteínas pré-fabricados de Tris-Acetato a 3-8% (Thermofisher, Cat. No. EAO375). Para amostras reduzidas, tampão de redução de amostra NUPAGeEe (Thermofisher, Cat. Nº NPOO9) foi usado como agente redutor. Amostras reduzidas foram executadas em géis de proteínas pré-fabricados de Bis-Tris a 4%-12% (Thermofisher, Cat. No. NP0321). Para análise de Western blot, IgG anti-humana de cabra (H + L) (LiCor, Cat. Nº 925-32232) foi usada na diluição de 1:10.000 para detectar anticorpo de cadeia pesada, cadeia leve ou de comprimento completo. Medições de titulação de anticorpos

[00114] Titulação de anticorpos foi medida por Octeto (ForteBio) ou usando um ensaio ELISA. ELISA foi feito usando o kit ELISA Humana I9gG1 (Thermofisher, Cat. No. EHIGG1), de acordo com as instruções do fabricante. Resultados Secreção de Herceptin e Rituxan

[00115] As sequências otimizadas por códon dos anticorpos mono- clonais de cadeias pesada e leve de Herceptin (anti-HER2) e Rituxan

(anti-CD20) foram inicialmente integradas a qualquer local YKU80 ou PRB1 usando as construções projetadas como cassetes de expressão convergentes, divididos. Ambas as cadeias pesadas e cadeias leves (de Herceptin e Rituxan) usaram a sequência líder pré-alfa menor oti- mizada por códon e a expressão gênica foi conduzida usando o pro- motor glicolítico forte nativo, pTEF. As cepas foram construídas como descrito acima (ver Materiais e Métodos) e os transformantes foram selecionados em nourseotricina. Integrações corretas foram verifica- das por PCR de colônia.

[00116] A secreção de anticorpos de comprimento completo foi ava- liada inicialmente pelo crescimento de células em glicose a 4% usando uma fonte de xarope de cana-de-açúcar ou usando glicose pura. Amostras sobrenadante foram analisadas usando análise de Western blot (FIGS. 1A e 1B). Os dados indicam o seguinte.

[00117] A secreção de dois anticorpos monoclonais de comprimento completo foi observada para ambos Herceptin e Rituxan.

[00118] Uma medição da titulação inicial usando octeto mostra que uma cepa com três cópias de Herceptin (Herceptin 3x) produziu 18,9 upg/mL de anticorpo.

[00119] Observar que todos os experimentos nas Figuras 1A e 1B foram feitos sob condição de reciclagem da célula (Ver Seção 3.2.2). Secreção de Herceptin e Rituxan sob reciclagem de células versus condições padrão

[00120] Um processo de reciclagem de células foi explorado para aumentar a produção de anticorpos. A lógica por trás considerando um processo de reciclagem da célula é que o processo pode influenciar a distribuição de consumo de açúcar em cepas de produção, minimizan- do o fluxo de açúcar à biomassa e empurrando o açúcar para a produ- ção de anticorpos. O processo de reciclagem de células pode permitir manter a produção de células de alta densidade sob condições de crescimento mínimo.

[00121] Neste experimento, um par de células do frasco foram culti- vadas em meio YPD contendo glicose a 4% (de fonte de cana-de- açúcar) e cultivadas por 72 horas. Em um processo padrão, as células foram giradas para baixo e sobrenadante clarificado foi analisado para produção de mAbs. No processo de reciclagem da célula, no entanto, o pélete celular foi ressuspenso com outro meio YPD fresco contendo glicose a 4% (fonte de cana-de-açúcar) e cultivado por outras 72 horas a 30 ºC. Amostras padrão e de reciclagem celular foram analisadas para a produção de anticorpos usando análise de Western blot e car- regadas em um mesmo gel lado a lado.

[00122] O resultado do Western blot mostra claramente que o pro- cesso de reciclagem celular melhorou significativamente a titulação para todas as cepas testadas e é superior sobre o processo padrão (FIGS. 2A-2C). Além disso, a medição da titulação de uma cepa de Herceptin de três cópias (Herceptin 3 x) sob processo de reciclagem celular deu uma titulação de 18,9 ug/mL (usando o processo de reci- clagem celular e medida pelo Octeto; ver Fig. 3). K. marxianus secre- tou tanto Herceptin como Rituxan de comprimento completo. Expres- são ou secreção de Herceptin do local YKU80 deu uma melhor produ- ção/ secreção de proteínas do que a expressão do local PRB1 (Figs. 2A-2C).

[00123] Afim de determinar o efeito do número de cópias na produ- ção/secreção de anticorpos monoclonais, foram integradas um segun- da e uma terceira cópia de Herceptin no local PEP4 e locais PEP4/PRB1, respectivamente. Aumento do número de cópia melhorou significativamente a titulação e três cópias fornecendo a mais alta titu- lação (FIG. 3). Uma medição da titulação inicial usando octeto mostra que uma cepa com três cópias de Herceptin produziu uma titulação de 18,9 ug/mL e medições de Octeto (Fig. 3). Tratamento de amostras de secreção de K. marxianus com Endo Hf deu bandas fortes de Western Blot (FIG. 2B e 2C), indicando proteínas secretadas hiperglicosiladas de K. marxianus e garantindo direção futura de glico-engenharia. Uma amostra do sobrenadante da produção usando a cepa Y629 produtora do Herceptin foi analisada para análise de perfil de N-glicano. Resulta- do do espectrômetro de massa mostrou o alto padrão de glicosilação da manose, o que era esperado para K. marxianus (FIG. 4).

[00124] Em um experimento de prova de conceito, uma cepa de produção de K. marxianus, Y629, com 3 cópias de Herceptin foi execu- tada em um biorreator de 0,5 litros (Sartorius, Alemanha) com 270 mL de meio de fermentação contendo 15 g/L de NH4H2POA4, 20 g/L de açúcar de redução total (TRS) de xarope da cana (Brotas, Brasil) e uma solução de vestígios de metal e vitamina. O fermentador foi man- tido a 30 ºC e pH 6,5 com a adição de NH4O0H. Em uma primeira fase de lote, o fermentador foi aerado em 2 volume por volume por minuto (VVM) e agitação aumentada para manter 30% de oxigênio dissolvido. Depois que o açúcar inicial foi consumido, o aumento no modo de ali- mentação por pulso acionado por oxigênio dissolvido (10 g/L a uma taxa de alimentação mínima de 6 g/L) até a cultura atingir a taxa de consumo de oxigênio de 150 mmol/L/hr (OUR). Entre os pulsos, não houve entrega de açúcar até que o oxigênio dissolvido subisse acima de 30% para acionar o próximo pulso de alimentação. A taxa de ali- mentação mínima durante a fase de crescimento foi de 6 g/L/h com um aumento programado de 10% da taxa de alimentação quando o inter- valo de tempo entre o fim de um pulso e o reforço subsequente pO2 está a menos de 20 minutos. No final do modo de alimentação de pul- so (150 mmol/L/hr OUR), o algoritmo de alimentação foi trocado para uma alimentação constante aeróbica (ACF) com uma constante agita- ção. Durante a ACF, a entrega inicial do açúcar foi de 6 g/L/h com o controlador ajustando a taxa de alimentação para manter 30% de oxi-

gênio dissolvido.

[00125] A receita de fermentação é programada para reduzir o for- necimento de alimentação enquanto o oxigênio dissolvido cai abaixo de 30% e, em seguida, aumenta o fornecimento de alimentação se o oxigênio dissolvido subir acima de 30%. O processo de fermentação continuou por sete dias e o caldo acumulado foi removido diariamente e, por conseguinte, dosado para produção de anticorpos. O resultado mostra que as titulações parecem ser significativamente melhoradas em biorreatores (Figs. 5A e 5B) e a melhora da titulação foi relaciona- da com a duração da fermentação. Amostras de cada momento foram analisadas usando análise de Western Blot e diluições de amostras de 1:10 (e uma diluição de 1:20 para amostras tratadas com Endo Hf) fo- ram necessárias para evitar sobrecarga em géis de proteína (Figs. 5A- 5C). Medição da secreção de Herceptin em um biorreator

[00126] Cepas da produção de K. marxianus foram inoculadas em um fermentador de 0,5 litros (Sartorius, Alemanha). O processo de fermentação implementado continuou por sete dias e o caldo acumu- lado foi removido diariamente e, por conseguinte, dosado para produ- ção de anticorpos. O resultado mostra que as titulações foram signifi- cativamente melhoradas em biorreatores em relação aos experimentos do frasco descritos acima (Figs. 5A e 5B). Amostras de cada momento foram analisadas por análise de Western Blot e uma diluição de amos- tras de 1:10 (e uma diluição de 1:20 para amostras tratadas com Endo Hf) foram necessárias para evitar sobrecarga em um gel de proteína. Experimentos adicionais sobre a produção de anticorpos

[00127] A Tabela 2 abaixo fornece um resumo de experimentos adi- cionais para K. marxianus (KM) produzindo BIIB, Herceptin e Rituxan em placa de agitação. Sequências de HC/LC, HC e LC são divididas em duas construções de DNA e integradas no mesmo local por re-

combinação de homologia.

