ES2656892T3

ES2656892T3 - Microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico y procedimiento de producción de ácido quinolínico mediante su uso

Info

Publication number: ES2656892T3
Application number: ES13733832.3T
Authority: ES
Inventors: Yong Uk Shin; So Young Kim; In Kyung Heo; Ju Eun Kim; Sung Kwang Son; Jae Hee Lee; Ji Hyun Lee; Chang Gyeom Kim
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-03
Publication date: 2018-02-28
Anticipated expiration: 2033-01-03
Also published as: CN104160015A; EP2801612B1; MY171877A; US9534240B2; WO2013103246A2; EP2801612A2; KR101359844B1; BR112014016748B1; BR112014016748A2; KR20130080944A; CN104160015B; US20150037850A1; EP2801612A4; WO2013103246A3

Abstract

Un microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico, que expresa una proteína de fusión de Laspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce.

Description

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DESCRIPCION

Microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico y procedimiento de producción de ácido quinolínico mediante su uso

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico y un procedimiento para producir ácido quinolínico mediante su uso.

Descripción de la técnica relacionada

El ácido quinolínico, también denominado ácido 2,3-piridindicarboxílico, tiene una gran diversidad de aplicaciones como precursor de sustancias químicas sintéticas en la producción de productos medicinales o agrícolas, colorantes o similares.

El ácido quinolínico se puede preparar a través de procedimientos de síntesis química o biológica. Dado el uso de materiales no renovables derivados del petróleo como materia prima, los procedimientos de síntesis química están asociados a problemas medioambientales, los precios del petróleo, así como los costes unitarios de la extracción del petróleo.

Como ejemplo de un procedimiento de síntesis biológica representativo, se desvela un procedimiento para producir ácido quinolínico en una cepa de E. coli en la que se potencia la expresión de genes que codifican L-aspartato oxidasa (NadB) y quinolinato sintasa (NadA) clonando un plásmido que tiene diferentes números de copias de los dos genes en E. coli, del que se elimina la actividad quinolinato fosforibosiltransferasa (Eur. J. Biochem. 175, 221228 (1988), DE3826041). A este respecto, la concentración de ácido quinolínico producido es tan solo 500 mg/l o menos. La primera razón de esta baja producción de ácido quinolínico es la supresión transcripcional mediante NadR, que es un represor transcripcional relacionado con NAD de nadB que codifica L-aspartato oxidasa y nadA que codifica quinolinato sintasa. La segunda razón es la inhibición por retroalimentación de L-aspartato oxidasa, proteína NadB mediante NAD. Y la tercera razón es una ruta de biosíntesis débil para las fuentes de carbono para dar ácido L-aspártico en E.coli.

Para resolver la primera razón, en la patente coreana abierta No. 10-2012-0082673, se utiliza una cepa de microorganismo para aumentar la producción de ácido quinolínico a 5,5 g/l, en la que se sustituyen las regiones promotoras de L-aspartato oxidasa (NadB) y quinolinato sintasa (NadA), que son los genes de síntesis de quinolinato suprimidos al nivel transcripcional, por un promotor constitutivo y se potencia la ruta de biosíntesis de ácido L-aspártico.

La solicitud de patente europea No. 88101442.7 desvela un proceso para la preparación de ácido quinolínico utilizando microorganismos modificados por ingeniería genética. Para este fin, se aíslan y determinan primero secuencias de ADN que codifican para la correspondiente biosíntesis. Estas secuencias de ADN se insertan a continuación en plásmidos y los plásmidos así obtenidos se incorporan en organismos huésped.

La ruta de biosíntesis de ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico a través de un procedimiento de síntesis biológica es tal como se muestra en el siguiente esquema de reacción:

1) L-aspartato oxidasa (NadB)

Ácido L-aspártico + oxígeno <=> peróxido de hidrógeno + a-iminosuccinato + H+

2) quinolinato sintasa (NadA)

a-iminosuccinato + dihidroxiacetona fosfato <=> ácido quinolínico + fosfato + 2H2O

a-iminosuccinato como producto intermedio de la ruta de biosíntesis de ácido quinolínico es una sustancia inestable y se convierte en oxaloacetato a través de una reacción de desaminación natural en las células (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 257, No. 2, publicación del 25 de enero. pp. 626-632, 1982). En general, cuando se utiliza un metabolito intermedio inestable como sustrato, la baja frecuencia de colisión entre el sustrato y la enzima produce una gran cantidad de subproductos. Sin embargo, hasta ahora, no ha habido ninguna tentativa para resolver dicho problema en relación con la producción de ácido quinolínico.

Por otra parte, se ha empleado para diversos fines una tecnología de proteínas de fusión con la unión de enzimas o proteínas heterogéneas a través de un engarce de aminoácido para expresar una única proteína, como por ejemplo aumentando el nivel expresión de la proteína uniendo una proteína que presenta un bajo nivel de expresión con una proteína que presenta un alto nivel de expresión, aumentando el rendimiento de purificación de proteína preparando una proteína de fusión unida con una etiqueta o similar.

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Se sabe que el diseño del engarce es importante en la preparación de proteínas de fusión. En general, se ha venido utilizando frecuentemente un engarce helicoidal que tiene una estructura en hélice alfa o un engarce flexible que tiene flexibilidad estructural y, por ejemplo, se pueden diseñar y utilizar diversos engarces por combinación de los dos engarces de acuerdo con las características de la proteína de fusión que se vaya a conseguir.

Los autores de la presente invención han tratado de resolver la menor reacción debido a metabolitos inestables mediante la expresión de una proteína de fusión de NadB y NadA unidos a través de diversos tipos de engarces aminoácido y, en consecuencia, han observado que el ácido quinolínico se puede producir en un alto rendimiento por expresión de la proteína de fusión, en comparación con el rendimiento del procedimiento de producción biológica convencional, en virtud de lo cual han completado la presente invención.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico, que expresa una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir ácido quinolínico, que incluye las etapas de cultivar el microorganismo recombinante y recuperar el ácido quinolínico producido durante el cultivo.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 presenta la estructura de una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa de acuerdo con una realización específica de la presente invención;

FIG. 2 presenta una estructura de plásmido pPro-NBA, pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A o pNBFL4A; y

FIG. 3 presenta una estructura de pCPA que es un plásmido que expresa genes que codifican fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato aminotransferasa.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

En uno de sus aspectos, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico, que expresa una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce.

La L-aspartato oxidasa (en adelante, se hace referencia a ella como 'NadB') es una enzima que tiene actividad para oxidar ácido L-aspártico en ácido iminosuccínico y puede tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 42 o una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con ella.

[Actividad de L-aspartato oxidasa]

Ácido L-aspártico + fumarato <=> a-iminosuccinato + succinato + H+

o

La secuencia del gen nadB que codifica esta enzima se puede obtener a partir de la secuencia del genoma de Escherichia coli (GI: 89109380) tal como se publica en la bibliografía (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21) o la base de datos disponible en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) o el Banco de datos de ADN de Japón (DDbJ).

La quinolinato sintasa (en adelante se hace referencia a ella como 'NadA') es una enzima que tiene actividad para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido iminosuccínico y puede tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 43 o una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con ella.

[Actividad de quinolinato sintasa]

La secuencia del gen nadA que codifica esta enzima se puede obtener de la secuencia del genoma de Escherichia coli (gi: GI: 89109380) tal como se publica en la bibliografía (Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21) o la base de datos disponible en el NCBI o DDBJ.

Si se potencian las actividades de NadB y NadA, puede aumentar la acumulación de a-iminosuccinato como el precursor de ácido quinolínico y la biosíntesis de ácido quinolínico a partir de a-iminosuccinato en las células, aumentando así la producción de ácido quinolínico. Sin embargo, aunque se aumentan las actividades y los niveles de expresión de las dos enzimas (NadB y NadA), la baja frecuencia de colisión entre el sustrato y la enzima produce una gran cantidad de productos secundarios ya que a-iminosuccinato es un metabolito inestable. En consecuencia, es difícil producir eficientemente ácido quinolínico, según lo esperado. Para resolver este problema, en la presente

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invención, se unen NadB y NadA entre sí a través de un engarce y se expresan en una cepa en forma de una proteína de fusión, produciendo así ácido quinolínico en un alto rendimiento.