Todas as sequências de BIIB e Hercep- tin/Rituxan foram fundidas para marcadores de secreção de S. cerevi- siae pré-pró-alfa e pré-alfa, respectivamente, a menos que observado.

NA = não disponível.

As sequências de cadeia pesada (HC) e de ca- deia leve (LC) do anticorpo BIIB podem ser encontradas como SEQ ID NO: 18 na Publicação de PCT WO2009043051 (Biogen) como SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

No entanto, para esta cons- trução, a expressão de IgG de comprimento completo não foi detecta- da, embora fragmentos de anticorpos fossem detectados.

Tabela 2. Titulação Octe- Anticorpos de comprimen- Espécies — Anticorpo Cepa Engenharia to (ug/mL) to completo secretados KM Nenhum Y366 Yku70A, preparado para a multiplexação O + 0,00 Não Ppep44::pTEF>HC/LC, prb14:: pTEF>HC/LC, KM BIIB Y350 NA Não mnn4A::pDGAL1>HC/LC, yku70A KM Herceptin — YA86km — yku80A ::pTEF>HC/LC, yku70A 7,26 + 0,71º Sim KM Herceptin — Y487 prb14 ::pTEF>HC/LC, yku70A 2,52 + 0,16º Sim yku80A ::pTEF>HC/LC, pep44 ::pTEF>HC/LC, KM Herceptin — Y631 12,39 + 0,70? Sim yku70A fã ku80A ::pTEF>HC/LC, pep44 ::pTEF>HC/LC, o KM Herceptin — Y629 y p PPP p 17,88 + 0,47” Sim & prb14 ::pTEF>HC/LC, yku70A KM Rituxan Y543 prb14 ::pTEF>HC/LC, yku70A NA Sim b.

As titulações foram alcançadas usando o modelo de placa de agitação da reciclagem da célula.

[00128] “Uma ou mais características de qualquer modalidade des- crita aqui ou nas figuras podem ser combinadas com uma ou mais ca- racterísticas de qualquer outra modalidade descrita aqui nas figuras sem sair do escopo da invenção.

[00129] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente cita- dos neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência co- mo se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especifi- camente e individualmente indicado para ser incorporado por referên- cia. Embora a invenção anterior tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente aos versados na técnica, à luz dos ensi- namentos desta invenção, que certas alterações e modificações po- dem ser introduzidas sem se afastar do espírito ou do escopo as rei- vindicações em anexo. Referências

[00130] Gombert AK, Madeira JV Jr, Cerdán ME and González-Siso MI (2016) Kluyveromyces marxianus as a host for heterologous protein synthesis. Appl Microbiol Biotechnol 100:6193—6208.

[00131] Lane MM, Burke N, Karreman R, Wolfe KH, O'Byrne CP, Morrissey JP (2011) Physiological and metabolic diversity in the yeast Kluyveromyces marxianus. 100(4):507-19.

[00132] Horwitz AA, Walter JM,Schubert MG, Hawkins K, Hernday AD ,Mahatdejkul-Meadows T, Szeto W,Chandran SS, Jack D. Newman JD (2015) Efficient Multiplexed Integration of Synergistic Alleles and Metabolic Pathways in Yeasts via CRISPR-Cas. Cell Syst. Jul 29;1(1):88-96, 2015.

[00133] DiCarlo, J.E., Norville, J.E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., and Church, G.M. (2013a). Genome engineering in Saccharomyces cerevi- siae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 43364343.

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[00135] Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W., and Rothstein, R.J. (1983). Genetic applications of yeast transformation with linear and gapped plasmids. Methods Enzymol. 101, 228-—245. Listagem de sequências informal: SEQ ID NO: 1 Elementos de DNA centromérico (CDE) estão sublinhados. Sequência de centrômero (CEN) está em negrito. (SEQ ID NO: 2) Sequência consenso de ARS está duplo sublinhada. (SEQ ID NO: 3) 1 11 21 31 41

GGATCCGATC TCCTTTCATT TCTGATAAAA GTAAGGCTTC TCTATTTACC 51 TTTTAACCTA CATATTCATA GTTGGAAGTT ATCCTTCTAA GTACGTATAC 101 AATATTAATT CAACGTAAAA ACAAAACTTA CTGTAAATAT GTGTAAAAAA 151 AATCTATTAA ATTCATGGCA GTTTCAAGAA AAGAAAACTA TTATGGTCTG 201 GTCACGTGTA TACAAATTAT TAATTTTAAA ACTATATAAT TTATTATTTT 251 TTTATTTTGA AGTTTAGAGT AATTTTAGTA GTATTTTATA TTTTAAATAA 301 ATATGCTTTA AATTTTTACT TAATATTTTA TTATTTTTAA ATACAACGTT 351 TTTATTTAAA ACAAAATTAT AAGTTAAAAA GTTGTTCCGA AAGTAAAATA 401 TATTTTATGG GTTTTACAAA AATAAATTAT TTTTAATGTA TTTTTTTAAT 451 TATATTTTTG TATGTAATTA TATCCACAGG TATTATGTTG AATTTAGCTG 501 TTTTAGTTTA CCTGTGTGGT ACTATGATTT TTTTAGAACT CTCCTCTTAG 551 AAATAGGTGG TGTTGCGGTT GACTTTTAAC GATATATCAT TTTCAATTTA 601 TTTATTTTAA AGTGACATAG AGAGATTCCT TTTAATTTTT TAATTTTTAT 651 TTTCAATAAT TTTAAAAATG GGGGACTTTT AAATTGGAAC AAAATGAAAA 701 ATATCTGTTA TACGTGCAAC TGAATTTTAC TGACCTTAAA GGACTATCTC 751 GAACTTGGTT CGGAAATCCT TGAAATGATT GATATTTTGG TGGATTTTCT 801 CTGATTTTCA AACAAGTAGT ATTTTATTTA ATATTTATTA TATTTTTTAC 851 ATTTTTTTAT ATTTTITTTAT TGTTTGGAAG GTAAAGCAAC AATTACTTTC 901 AAAATATATA AATCAAACTG AAATACTTAA TAAGAGACAA ATAACATTCA 951 AGAATCAAAT ACTGGGTTAT TAATCAAAAG ATCTCTCTAC ATGCGCCCAA 1001 ATTCACTATT TAAATTTACT ATACCACTGA CAGAATATAT GAACCCAGAT 1051 TAAGTAGCCA GAGGCTCTTC CACTATATTG AGTATATAGC CTTACATATT 1101 TTCTGCGCAT AATTTACTGA TGTAAAATAA ACAAAAATAG TTAGTTTGTA 1151 GTTATGAAAA AAGGCTTTTG GAAAATGCGA AATACGTGTT ATTTAAGGTT 1201 AATCAACAAA ACGCATATCC ATAGTGGATA GTTGGATAAA ACTTCAATTG 1251 ATGCGGCCGC SEQ ID NO: 4 Elementos de DNA centromérico (CDE) estão sublinhados. Sequência de centrômero (CEN) está em negrito. (SEQ ID NO: 5) Sequência consenso de ARS está duplo sublinhada. (SEQ ID NO: 6) 1 11 21 31 41

GATCCAAGTC TGAAGGTTGG TTTGGCACTA ACTTTACTCT TGTTATATTC

51 AGAATTGTAT CAAGTTTATT TGGTAGAGTG GAGCCTTTTT TTATCCGTAA 101 CACTTTTTCC CTGCTCCATT TTGAAAAACG ATTTCAGGCC ATCTTGGCTA 151 TTCCGAATGA ATTTGGAATA TGTTTAAATT AATAAAAATA AAATAAAATA 201 AAATAAAATA AAATAAAAAT TAAATCAAAT TAAATTAAAT TAAATTAAAT 251 TAAATTAAAT TAAATAAAAA TAAATACAAC CAATACAACA TGGTAATATT 301 CTTGCATCGT AATGAATATT AAMATATCACT TTATTAATCT CATCATGTTT 351 TATTGTTTTT GTAAGGACTT TAATATATTT GAATCAATAT TCTTTCAATT 401 ACTAGTACTT TTTTTATATG ACTAAAATTG TTACACATTG GACTGACAGT 451 AATTTTTAAA ATTTATGATT TATTCTTACT TTATATCTTT AAAAGTAGAA 501 ATATTATACG GACGCTTTGA ATACAATTGA CAACTTATCT TACTAGTGTG 551 AATCAACCCT ATCGATGTAG TACTCTTAAA ATACGGCCTT CTTGATAAAG 601 TGTTAAATTC ATTTGGGTAA TGATTTTTCG AAAACCACAT TGAATGAACG 651 ATCTAAATAA ATATAGGATG CAAAAGCATT TTAATAATTC AGAAACAAAC 701 AAATTATTAA ACAGGAGCAG TTGAACGGTA TGTTAGCGAG TTTTGTAAAG 751 GGTGAGTACA TTTATAGCTC TATTGAACAT AATAAATACA TATAAATAGT 801 ATTTTTTGAC CCTCTATGAA GATGGCTTAC CAGCAACTTA TGTCTTTTAA 851 TTCACGTGAC TACTAAACAA AAAAATATGT TATTTAAAAA ATATTTATTT 901 AMATTTTTAA ACTATTATAG ATTATTTGTG AATGCATTAT TTTTTAATTT 951 ATTAATTAAA AGAATTGCTA TTTACTTAAA ATAAGAATAA AAGCTTTTTA 1001 TTTTTTTAAMA AGAAMAAATAT ATTAAMAAACA CTTTTCCGAA AGTTAAAATA 1051 ATTTTATATT TATCGGTAGC TGCAATTTAT AGACATAATA TTTTATATTT 1101 TTTAAAATTT ATTATTATTT TGTTTGAAAT AATAACGTCG GTGAGTGTTT 1151 AAGGTGAACT AAGACTGAAA AAGTACATAA TTTTTGTTAA TTTTATGATA 1201 TGATC SEQ ID NO: 7 Elementos de DNA centromérico (CDE) estão sublinhados. Sequência de centrômero (CEN) está em negrito. (SEQ ID NO: 8) Sequência consenso de ARS está duplo sublinhada. (SEQ ID NO: 9) 1 11 21 31 41