NadB y NadA pueden tener una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO. 42 y 43, respectivamente. Sin embargo, dependiendo de la especie o la cepa del microorganismo, puede haber diferencias en la secuencia de aminoácidos de proteínas que presentan la actividad y, por tanto, no se limitan a ellas. Es decir, siempre y cuando se proporcione NadB y NadA en forma de una proteína de fusión preparada por la unión entre sí a través de un engarce para contribuir a un aumento de la productividad de ácido quinolínico, pueden ser variantes mutantes o artificiales que tienen una secuencia de aminoácidos modificada como resultado de sustitución, deleción, inserción o adición de un aminoácido o varios aminoácidos en una o más posiciones de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 42 y 43. En el presente documento, el término “varios” puede variar dependiendo del tipo o posiciones de restos de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína y en los detalles. Puede ser de 2 a 20, específicamente de 2 a 10 y, más específicamente, de 2 a 5. Asimismo, las sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de aminoácidos pueden incluir mutantes de origen natural o variantes artificiales sobre la base de diferencias individuales y/o las diferencias ente especies del microorganismo que expresa el polipéptido.

Los polinucleótidos que codifican las enzimas NadB y NadA pueden ser polinucleótidos que codifican las proteínas que tienen 80 % o más de homología, específicamente 90 % o más de homología, más específicamente 95 % o más de homología, mucho más específicamente 97 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 42 y 43, siempre y cuando tengan actividades enzimáticas de NadB y NadA, tal como se muestra en el Esquema de Reacción anterior. Sobre todo, específicamente, los polinucleótidos pueden tener secuencias de polinucleótidos representadas por SEQ ID NO. 27 y SEQ ID NO. 28, respectivamente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "homología" se refiere a la semejanza entre dos secuencias de aminoácidos y se puede determinar a través de un procedimiento ampliamente conocido entre las personas especializadas en la técnica, BLAST 2.0, que calcula parámetros como la puntuación, la semejanza y la similitud.

La secuencia de polinucleótidos que codifica la enzima NadB o NadA puede ser la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO. 27 o SEQ ID NO. 28 o hibridarse con una sonda que se puede preparar a partir de la secuencia de polinucleótidos en “condiciones rigurosas” y puede ser una variante que codifica una proteína que funciona normalmente.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" significa condiciones que permiten hibridación específica entre polinucleótidos. En Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook y col., Editors, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) se desvela una descripción detallada y, por ejemplo, hibridación en un tampón de hibridación (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidona, 0,02% albúmina de suero bovino, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA) a 65 °C. SSC es cloruro sódico0,15 M / citrato sódico 0,15 M a pH 7. Tras la hibridación, se lava la membrana a la que se ha transferido el ADN con 2 x SSC a temperatura ambiente y después se lava con 0,1 a 0,5 x SSC/0,1 x SDS a 68 °C.

La proteína de fusión de la presente invención es un polipéptido, en el que se unen L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa que tienen diferentes actividades entre sí a través de un engarce de aminoácido y que tiene actividad de biosíntesis de ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico, tal como se expone en el siguiente Esquema de Reacción.

[Actividad de proteína de fusión]

Ácido L-aspártico + oxígeno + dihidroxiacetona fosfato <=> ácido quinolínico + fosfato + 2H2O + peróxido de hidrógeno

Si se potencia la actividad de la proteína de fusión, se mejora el índice de conversión de ácido quinolínico a partir de a-iminosuccinato, metabolito intermedio, produciendo así ácido quinolínico con una productividad mucho más alta que la productividad conseguida con la potenciación de las actividades de NadB y NadA por separado.

La proteína de fusión puede ser un polipéptido preparado por unión del término N de L-aspartato oxidasa y el término C de quinolinato sintasa a través de un engarce o un polipéptido preparado por unión del término C de L- aspartato oxidasa y el término N de quinolinato sintasa a través de un engarce y, específicamente, la proteína de fusión puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 47, 48, 49, 50, 51, 52 y 53.

El engarce está situado entre los polipéptidos NadB y NadA o entre los genes que los codifican y puede ser un engarce helicoidal o flexible. Por otra parte, como engarce, el engarce helicoidal o flexible puede utilizarse en solitario o en combinación. Como engarce helicoidal, se puede utilizar "EAAAK" o "EAAAR" y como engarce flexible, se pueden utilizar "GGSGGS", "GGGS", "GGSG" o "GS" pero no se limitan al ellos.

El engarce puede estar compuesto por 5 a 30 secuencia de aminoácidos y el engarce helicoidal o flexible puede

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utilizarse de forma simple o repetida.