AACAGATTGG TGGGTGGTCA ACGCACAAGC GATATCCCAA CACAGTCGGA 51 AAAACTCTCG TTCATTCCAA AACTGATTGC TTCAGATCAC AACTCCGCTG 101 GAGAAGATGA GTCCGTCACT TTCTTTCAAG ATTTGATTAA CGTTGATCGT 151 TTGAAACGTC TCAGAAATGT CACTGGTATG TCTATCGAAA TCGTGCTTGG 201 GACGCATAGA GAAATCCCAC AGCAACAGCA GCAGCAGCAG GAGTCACCTG 251 TAGCAGAAGG TGTTCCGGTC GCCCAGGATA ATGGACATGT AACCACGAAC 301 GACAATGCGG CAAATACTTC ATTGGAAGAA CCAAGTTCAC CCATTGACCA 351 GGTTTATGGA TACCTCCTAC AACAGAACAT GTCTACGTTG CCAGAAGTTA 401 CACTTTCGGA AAGTGATATC GCTATGAGCT ACCCGACGGA TCCAGTACCC 451 TCTTACAGCA GCAACTTTAA CAACTTTGCT CTGCCTACTA TTGCCGATGA 501 CAAACAAGAA TTAGAACAGA TGAGATTAAA GGAGCTAGAA AGTGAACCTC 551 CTATCTGAAC ACTTAACGAG AAATATTTAT ATGTGTGTTT TTGTTTGTAT 601 GTATGTATGT ATGTATGCCT GTGTATCATT AAATATATTA GCGGATCCCG 651 GAGTTTTTAT TATCGTGTTC TTTTCATTAT ATAGTGAACC TAAAGTGACT 701 TTCAATTCCA AATTATGGAA AGATTCCTGG CATTATGCCT TATAATAATC 751 ACTTGTTTAC AACATTCCAT TAACAACACA TGTACACTCA AATTCCATTC 801 CATAAAACCA AAAAAAACCT TATTGAATTC TCCAGACCTC TCTGTCGGCT 851 TGACTTTGCT TGCTCAATTC GCGTTTGGCT GAAGATCACT CCAGAACCTA 901 GGACGTCATT ATTGAAATCT GATCACGTGA TTCGCATATT CATATAGACG 951 TATATTTTTC GCCACTTTTC TCTCTTGAAA AAAAGTTGTG CTAGATGAAC 1001 TTTGAGAACA AAACACATTG AAAGAAAAGT GGAACATTAT AATAATTGGA 1051 AAGAATAGTA GATTGGGTGG CCAAGTGGAA GAATTTAGTA ACTTTAGTGG

1101 TTAGAGCTTG TTTGAACGAC CAATCCAGTA AACTAATCAA CCATTGAACA 1151 ATGAGTATTC CTATCTTTGG AGATCAAGTT ACCGAAGAGA GAGCAGAAAA 1201 TGCTCGTATG AGTGCCTTTG TTGGTGCCAT CGCCGTTGGT GATCTAGTGA 1251 AAACTACACT AGGTCCAAAA GGTATGGATA AGTTACTTCA AAGTGCATCC 1301 AATAGCTCGA GTTTGGTTAC AAACGATGGT GCTACCATTC TAAAATCTAT 1351 TCCTTTGGAC AACCCTGCTG CCAAGGTGCT TGTTAACATC AGTAAAGTGC 1401 AAGATGATGA AGTTGGTGAC GGTACAACAA GTGTTACTGT TCTAAGTGCA 1451 GAATTATTGA GGGAAGCTGA AAAACTTGTT GAACAAGGCA GAATTCACCC 1501 ACAAMACTATC ATCGAGGGTT ACAGAATTGC TTCTGCTGCT GCCCTCTCTG 1551 CATTGGAAAA GGCTGCTGTG GACAACTCCA AGAATAAAGA AGAATTTTAC 1601 AATGATTTGA TCAGCATCGC CAACACAACG CTATCTTCTA AAATTCTATC 1651 TCAAGATAAG GCTCACTTCT CTAAGTTGGC TACCGATGCT ATCTTAAGAT 1701 TAAAGGGCTC TACGAACTTG GAACACATTC AAATTATTAA GATCATTGGT 1751 GGTAAATTAT CGGATTCTTT CCTAGATGAA GGTTTCATTT TGCCAAAGAG 1801 ATTTGGTACC AACCAACCAA AACGTGTTGA AAATGCGAAG ATTTTGATTG 1851 CCAACACTTC TCTAGATACA GACAAGGTTA AAATCTTTGG TACCAAATTT 1901 AAGGTCGACT CTACTTCCAA GTTAGCTGAA CTAGAAAAAG CTGAGCGTGA 1951 AAAAATGAAG AGAAAGATAG AAAAGATTGC ACAATTCAAC ATTAATACCT 2001 TTATCAACAG ACAATTAATC TATGACTACC CTGAACAGAT GTTTACCGAC 2051 ATGGGTATCA ACTCCATCGA ACATGCTGAC TTTGAAGGTG TTGAAAGATT 2101 AGCACTTGTC ACTGGCGGTG AGGTTGTTTC TACATTTGAC AACCCAGAAA 2151 AATGTAAGCT AGGTGAATGT AAGTTGATCG AAGAAGTTAT AATTGGTGAG 2201 GAAATCTTTA CTAAATTTAC CGGGTGCAAG TCTGGTGAAG CTTGTACCAT 2251 TGTTCTAAGG GGTGCCACTG AGCAAGTCTT GGATGAAGCA GAAAGATCTC 2301 TACATGATGC CCTATCTGTT CTTTCCCAAA CAACAAAGGA GACTAGAACC 2351 GTTCTTGGTG GTGGTTGTGC AGAAATGATA ATGTCTAAAG CAGTTGATAC 2401 TGCAGCTCAA A SEQ ID NO: 10 Elementos de DNA centromérico (CDE) estão sublinhados. Sequência de centrômero (CEN) está em negrito. (SEQ ID NO: 11) Sequência consenso de ARS está duplo sublinhada. (SEQ ID NO: 12) 1 11 21 31 41

TCAATTACAA AGGGTGGAAA GTGATGGGGG GAATATCATC TGCACAATTT 51 TGGCTCGCTT TATATAGTGC CGAGATTAGT AGGGTCTGGA TAAAAAAGCG 101 AAGGAGAATA GGAAGAGGAA GAAAATTTTT TTTCTTCCTC TTTGAAAGGC 151 CGGGTAACAA AGTCTCATCG TCCTCCAACC TAGGGCTTTC CTTTCCGCTT 201 TTTTTTTCTT CTTCTCCTCC AAACAAGACC CAACCATACA CACCCACACA 251 GACAGAAGAA AAAGTGTAAG GATGAGCGTT GTGTCGTTTT TTTTTTTTTT 301 TTTTTTTTTT TTGGCGGAGA ATGTGTGCAC GTGCACAGAC ACACACGGGA 351 GCGGCTGTGC CTCCGTATAC GGCAACTGCC ACGACAACCG AGGGCACAGA 401 TACACGAGGT TATGTCAAAG AGGCGTGCTG GCCTGGGGGG GGGAGGCTGC 451 GGATGCCTGA TACTGGGGCC TGATACTGAG CCCCAAGGCT CAGTCTCGGT 501 CTCTGTCTCA AGCTCAAGCC AATTCCTTCC GGGGAACCCA ACCACCTCCG 551 GATTTTTTCC GAAAGTATCC CCGAACGTCT ATGGATTATC CATGTATACA 601 CAGAACAGGG AGTGAGTGAG TGAGTGCGAA AAACGAAMAAA AAATACAGTA 651 AAACATAAMAC CAGAGATAGC AGGGAAAAGA GCCGTGGTGC GGCGCACTGC 701 GCGCCGCCCT GGGGACGGCG CCTCTCTCTA GTTCCCCCAG AAMAAAAGAGT 751 CACGTGTACA CAGCCGCAGC CGCAGCCGCA GCCGCAGTAT CTCCGTGTCA 801 CATAGATTGG ACTGAACTGG ACTAGACTAG ACTAGACTAG AGAGTAGACG 851 AGAATAGACG AGACTAGACG CTCTGGCGTT TCAGATAACA CCAACACTAT 901 CTATGTTATC ATTACACACA CGATACGTAA TACGTTGGGG CTCCAGCGGT