De acuerdo con una realización específica, un engarce que contiene un engarce helicoidal puede ser LA(EAAAK)nAAA y un engarce que contiene el engarce flexible puede ser L(GGGS)nAAA. Preferentemente, n puede ser un número entero de 1 a 5.

De acuerdo con una realización específica, el engarce puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60 o una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con ella, pero no se limita a ellas.

El "microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico" de la presente invención es un microorganismo que puede producir y acumular ácido quinolínico desde una fuente de carbono en un medio y expresa la proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce, produciendo así ácido quinolínico con una alta productividad.

El microorganismo recombinante de la presente invención se puede preparar para expresar una proteína de fusión introduciendo un polinucleótido que codifica la proteína de fusión.

De acuerdo con una realización específica, el microorganismo recombinante de la presente invención puede prepararse por transformación utilizando un vector recombinante que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de fusión.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "transformación" significa que se introduce un gen en una célula huésped de manera que pueda expresarse en la célula huésped. El gen transformado puede localizarse en cualquier lugar sin limitación, ya se inserte en el cromosoma de una célula huésped o esté localizado fuera del cromosoma, siempre y cuando pueda expresarse en la célula huésped. Asimismo, puede introducirse el gen en cualquier forma, siempre y cuando pueda introducirse y expresarse en una célula huésped. Por ejemplo es posible introducir el gen en una célula huésped en forma de un casete de expresión que es una estructura de polinucleótido que incluye todos los elementos requeridos para auto-expresión. El casete de expresión comprende generalmente un promotor unido operativamente con el gen, una señal de terminación de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede presentarse en forma de un vector de expresión auto-replicable. Asimismo, es posible introducir el gen en una célula huésped en forma de una estructura de polinucleótido y puede estar unido operativamente a una secuencia requerida para la expresión en la célula huésped.

El vector recombinante es un medio para expresar la proteína de fusión introduciendo un ADN en una célula huésped para preparar un microorganismo que expresa la proteína de fusión de la presente invención y se puede utilizar un vector de expresión conocido, como por ejemplo un vector plásmido, un vector cósmido o un vector bacteriófago. Las personas especializadas en la técnica pueden preparar fácilmente el vector de acuerdo con cualquier procedimiento conocido aplicando la tecnología de recombinación de ADN.

Específicamente, el vector recombinante puede ser un vector plásmido pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A o pNBFL4A que tiene un el mapa de escisión de la FIG. 2 y más específicamente, el vector plásmido puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, respectivamente.

De acuerdo con una realización específica, el microorganismo que produce ácido quinolínico puede ser un microorganismo que pertenece a Enterbacter sp., Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providercia sp., Coryrebacterium sp. o Brevibacterium sp.. Específicamente un microorganismo que pertenece a Escherichia sp. y más específicamente E.coli, pero sin limitarse a ellos.

El microorganismo de la presente invención puede modificarse además para debilitar la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa, en comparación con la actividad endógena del mismo. En este sentido, la expresión “actividad endógena” significa la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa en un microorganismo nativo.

NadC tiene actividad para convertir ácido quinolínico en mononucleótido nicotinato y puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 44 o una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con ella. La secuencia del gen nadC que codifica esta enzima se puede obtener desde la secuencia del genoma de Escherichia coli (GI: 89106990), tal como se publica en la bibliografía (Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.) o la base de datos disponible en el NCBI o DDBJ.

[Actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa]

5-fosfo-a-D-ribosa 1-difosfato + ácido quinolínico + 2H+ <=> CO2 + difosfato + mononucleótido de nicotinato

Se puede acumular ácido quinolínico en las células debilitando la actividad de NadC. El debilitamiento de la actividad de la enzima se puede conseguir a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en 1) deleción parcial o total del gen que codifica la enzima, 2) modificación de la expresión de la secuencia de control de la expresión para reducir la expresión del gen (p.ej., reemplazamiento del promotor endógeno del gen con un promotor

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débil, 3) modificación de la secuencia del gen en el cromosoma para debilitar la actividad de la enzima y 4) combinaciones de los mismos. En un ejemplo específico de la presente invención, se separó nadC del genoma del microorganismo por recombinación homóloga.

Por otra parte, puede modificarse además el microorganismo de la presente invención para potenciar las actividades de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en fosfoenolpiruvato carboxilasa, L-aspartato aminotransferasa y la proteína de fusión de la presente invención, para potenciar la ruta de biosíntesis de ácido L- aspártico a partir de fosfoenolpiruvato.

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PPC) y L-aspartato aminotransferasa (AspC) tienen actividad para sintetizar ácido L-aspártico a partir de fosfoenolpiruvato y pueden tener una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 45 o 46 o una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con ella, respectivamente. La secuencia del gen ppc o aspC que codifica la enzima puede obtenerse a partir de la secuencia del genoma de Escherichia coli (gi: GI:89110074, GI:89107778), tal como se publica en la bibliografía (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.) o las bases de datos disponibles en el NCBI o DDBJ.

[Actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa]

fosfoenolpiruvato + CO2 ^ oxaloacetato + fosfato

[Actividad de L-aspartato aminotransferasa]

oxaloacetato + glutamato <=> Ácido L-aspártico + 2-cetoglutamato

Por lo tanto, si se potencian las actividades de PPC y AspC se puede mejorar la producción de ácido L-aspártico como un precursor de ácido quinolínico en células, aumentando así la producción de ácido quinolínico.

La potenciación de la actividad de la enzima puede conseguirse a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en 1) un procedimiento de aumentar el número de copias del gen que codifica la enzima, 2) un procedimiento de modificar la secuencia de control de expresión para aumentar la expresión del gen, 3) un procedimiento de modificar la secuencia del gen en el cromosoma para potenciar la actividad de enzima y 4) combinaciones de los mismos. En un ejemplo específico de la presente invención, se construyó un plásmido que comprende un gen que codifica la enzima y se introdujo en un microorganismo que produce ácido quinolínico, aumentando así el número de copias del gen e induciendo la potenciación de la actividad.

Para potenciar la actividad de la proteína de fusión, se puede sustituir el promotor endógeno del gen que codifica la proteína de fusión con un promotor fuerte o se puede introducir una mutación en los promotores para hacerlos más fuertes o se puede aumentar el número de copias del gen. Como promotor fuerte, se pueden utilizar en general pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJ1, pCysK, etc.

En un ejemplo específico de la presente invención, se sustituyeron los promotores de nadB y nadA con un promotor pPro constitutivo (SEQ ID NO. 32) para construir los genes nadB y nadA expresables constitutivos, que no son suprimidos por NadR como represor transcripcional para suprimir las expresiones de nadB y nadA con nivel NAD intracelular en forma de un plásmido y, a continuación, se introdujeron los plásmidos en microorganismos para inducir sobreexpresión de aspartato oxidasa y quinolinato sintasa. Asimismo, en un ejemplo específico de la presente invención, se sustituyó el promotor del gen que codifica NadB-L-NadA con el promotor pPro para inducir la sobreexpresión de NadB-L-NadA. A este respecto, el promotor pPro es un ejemplo únicamente para la resistencia a la inhibición por retroalimentación y para la potenciación de la expresión y el promotor de la presente invención no está limitado al mismo.

En otro aspecto más aún, la presente invención proporciona un procedimiento para producir ácido quinolínico, que comprende (a) cultivo de un microorganismo recombinante que expresa una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce en un medio que comprende una fuente de carbono; y (b) recuperación de ácido quinolínico producido durante el cultivo.

El microorganismo recombinante se puede cultivar en un medio de cultivo adecuado en condiciones de cultivo adecuadas conocidas en la técnica. Las personas especializadas en la técnica pueden aplicar dichos procedimientos de cultivo y ajustarlos fácilmente de acuerdo con el microorganismo seleccionado. Los procedimientos de cultivo incluyen, sin limitarse solo a ellos, cultivos continuos y discontinuos. En "Biochemical Engineering" de James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, por ejemplo, se desvelan diversos procedimientos de cultivo de microorganismos

El medio de cultivo utilizado debe satisfacer los requisitos de las cepas en particular de forma adecuada. Los medios de cultivo para varios microorganismos están publicados en la bibliografía ("Manual of Methods for General Bacteriology" de American Society for Bacteriology, Washington D.C., Estados Unidos, 1981). Los medios de cultivo pueden comprender diversas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y microelementos.

La fuente de carbono adecuada en el medio de cultivo para los microorganismos puede comprender hidratos de

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carbono como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa, aceites como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco, ácidos grasos como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes como glicerol y etanol y ácidos orgánicos como ácido acético pero sin limitarse solo a ellos. Dichas fuentes de carbono se pueden utilizar por separado o combinadas.