951 CAAGGTTGGG GGTGTGGCCC ACATACGTAA CGTCTCGCCC TACACCATAC 1001 ACGGCATTTT TGTCTGCCTG CCGGCTTTGG CTTGCGCTTT GGTACTTGGT 1051 ATTTTTTCCT CTTTCTTTTT GTTTCCACCT TCAACAGACA TCTACGCTTT 1101 TACAGTTCAA GACATTGAAA TTTCAAGACT AGAACTAGAA TTAGAAATTG 1151 GAAATGAAAT TGGAATTATA ATAGATATTA GAAATAGATA GATATTAGAA 1201 TAGAGATAGA TATTCGAGTA ATAGAAAGGA CAAAAGTCAG GAAGAAGAAA 1251 ACTTAGGGCG AGCGAAGCTG CCGTATTAAT CTATTGGAAA ACTGAAATAC 1301 TAGGTTTCAG AGAAGAAGAA CAAACAAAAA GCGCAATAAC CAGCACTTTA 1351 TCCAAGTTAC AAGTGTGAGT GAGTGTATAT CTGCAAGCAA GGTGTGATTG 1401 AGTGAGTGAT CCGCTTGTGA TGGATTCTGT CGCTGATAGC ACCCTTGTTT 1451 CCAAAGCTGT AGCACAGCCT TCGCCGCATC ATGCTGTGAT AAAGCGTGAA 1501 CATGAGCAGG AAAGAGAAAG ACAAATAGAA GCCGAAGCAG AGGCAGAAGC 1551 AGAGGCAGAA GCAGAAGCAG AAACAGAAAT AGA SEQ ID NO: 13 yku70::pTEF1>Sp.Cas9

GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCCGTTATAGATGATCTTTATGACTATCACATAAATTTTGTA ACCTTTTTCATTGGTTCAAAGGTTAAACCATTTGATGACACGACATTCGCAGATATCTTAAGGTGGG GATCAAAAGTTAATGACACTAAAAATTGGTTATATTCTCATGGTCCAAATACAAAACCCATAAATGC ATCGACTATTAAGTCTAAGGTCAAAAGGACAAAGGAAATAAATAGAGTGAAATTTCGCTGTCCTITT AATATTAGACGAAAGAGCAGACTTTGTTGTTTCTGTTAGTGGATACACAATTATATCTCATGAGATT CCTGCATCGAAATACAAGCTTATATATGATAATGGTACGGTCAAACAAGAAGCGTACTCCCGTCGTG AATATCTTGATGCGGAAACTGGAGAAGTGGTACCAAATGACGAACTTGCAAAAACCTTTTCATITTG GAGATGAAATAATTGAGTTGTCTGAGGAAGAGAACTCACAAATTCAAAACATATACGGAAATTATG

ACTCATTTTTGAAGCTAATAGGATTTAGATCTACCGAGGAATGCTTATGTTTTTACAATAATATCGAC GCTCGTCCAACGCCGGCGGACCTcgaatccttacatcacacccaatececcacaagtgateccecacacaccatagette aaaatgtttctactccttttttactettecagatttteteggactecgegcategecgtaccactteaaaacacccaagceacageatac taaatttcccctetttettectetagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctegtttcttttt cttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaaatttttttttttgatttttttctctttogatgaccteccatt gatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgctcattaga aagaaagcatagcaaACCTCCCGCGACCTCCAAAATCGAACTACCTTCACAATGGATAAGAAATACTCTA

TCGGTTTGGATATTGGTACTAACTCCGTTGGTTGGGCCGTTATCACTGATGAATACAAGGTTCCATC TAAGAAGTTCAAAGTTTTGGGTAACACTGATAGACACTCTATCAAGAAGAACTTGATTGGTGCTTTG TTATTTGACTCTGGTGAAACCGCTGAGGCTACCCGTTTAMAAAGAACTGCTAGACGTAGATACACCC GTCGTAAAAACAGAATCTGTTATTTGCAAGAGATCTTCTCCAACGAAATGGCTAAGGTTGACGACTC TTTTTTCCATAGATTAGAAGAATCTTTCTTAGTTGAAGAAGATAAGAAGCACGAACGTCATCCAATC TTCGGTAACATTGTCGACGAAGTTGCTTACCATGAAAAGTACCCAACTATCTATCACTTGAGAAAGA AATTGGTTGATTCTACTGACAAAGCCGACTTGAGATTGATCTACTTGGCTTTAGCTCATATGATCAA ATTCCGTGGTCATTTTITAATTGAAGGTGATTTGAACCCAGACAACTCTGACGTTGATAAATTGTTCA TCCAATTGGTTCAAACCTATAACCAATTGTTTGAAGAAAACCCAATTAACGCTTCTGGTGTTGATGCT AAGGCTATCTTGTCTGCTAGATTGTCTAAATCTAGAAGATTGGAAAACTTAATTGCTCAATTGCCAG GTGAAAAAAAAAACGGTTTGTTCGGTAATTTGATTGCTTTATCCTTGGGTTTGACCCCAAATTTCAA GTCCAACTTTGATTTGGCTGAAGATGCCAAGTTGCAATTGTCTAAGGATACTTACGATGATGATTTA GATAACTTATTGGCTCAAATTGGTGATCAATACGCTGATTTGTTTTTAGCTGCCAAGAATTTGTCCGA CGCCATTTTGTTGTCTGACATCTTGAGAGTCAACACTGAAATTACCAAGGCCCCTTTGTCTGCTTCTA TGATTAAGAGATATGACGAACACCACCAAGACTTGACCTTGTTGAAGGCTTTGGTTAGACAACAATT ACCTGAAAAGTATAAGGAAATTTTTTTCGACCAATCTAAGAACGGTTACGCTGGTTACATTGACGGT GGTGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAATTCATCAAACCAATCTTGGAAAAGATGGACGGTACTGAA GAATTGTTAGTTAAATTGAACAGAGAAGACTTGTTGAGAAAACAAAGAACCTTTGACAACGGTTCC ATTCCTCACCAAATCCACTTGGGTGAGTTACACGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGATTTCTACCCATT CTTAAAGGACAACCGTGAAAAGATTGAAAAGATTTTGACCTTCAGAATTCCATACTACGTCGGTCCT TTGGCTCGTGGTAACTCCAGATTCGCCTGGATGACTAGAAAGTCCGAAGAAACTATTACTCCATGGA ACTTCGAAGAAGTCGTTGACAAGGGTGCTTCTGCTCAATCCTTTATCGAAAGAATGACCAACTTCGA CAAAAACTTGCCAAACGAAAAAGTCTTGCCAAAGCACTCTTTGTTGTATGAATACTITTACTGTITATA ATGAATTGACTAAAGTTAAGTACGTTACTGAAGGTATGAGAAAACCAGCTTTTITATCTGGTGAACA AAAAAAAGCTATCGTCGATTTGTTGTTCAAAACTAACCGTAAAGTTACCGTCAAGCAATTGAAGGAA GATTACTTCAAGAAGATTGAATGTTTTGACTCCGTCGAAATCTCCGGTGTTGAAGACAGATTCAATG CTTCTTTGGGTACTTACCACGACTTGTTGAAAATTATCAAGGACAAGGATTTCTTAGATAACGAAGA AAACGAAGACATTTTGGAAGATATTGTCTTGACTTTGACTTTGTTCGAAGATAGAGAAATGATTGAA GAAAGATTGAAGACTTATGCTCATTTGTTCGACGATAAGGTCATGAAGCAATTAAAGAGAAGACGT TACACTGGTTGGGGTAGATTGTCTAGAAAATTGATTAACGGTATCCGTGATAAACAATCTGGTAAG ACCATCTTGGATTTCTTAAAGTCTGATGGTTTTGCCAACAGAAACTTCATGCAATTGATCCACGACG ACTCTTTGACTTTCAAGGAGGACATTCAAAAGGCTCAAGTTTCTGGTCAAGGTGACTCTTTGCATGA ACACATTGCCAACTTGGCTGGTTCTCCAGCTATTAAGAAGGGTATCTTGCAAACTGTTAAGGTTGTT GATGAATTAGTTAAGGTCATGGGTAGACACAAGCCAGAAAACATCGTCATCGAAATGGCTAGAGA AAACCAAACTACTCAAAAGGGTCAAAAGAATTCTAGAGAAAGAATGAAGAGAATTGAGGAAGGTA TTAAGGAATTAGGTTCCCAAATTTTGAAGGAACATCCAGTCGAAAACACTCAATTGCAAAACGAAA AATTGTACTTGTACTACTTACAAAACGGTAGAGATATGTATGTCGACCAAGAGTTGGACATCAACAG ATTGTCCGACTACGATGTTGATCACATCGTTCCACAATCCTTCTTAMAGGACGACTCTATCGACAACA AGGTCTTAACCAGATCCGACAAAAACAGAGGTAAGTCTGACAACGTTCCATCCGAAGAAGTTGTTA AAAAGATGAAGAACTACTGGAGACAATTGTTGAACGCCAAATTGATCACTCAAAGAAAGTTCGATA ATTTGACCAAGGCTGAAAGAGGTGGTTTGTCTGAATTGGATAAGGCTGGTTTTATTAAMAAGACAAT TGGTTGAGACTAGACAAATCACCAAGCATGTCGCTCAAATTTTAGATTCCAGAATGAACACTAAATA CGACGAAAACGATAAGTTAATTAGAGAAGTTAAGGTTATTACCTTGAAGTCTAAGTTGGTTTCTGAT TTCAGAAAGGACTTCCAATTTTACAAGGTCAGAGAAATTAACAACTACCATCACGCTCATGATGCTT ACTTGAACGCCGTTGTTGGTACCGCTTTGATTAMAAAGTACCCAAAGTTGGAATCCGAATTTGTCTA CGGTGACTACAAGGTCTACGATGTCAGAAAAATGATCGCTAAGTCCGAACAAGAGATTGGTAAGG CTACTGCCAAGTACTTCTTTTACTCTAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATCACTTTAGCTAACG GTGAAATTCGTAAGAGACCATTGATTGAAACCAACGGTGAGACTGGTGAAATCGTTTGGGATAAG GGTCGTGATTTCGCTACTGTTAGAAAGGTCTTATCTATGCCACAAGTTAACATCGTCAAGAAAACCG AAGTTCAAACTGGTGGTTTTTCTAAGGAATCTATCTTGCCAAAAAGAAACTCTGATAAATTGATTGC TAGAAAGAAGGATTGGGACCCAAAGAAGTACGGTGGTTTCGATTCCCCAACCGTCGCTTACTCCGT CTTGGTTGTCGCTAAAGTTGAAAAGGGTAAGTCCAAGAAATTGAAGTCTGTTAAGGAATTGTTGGG TATCACTATCATGGAAAGATCTTCCTTCGAAAAGAACCCAATCGATTTTTTAGAGGCCAAGGGTTAT AAGGAAGTTAAAAAGGACTTAATTATTAAGTTGCCAAAGTACTCTTTGTTCGAATTAGAAAACGGTA GAAAAAGAATGTTGGCCTCTGCTGGTGAGTTGCAAAAAGGTAACGAATTGGCCTTGCCATCTAAGT ATGTTAACTTTTTGTACTTGGCCTCTCATTACGAGAAGTTGAAGGGTTCCCCAGAAGATAACGAACA AAAGCAATTGTTCGTCGAACAACACAAACATTACTTGGATGAAATTATCGAACAAATCTCCGAGTTT TCCAAACGTGTTATCTTGGCTGACGCCAATTTGGATAAGGTTTTGTCTGCTTATAATAAGCATAGAG ATAAGCCAATTAGAGAACAAGCCGAGAACATCATTCACTTGTTCACTTTGACTAATTTAGGTGCTCC AGCTGCCTTCAAATATTTCGACACCACCATTGATAGAAAGAGATACACCTCCACTAAGGAAGTCTTG GATGCCACCTTGATTCACCAATCTATCACTGGTTTGTACGAAACTAGAATCGATTTGTCTCAATTAGG TGGTGATTCCCGTGCCGACCCAAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAAACAGGCCCCTTTTCCTITTGTCGAT ATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGA AGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATITTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGT TATTTATATTTCAAATTTTTCITTTITITTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAA CCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGCATCCCCGCGTGCTTGGCCGEGCCGTTTAATCAGCGCCCAGAGACTA GCACTGAATGATCAACGGGTAGTTCACACGATGCACGAGCGCAACGCTCACAATGACAGTCTGGAC ATCAATAGTCACACTACAGAAGGTGATCTCTCAACTTCAGCAGACCATAGCGTGTAATAAATGCATA ATTATTTTTCTCTAAAAAAAACTCAGCTGAAATTTTATATAAGTACTACATTTTATATACATATTACAT ACTGAACAATAAGCGCGTTTGACATTTTAATTTTCGAAGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAGTCC CCCAATAGTTCCCCCACACACCATGCTTCAAAAACGCACTGTACTCCTTTITACTCTTCCGGATTTTCT CGGACTCTCCGCATCGCCGCACGAGCCAAGCCACACCCACACACCTCATACCATGTITCCCCTCTITG ACTCTITCGTGCGGCTCCATTACCCGCATGAAACTGTATAAMAAGTAACAAAAGACTATTTCGTITCIT TTTCTTTGTCGGAAAAGGCAAAAAAAAAAATTTITATCACATTTCTTTITCITGAAAATIIIIIITGGG ATTTIITCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAAAGGTCTCCCGTTTTCCAAGTTIT AATTTGTTCCTCTTGTTITAGTCATTCTTCTTCTCAGCATTGGTCAATTAGAAAGAGAGCATAGCAAAC TGATCTAAGTTTTAATTACCATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTG ATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTITC AGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAMATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAA GATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGG AATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGC CTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCEGCC GATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGG CGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCG TCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCC GGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGG TCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTITCTGGA GGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCA GGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTG ACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCC GGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGECCETCTGGACCGATGGCTGTGTAGA AGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGGGAAATT GATAAGACTTTTCTAGTTGCATATCTTTTATATITAAATCTTATCTATTAGTTAATTIITTGTAATITAT CCTTATATAGTCTGGTTATTCTAAAATATCATTTCAGTATCTAAAATAGTTCTITTITIIITIITTGAGTTAG ATTTITATGGGGGAGAGTTGAAGTGTTGAATTTTCCCACTITGCTTCGGGATTGTGGGTCATTCTGT CGATAACTGATATCACATCATCAATAGAACCTCTTAGATGCACGAGCGCAACGCTCACAATTAATCA GCGCCCAGAGACTAGCACTGAATGATCAACGGGTAGTTCACACAGGTCCGCCEGCGTTGGACGAG CGCTATCGTATACCATTTATAGATGAAGTCAGGAAACTACCTACTITATCGAGCTATCCAGAACTACT AGAAAGTGATGATTATCAAGTACTCAGTAGAGTCACTGAAACGCTCGTGAATTTTTTCAATITGAAA AATGGGTACAAGCCTTCTGATTACCACAGCCCAGCGCTTCAAAGACACTTCACGGTACTCAGAGAGT ATCTTCTCCAGATTGAAAGTAAGGAAACTAAAGATCAAGATGAAGATGACGAAACTCTTCTGAAAG TCAAACAGATTCACGAAAGAATTGCTGCTTCTGCTCAATCAGATGATCCTAAACAGCAAAGACTAGT AAAGTATTTGAAACTATGGAATTCATATTACAATCGCTATAATAATTTGGAAATTGAATCAAAACCA AAACAGAATAAACGGAGTAAATTTAATATATAATATATAATAATATTCTATCGGCGGTTTAAACGCG

TGGCCGTGCCGTC SEQ ID NO: 14 Plasmídeo de gRNA

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTT GTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCETCAGCGEGTETTEGCEGGCTE TCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCAAATACACATCATCGT CCTACAAGTTCATCAAAGTGTTGGACAGACAACTATACCAGCATGGATCTCTTGTATCGGTTCTIITC TCCCGCTCTCTCGCAATAACAATGAACACTGGGTCAATCATAGCCTACACAGGTGAACAGAGTAGC GTTTATACAGGGTTTATACGGTGATTCCTACGGCAAAAATTTTTCATTTCTAMAAMAAAAAAGAAAMA ATTTITCTTTCCAACGCTAGAAGGAAAAGAAAAATCTAATTAAATTGATTTGGTGATTTTCTGAGAGT TCCCTTTTTCATATATCGAATTTTGAATATAAAAGGAGATCGAAAAAATTTTITCTATTCAATCTGTTTIT CTGGTTTITATTTGATAGTTTTTITGTGTATTATTATTATGGATTAGTACTGGTTTATATGGGTTTITCT GTATAACTTCTITITATTITAGTITGTITAATCTTATITTGAGTTACATTATAGTTCCCTAACTGCAAGA GAAGTAACATTAAAAATGACCACTCTTGACGACACGGCTTACCGGTACCGCACCAGTGTCCCGGGG GACGCCGAGGCCATCGAGGCACTGGATGGGTCCTTCACCACCGACACCGTCTTCCGCGTCACCGCC ACCGGGGACGGCTTCACCCTGCGGGAGGETECCGGTEGACCCEGCCCCTGACCAAGGTGTTCCCCGA CGACGAATCGGACGACGAATCGGACGCCGGGGAGGACGGCGACCCGGACTCCCEGGACGTTCEGTCE GCGTACGGGGACGACGGCGACCTGGCGGECTTCGTGGTCGTCTCGTACTCCGGCTGGAACEGCCG GCTGACCGTCGAGGACATCGAGGTCGCCCCEGGAGCACCEGGGEGCACEGEGTCEGECECECETTE ATGGGGCTCGCGACGGAGTTCGCCCGCEAGCEGEGCECEGEGCACCTCTGGCTGGAGGTCACCAA CGTCAACGCACCGGCGATCCACGCGTACCGGCEGATGGGGETTCACCCTCTGCGGCCTGGACACEGC CCTGTACGACGGCACCGCCTCGGACGGCGAGCAGGCGCTCTACATGAGCATGCCCTGCCCCTGAGT TTAACTTGATACTACTAGATTTTITCTCTTCATTTATAAAATTTITTGGTTATAATTGAAGCTTTAGAAG TATGAAAAAATCCTTTTTITITCATTCTTTGCAACCAAAATAAGAAGCTTCTTTITTATTCATTGAAATGAT GAATATAAACCTAACAAAAGAAAAAGACTCGAATATCAAACATTAAAAAAAAATAAAAGAGGTTAT CTGTTTTCCCATTTAGTTGGAGTTTGCATTTTCTAATAGATAGAACTCTCAATTAATGTGGATTTAGTT TCTCTGTTCGTTTIIITITGTTTTGTTCTCACTGTATTTACATTTCTATTTAGTATTTAGTTATTCATATA ATCTTAACTTGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGT AAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGC CGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGT TTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCA GGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGC ACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCTCTTTGAAAAGA TAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAG GTGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTITTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGG TGCGCATTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAA GTTGGTGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCGCAGTTCCCTTG GCGTACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA GTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTITIITGTTITTITATGTCTCAGCTTTTGTTCCCTITTAGTGAGGGTT AATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC CACACAACATAGGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGGTAACTC ACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGGGATCCGATC TCCTTTCATTTCTGATAAAAGTAAGGCTTCTCTATTTACCTTTTAACCTACATATTCATAGTTGGAAGT TATCCTTCTAAGTACGTATACAATATTAATTCAACGTAAAAACAAAACTTACTGTAAATATGTGTAAA AAAAATCTATTAAATTCATGGCAGTTTCAAGAAAAGAAAACTATTATGGTCTGGTCACGTGTATACA AATTATTAATTTTAAAACTATATAATTTATTATTTTTITATTITTGAAGTTTAGAGTAATTITTAGTAGTAT TTTATATTTTAAATAAATATGCTTTAAATTTTTACTTAATATTTTATTATTTTTAAMATACAACGTTTITAT TTAAAACAAAATTATAAGTTAAAAAGTTGTTCCGAAAGTAAAATATATTTTATGGGTTTTACAAAAA TAAATTATTTTTAATGTATTTTTTTAATTATATTTITTGTATGTAATTATATCCACAGGTATTATGTTGAA TTTAGCTGTTTTAGTTTACCTGTGTGGTACTATGATTTTTITTAGAACTCTCCTCTTAGAAATAGGTGGT GTTGCGGTTGACTTTTAACGATATATCATTTTCAATTTATTTATTTTAMAGTGACATAGAGAGATTCC TTTTAATTTTTTAATTTTTATTTTCAATAATTTTAMAAATGGGGGACTTTTAAATTGGAACAAAATGAA AAATATCTGTTATACGTGCAACTGAATTTTACTGACCTTAAAGGACTATCTCGAACTTGGTTCGGAA ATCCTTGAAATGATTGATATTTTGGTGGATTTTCTCTGATTTTCAAACAAGTAGTATTTTATTTAATAT TTATTATATTTITTTACATTTTTITATATTTITITATTGTTTGGAAGGTAAAGCAACAATTACTTTCAAAA TATATAAATCAAACTGAAATACTTAATAAGAGACAAATAACATTCAAGAATCAAATACTGGGTTATT AATCAAAAGATCTCTCTACATGCGCCCAAATTCACTATTTAAATTTACTATACCACTGACAGAATATA TGAACCCAGATTAAGTAGCCAGAGGCTCTTCCACTATATTGAGTATATAGCCTTACATATTTTCTGCG CATAATTTACTGATGTAAAATAAACAAAAATAGTTAGTTTGTAGTTATGAAAAAAGGCTTTTGGAAA ATGCGAAATACGTGTTATTTAAGGTTAATCAACAAAACGCATATCCATAGTGGATAGTTGGATAAAA CTTCAATTGATGCGGCCGCCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGEGEGAGAGGCGGTTTGCGTAT TGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCEGCGAGCGGTA TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATA GGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCETGC CGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTITCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGT AGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGC CCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCC ACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCT TGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGC CAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTG GTTTTIITTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCIT TTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATC AAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATG AGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATIT CGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTG GCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCA GCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAA TTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT ACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAA GGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCEGTTGT CAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTC ATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTT TAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAMMACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAG ATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTITC TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGT TGAATACTCATACTCTTCCTITITCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG CCACCTGAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTIIT CAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAA CGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAMA GAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAAT CTATACTTCTITTITGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTATTTTTCTAACAAAGCATCTTAGAT TACTTTITITITCTCCTITGTGCGCTCTATAATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTA AGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCATAAMAAAAMAGCCTGACTCCACTTCCCGC GTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCT ATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCA GAAAATTATGAACGGTTTCITCTATITTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTA TTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTITTTGTCTAMAGAGTAATACTAGAGATA AACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGGGTAGGT TATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGG TATTCGCAATATTTTAGTAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTITGAAAGTGCGTCTTCAG AGCGCTTTTGGTTTTCAMAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATA GGAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAMATGCAACGCGAGCTGCGCACATACAGC TCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCCTGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCAT AGTGCGTGTTTATGCTTAAATGCGTACTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGT ACCTCCTGTGATATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTG TTCTATATGCTGCCACTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATITCCTITGATATIGG ATCATATTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTITC

GTC SEQ ID NO: 15 Herceptin otimizado com códon HC

ACAGAAATTTCTAAAGAGAACCAAATTCACCCCAGAAACAACCGCA CAAATACGACATCCATCCACCTTTCTTTTATCTTOTITITCOTGATOT GATAATTAGTTTCATATACAATACGTAGAAACAGGCGCACAGCACC CAGACCTGGCTTCTGCCCCAGTGTATAAGCAATGTAGCATAATTG GAAAAAAAAACGAAAAATACCGAAAATAAGTGGGAAGCTGGGCCA CAGGAGTGGGGCGGGATGCGACTGGTTCTGAGCGGGACCGGGT AATAAGGTTGAAAAACTTTGAATTGATGGAATAAGAAACTTCTTTCT TTTCGCTGGCGGGAGAAGGAAAAAAAAAATTTTTITTTITCCITCTG TTTAGTACTGGAACATTGAGAAGGCGTGTCAATTTTGAATAATTAG AGTGGTCAAAAAAATTTTTTTTGCTTGGGATACCCTTTTTCGATAAT GTAAATTTTTTTTGAATATAAAAGGAGATTGAAAAATTTTTTCTAGC AGAAATGTTTTCAAGTTTTAATTGCAAGTTTCGTTTGAGTATTCAGT TGTATTTTAGTTGATTTGTAGTTTATTTACTAGTATTCTCATAGTTCOT AACTCCAAGAGAAGTAACATTAAAGATGCGTTTTCCATCTATTITTTA CTGCTGTGTTGTTTGCAGCCTCAAGTGCTTTAGCTGAGGTACAATT AGTGGAGTCAGGTGGTGGTTTAGTGCAACCCGGTGGATCTTTGAG ACTATCATGCGCAGCGAGTGGTTTCAACATTAAGGACACATATATC CATTGGGTAAGGCAAGCTCCAGGTAAAGGTTTGGAATGGGTGGCT AGAATTTATCCAACTAATGGTTACACTCGTTACGCTGATTCTGTTA AGGGAAGATTCACTATCTCCGCCGATACCTCGAAGAACACGGCTT ATCTTCAAATGAACTCTCTTAGAGCGGAAGACACTGCGGTTTATTA TTGTTCAAGATGGGGTGGTGATGGGTTTTACGCTATGGATTATTG

GGGTCAGGGAACGCTTGTGACTGTTTCGTCAGCTTCAACTAAGGG TCCCTCAGTATTCCCCoTAGCOTCCCOTCTAGTAAGTCAACGTCTGG

AGGTACGGCAGCACTTGGTTGTTTGGTGAAGGACTATTTCCCAGA ACCTGTCACCGTGTCGTGGAATAGTGGTGCTCTAACCTCGGGAGT GCACACATTCCCTGCCGTATTGCAATCTTCTGGTTTGTATAGTTTA TCTTCAGTCGTCACCGTTCCATCCTCCOTCATTAGGCACGCAAACTT ACATATGTAACGTCAACCATAAGCCATCGAACACCAAAGTAGATAA GAAAGTTGAACCGAAGTCATGTGATAAAACCCATACTTGTCCACCA TGTCCAGCGCCAGAATTATTAGGCGGTCCTTCAGTTTITCITTITTCOC CTCCAAAGCCCAAAGATACGCTAATGATCAGTCGTACGCCAGAAG TTACGTGTGTAGTCGTTGATGTTAGTCATGAGGACCCGGAAGTGA AATTCAACTGGTACGTGGATGGAGTCGAAGTACACAATGCTAAAA CCAAACCAAGGGAAGAACAATACAATTCTACTTACCGTGTTGTTTC TGTATTAACGGTTTTACATCAGGACTGGTTAAACGGGAAAGAATAT AAGTGCAAGGTTTCCAACAAAGCTTTACCCGCTCCTATTGAAAAGA CAATCTCGAAGGCTAAAGGTCAACCCCGTGAACCTCAGGTTTACA CGTTGCCTCCATCGCGTGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTTTCTTT GACCTGTCTAGTTAAGGGCTTCTATCCATCCGATATCGCTGTCGA ATGGGAGTCAAATGGTCAACCTGAGAATAACTATAAGACAACCCC ACCAGTTTTAGACTCCGATGGTTCTTTCTTTTTGTACTCTAAGTTGA CTGTAGATAAGTCGAGATGGCAACAAGGGAATGTATTTAGTTGTTC TGTCATGCATGAAGCCTTACACAATCACTATACGCAGAAGTCGTTA AGTTTATCACCAGGCAAGTAAAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAG TCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAAC GAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTAT AAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTG GAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTT GCAGTTTGAAAAATAACTACATGGATGATAAGAAAACATGGAGTAC AGTCACTTTGAGAACCTTCAATCAGCTGGTAACGTCTTCGTTAATT GGATACTCAAAAAAGATGGATAGCATGAATCACAAGATGGAAGGA AATGCGGGCCACGACCACAGTGATATGCATATGGGAGATGGAGA TGATACCTGTTCGATGAATATGCTATTTTCGTGGTCATACAAGAAT ACGTGTGTCGTCTTTGAATGGTGGCATATCAAGACCCTGCCTGGA

CTGAT SEQ ID NO: 16 Herceptin otimizado com códon LC

ACAGAAATTTCTAMAGAGAACCAAATTCACCCCAGAAACAACCGCACAAATACGACATCCATCCACC TITCTTITATCTTCTITITCTGATCTGATAATTAGTTTCATATACAATACGTAGAAACAGGCGCACAGC ACCCAGACCTGGCTTCTGCCCCAGTGTATAAGCAATGTAGCATAATTGGAAAAAAAAACGAAAAAT ACCGAAAATAAGTGGGAAGCTGGGCCACAGGAGTGGGGCGGGATGCGACTGGTTCTGAGCGGGA CCGGGTAATAAGGTTGAAAAACTTTGAATTGATGGAATAAGAAACTTCTITCTIITCGCTGGCGGGA GAAGGAAAAAAAAAATTTIITIIIITCCTTCTGTTTAGTACTGGAACATTGAGAAGGCGTGTCAATTTT GAATAATTAGAGTGGTCAAAAAAATTTTTTTTGCTTGGGATACCCTTTTTCGATAATGTAAATTITITT TTGAATATAAMAAGGAGATTGAAAAATTTTTTCTAGCAGAAATGTTTTCAAGTTTTAATTGCAAGTTTC GTTTGAGTATTCAGTTGTATTTTAGTTGATTTGTAGTTTATTTACTAGTATTCTCATAGTTCTAACTCC AAGAGAAGTAACATTAAAGATGCGTTTTCCATCTATTTTCACTGCTGTATTGTTTGCTGCATCCTCTG CATTGGCCGACATACAAATGACCCAAAGTCCATCTTCCTTATCCGCTTCTGTAGGTGATCGTGTAACT ATAACTTGTAGAGCTTCACAAGATGTTAATACTGCTGTGGCTTGGTATCAACAAMAAACCAGGCAAG GCACCTAAATTACTAATCTATTCTGCCTCTITITTGTACTCAGGCGTCCCTAGTAGATTCAGTGGTTCA AGGTCCGGAACTGATTTTACATTGACAATCAGTTCCCTACAACCGGAAGACTTCGCCACATACTATT GCCAGCAACACTACACCACCCCACCGACCTTTGGTCAAGGTACAAAAGTCGAAATTAAACGTACTGT GGCCGCCCCTTCGGTATITATITTCCCGCCTTCAGATGAGCAATTGAAGTCTGGCACAGCATCAGTA GTGTGTTTGCTTAATAACTTCTATCCAAGAGAGGCAAAGGTTCAGTGGAAAGTTGATAACGCTCTAC AATCGGGTAACTCTCAAGAATCTGTTACCGAACAAGACTCTAAGGATTCAACTTATTCGTTAAGTAG TACGTTGACATTGTCCAAAGCTGACTACGAGAAGCACAAAGTCTACGCCTGTGAAGTTACTCATCAA GGTCTATCTTCGCCTGTAACGAAGAGTTTCAATAGAGGTGAATGTTGAGAGTATGCTTCTCIIIIIIT TTGTAGGCCAGTGATAGGAAAGAACAATAGAATATAAATACGTCAGAATATAATAGATATGTTITT ATATTTAGACCTCGTACATAGGAATAATTGACGTTTTTTTTTGGCCAACATTTGAAATTITITITIGTT

ACCTCGCGCTGAGCCCAAACGGGCTCCACTACCCG SEQ ID NO: 17 Rituxan otimizado com códon HC

ACAGAAATTTCTAAAGAGAACCAAATTCACCCCAGAAACAACCGCACAAATACGACATCCATCCACC TTTCTTITATCTTCTITITCTGATCTGATAATTAGTTTCATATACAATACGTAGAAACAGGCGCACAGC ACCCAGACCTGGCTTCTGCCCCAGTGTATAAGCAATGTAGCATAATTGGAAAAAAAAACGAAAAAT ACCGAAAATAAGTGGGAAGCTGGGCCACAGGAGTGGGGCEGCGATGCGACTGGTTCTGAGCGGGA CCGGGTAATAAGGTTGAAAAACTTTGAATTGATGGAATAAGAAACTTCTITCITITCGCTGGCEGEGA GAAGGAAAAAAAAAATTTIITIIIITCCTTCTGTTTAGTACTGGAACATTGAGAAGGCGTGTCAATTTT GAATAATTAGAGTGGTCAAAAAAATTTTTTTTGCTTGGGATACCCTTTTTCGATAATGTAAATTITITT TTGAATATAAMAAGGAGATTGAAAAATTTTTTCTAGCAGAAATGTTTTCAAGTTTTAATTGCAAGTTTC GTTTGAGTATTCAGTTGTATTTTAGTTGATTTGTAGTTTATTTACTAGTATTCTCATAGTTCTAACTCC AAGAGAAGTAACATTAAAGATGCGTTTTCCATCTATTTITACTGCTGTCCTITITGCCGCGTCATCAG CTTTAGCCCAAGTTCAATTACAACAACCAGGTGCCGAGCTTGTCAAMACCAGGCGCTTCTGTCAAAAT GTCATGTAAGGCGTCAGGTTACACTTITACCTCATATAACATGCATTGGGTGAAACAGACTCCAGGT AGAGGTTTAGAGTGGATTGGAGCAATCTATCCAGGTAACGGAGACACTTCCTATAACCAAAAGTTT AAGGGGAAGGCAACTTTGACTGCAGATAAATCCTCGTCTACCGCATACATGCAATTGTCTTCGCTTA CATCAGAAGACTCAGCAGTTTACTATTGTGCTCGTAGTACTTACTATGGAGGGGACTGGTATTTCAA TGTGTGGGGTGCTGGCACCACTGTGACAGTTTCAGCAGCGTCAACAAAGGGCCCATCTGTTTTCCCC CTAGCTCCCTCATCTAAGTCCACAAGTGGAGGTACGGCAGCATTGGGTTGCTTAGTAAAAGATTACT TCCCTGAACCAGTGACTGTTTCATGGAACTCTGGTGCTTTGACTTCAGGTGTACACACCTTTCCAGCC GTCTTGCAATCCTCAGGTCTTTACTCTITATCTTCTGTTGTCACTGTGCCATCTTCTTCTITGGGTACTC AAACATACATTTGTAACGTCAACCACAAACCCTCCAACACCAAGGTTGATAAGAAGGCCGAACCTAA GAGTTGCGACAAAACACACACCTGTCCTCCCTGCCCAGCCCCAGAACTTCTTGGCEGTCCCAGTGTC TTTTITATTTCCACCGAAGCCAAAGGATACTCTAATGATTTCTCGTACTCCCGAAGTAACATGCGTCGT AGTAGATGTTTCACACGAAGATCCAGAGGTTAAATTCAACTGGTACGTAGATGGTGTGGAAGTACA TAACGCAAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTATAACTCTACCTACAGAGTTGTGAGTGTACTAAC AGTTTTACATCAAGATTGGCTTAATGGGAAGGAATACAAGTGTAAAGTCTCTAACAAAGCCTTACCT GCCCCTATTGAGAAGACAATCTCAAAGGCTAAAGGTCAACCCCGTGAACCTCAGGTTTACACATTGC CTCCTTCACGTGACGAACTTACGAAGAACCAAGTTAGTTTGACATGCTTGGTTAAAGGCTTCTACCC ATCGGATATAGCTGTGGAGTGGGAATCAAATGGACAACCTGAGAACAACTACAAGACAACACCAC CGGTTTTGGATTCTGACGGCTCATTCITCTTGTACTCTAMATTGACAGTCGATAAGTCTCGTTGGCAA CAGGGTAACGTTTTCTCATGTTCCGTGATGCATGAGGCCTTACATAACCACTACACCCAAAMAGTCTIT AAGTTTGTCACCCGGTAAGTAAAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTITTCTGCTTATITITITCAT CATAGTTTAGAACACTTITATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGT TTTATAAGTTACTTTITCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAMAG GTGCACACGCGTGGCTTTITCTTGAATITGCAGTTTGAAAMATAACTACATGGATGATAAGAAAACA TGGAGTACAGTCACTTTGAGAACCTTCAATCAGCTGGTAACGTCTTCGTTAATTGGATACTCAAAAMA AGATGGATAGCATGAATCACAAGATGGAAGGAAATGCGGGCCACGACCACAGTGATATGCATATG GGAGATGGAGATGATACCTGTTCGATGAATATGCTATTTTCGTGGTCATACAAGAATACGTGTGTC

GTCTTTGAATGGTGGCATATCAAGACCCTGCCTGGACTGAT SEQ ID NO: 18 Rituxan otimizado com códon LC

ACAGAAATTTCTAAAGAGAACCAAATTCACCCCAGAAACAACCGCACAAATACGACATCCATCCACC TTTCTTITATCTTCTITITCTGATCTGATAATTAGTTTCATATACAATACGTAGAAACAGGCGCACAGC ACCCAGACCTGGCTTCTGCCCCAGTGTATAAGCAATGTAGCATAATTGGAAAAAAAAACGAAAAAT ACCGAAAATAAGTGGGAAGCTGGGCCACAGGAGTGGGGCEGCGATGCGACTGGTTCTGAGCGGGA CCGGGTAATAAGGTTGAAAAACTTTGAATTGATGGAATAAGAAACTTCTITCITITCGCTGGCEGEGA GAAGGAAAAAAAAAATTTIITIIIITCCTTCTGTTTAGTACTGGAACATTGAGAAGGCGTGTCAATTTT GAATAATTAGAGTGGTCAAAAAAATTTTTTTTGCTTGGGATACCCTTTTTCGATAATGTAAATTITITT TTGAATATAAMAAGGAGATTGAAAAATTTTTTCTAGCAGAAATGTTTTCAAGTTTTAATTGCAAGTTTC GTTTGAGTATTCAGTTGTATTTTAGTTGATTTGTAGTTTATTTACTAGTATTCTCATAGTTCTAACTCC AAGAGAAGTAACATTAAAGATGCGTTTTCCATCTATTTTCACTGCCGTITTATITGCTGCGTCGTCTG CTTTAGCCCAGATCGTGCTAAGTCAATCGCCCGCCATCCTITCAGCATCTCCCGGTGAAAAGGTGAC AATGACCTGCAGAGCCTCTTCGTCCGTCAGTTACATACATTGGTTCCAACAAAAACCAGGTTCTTCAC CAAAACCCTGGATCTACGCTACGTCTAATCTTGCATCTGGTGTCCCTGTTAGATITTAGTGGATCGGG TAGTGGCACGTCCTATTCCTTGACAATATCGCGTGTTGAAGCAGAAGATGCCGCGACATATTACTGT CAGCAATGGACATCAAACCCACCTACATTCGGTGGTGGTACTAAGCTTGAAATAAAAMAGAACCGTT GCCGCACCATCTGTTTTCATCTTTCCTCCTTCTGATGAACAGTTAMAGAGTGGTACAGCATCGGTTGT CTGCTTATTGAACAATTTCTATCCAAGAGAAGCTAAGGTTCAATGGAAGGTTGATAATGCACTTCAA TCTGGTAATTCTCAAGAGTCTGTTACCGAACAAGACTCTAAAGATTCCACATACTCATTGAGTTCGAC ACTAACATTATCTAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTATATGCTTGTGAAGTAACACATCAGGG TTTATCTAGTCCAGTCACGAAATCTTTCAACAGAGGGGAGTGTTGAGAGTATGCTTCTCTITIIITIT GTAGGCCAGTGATAGGAAAGAACAATAGAATATAAATACGTCAGAATATAATAGATATGTTTITAT ATTTAGACCTCGTACATAGGAATAATTGACGTTTTTITTTGGCCAACATTTGAAATITTTITIITGITAC CTCGCGCTGAGCCCAMACGGGCTCCACTACCCG

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para modificar um local alvo em um genoma da célula hospedeira de Kluyveromyces, o método caracterizado por compreender: (a) colocar uma célula hospedeira de Kluyveromyces, que tem uma redução da atividade da ligação das extremidades não homó- logas (NHEJ), em contato com: (i). uma nuclease capaz de clivagem do local alvo; e (ii), uma molécula de DNA doador compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo, em que a molécula de DNA doador é capaz de recombinação homóloga no local alvo clivado, através da qual a recombinação homóloga na célula hos- pedeira resulta em integração do ácido nucleico linear de doador no local alvo; e (b) selecionando uma célula hospedeira transformada em que a molécula de DNA doador é integrada ao local alvo e a célula hospedeira secreta o polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma endonuclease de DNA guiada pelo RNA e o método inclui ainda introduzir na célula um RNA guia capaz de guiar a endonucleases guiada pelo RNA para o local alvo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o RNA guia está em um plasmídeo compreendendo o elemento de estabilidade derivado de K. marxianus.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a endonuclease de DNA guiada pelo RNA é a endo- nuclease Cas9.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a nuclease é pré-integrado no genoma.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de introdução de um RNA guia para dentro da célula é realizada ao colocar a célula hospe- deira em contato com: (i) um ácido nucleico linear compreendendo (1) uma sequência de ácido nucleico codificando o RNA guia ou (2) Oo RNA guia.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o RNA guia é colocado entre um promotor e um terminador, e o RNA guia é, transitoriamente, expresso a partir do ácido nucleico linear na célula hospedeira.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico linear compreende oligonucleotídeos tracrRNA e crRNA anelados.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colocar a célu- la em contato com um ácido nucleico linear capaz de recombinação homóloga com ele mesmo ou com um ou mais ácidos nucleicos linea- res adicionais em contato com a célula hospedeira, que na recombina- ção homóloga na célula hospedeira resulta na formação de um ácido nucleico circular extracromossômico compreendendo uma sequência de codificação para um marcador selecionável.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico circular extracromossômico compre- ende ainda o elemento de estabilidade derivado de K. marxianus.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que o elemento de estabilidade compreende uma se- quência da sequência de centrômero (CEN) pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2 e uma sequência de consenso da sequência de repli- cação autônoma (ARS) pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, carac- terizado pelo fato de que o elemento de estabilidade é pelo menos 90% idêntico a uma sequência menor que 750 bp de comprimento e compreendendo 202 a 876 resíduos da SEQ ID NO: 1.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o elemento de estabilida- de é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 1.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 9 a 13, caracterizado pelo fato de que ácido nucleico circular ex- tracromossômico compreende ainda uma sequência de codificação para um RNA guia capaz de guiar a nuclease para o local alvo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o ácido nucleico extracromossômico circular com- preende ainda uma sequência que codifica uma atividade de crRNA e uma atividade de tracrRNA.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a atividade de crRNA e a atividade de tracrRNA são expressadas como uma única molécula de RNA contígua.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma meganuclease.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a meganuclease é F-Cphl.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma cadeia leve de anticorpos, uma cadeia pesada de anticorpos ou uma cadeia leve de anticorpos ligada a uma cadeia pesada de anticorpos.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que compreende colocar a célula hospedeira em conta-

to com dois ácidos nucleicos doadores, um primeiro ácido nucleico do- ador codificando uma cadeia leve de anticorpos e um segundo ácido nucleico doador codificando uma cadeia pesada de anticorpos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, carac- terizado pelo fato de que compreende ainda a recuperação da célula hospedeira de Kluyveromyces que secreta um anticorpo de compri- mento completo formado a partir da cadeia pesada de anticorpos e da cadeia leve de anticorpos.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira recuperada pode ser capaz de secretar pelo menos 19 microgramas por mililitro do anticorpo de com- primento completo.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico doador é otimizado por códon de acordo com códons preferenciais de Kluyve- romyces.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira de Kluyveromyces é a célula hospedeira de K. marxianus.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a NHEJ é reduzida por integração do ácido nucleico codificando a nuclease nos locais YKU70 ou YKU80.

26. Célula hospedeira de Kluyveromyces caracterizada pelo fato de que é feita pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

27. Método para produzir e secretar um anticorpo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultura da célula hospedeira de Kluyveromyces como definida na reivindicação 26 em um meio de cultura contendo uma fon-

te de carbono para um primeiro período de tempo; (b) separar a célula hospedeira de Kluyveromyces do meio de cultura; (c) adicionar um meio de cultura contendo uma fonte de carbono para a célula hospedeira de Kluyveromyces separada; e (d) cultivar a célula hospedeira de Kluyveromyces sepa- rada no meio de cultura por um segundo período de tempo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento com- pleto.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, carac- terizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de pelo menos 3 dias.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 27 a 29, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura adicio- nado na etapa (c) é um meio de cultura fresco que não contêm anti- corpos produzidos na etapa (a).