La fuente de nitrógeno disponible en el medio de cultivo para los microorganismos puede comprender fuentes de nitrógeno orgánico como peptonas, extracto de levadura, extracto d carne, extracto de malta, agua de macerado de maíz (CSL), harina de soja y urea o fuentes de nitrógeno inorgánicas como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pero sin limitarse a ellas. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar por separado o combinadas.

La fuente de fósforo disponible en el medio de cultivo para los microorganismos puede comprender dihidrógeno fosfato potásico, hidrógeno fosfato dipotásico y las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo también puede comprender sales de metal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. El medio que se ha mencionado puede comprender también aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados. El medio de cultivo para los microorganismos o los componentes por separado pueden añadirse a un lote o un lote continuo, si bien no se limita con ello.

Asimismo, es posible añadir compuestos como hidróxido de amonio, hidróxido potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico al medio de cultivo para el microorganismo de manera apropiada para controlar el valor de pH del caldo de cultivo. Se puede utilizar un agente anti-espumante, como por ejemplo poliésteres glicólicos de ácido graso durante el cultivo para impedir la formación de espuma. Para mantener las condiciones aerobias, se puede introducir oxígeno o gas con contenido en oxígeno (p.ej., aire) en el caldo de cultivo. La temperatura del caldo de cultivo puede estar comprendida normalmente entre 20 °C y 45 °C y, específicamente, entre 25 °C y 40 °C. Se puede continuar el cultivo hasta producir la cantidad de ácido quinolínico prevista y preferentemente de forma específica de 10 horas a 160 horas.

En un ejemplo específico de la presente invención, se trasformó una cepa W3110AnadC, de la que se había eliminado la actividad quinolinato fosforibosiltransferasa con plásmidos de expresión que comprenden genes que codifican la proteína de fusión NadB-L-NadA unidas a través de diversos engarces, respectivamente, y a continuación, se examinó la capacidad de las cepas para producir ácido quinolínico desde ácido aspártico. Como resultado, cuando se expresan L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa como una proteína de fusión, se puede producir ácido quinolínico en un alto rendimiento, en comparación con las expresiones de estas enzimas por separado (Tabla 2).

Asimismo, se transformó E.coli que tiene actividades de fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato aminotransferasa potenciadas y en el que se ha eliminado la actividad quinolinato fosforibosiltransferasa con el plásmido de expresión que comprende el gen que codifica la proteína de fusión y a continuación se examinó la productividad del ácido quinolínico de estas cepas CV01-0600, CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 y CV01-0607. Como resultado, se observó que se puede producir ácido quinolínico en un alto rendimiento a través de la expresión de la proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa y se puede producir ácido quinolínico en un mayor rendimiento que la cepa convencional, a través de la eliminación de la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa y la potenciación de las expresiones de fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato aminotransferasa, con la expresión de la proteína de fusión (Tabla 5).

Las cepas que producen ácido quinolínico, Escherichia coli CV01-0604 y CV01-0605, fueron depositadas en virtud del Tratado de Budepest en el Centro de Cultivos de Microorganismos de Corea (KCCM, located on Hongjae 1- Dong, Seodaemun-Gu, Seúl, Corea) el 21 de diciembre, 2011 con números de acceso KCCM11235P y KCCM11236P, respectivamente. Es decir, este depósito está reconocido por una Autoridad Internacional de Depósito en virtud del Tratado de Budapest.

A continuación, se describirá la presente invención con más detalle haciendo referencia a los Ejemplos y los Ejemplos Experimentales. Sin embargo, estos ejemplos tienen un fin únicamente ilustrativo y no se pretende limitar la invención con dichos ejemplos.

Ejemplo 1. Preparación de la cepa que produce ácido quinolínico <1-1> Construcción de plásmido que expresa L-aspartato oxidasa

Se obtuvo el gen nadB que codifica L-aspartato oxidasa por PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz. Sobre la base de la secuencia de nucleótidos para el gen nadB (NCBI No. de registro "GI:89109380") de la SEQ ID NO. 27 obtenido del GenBank del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se pudo amplificar la región del marco de lectura abierta que contenía de ATG a TAA en el gen nadB y se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO. 1 y 2 que tenían sitios de reconocimiento de enzimas de restricción NdeI y BamHI.

Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como plantilla y los oligonucleótidos de SEQ ID NO. 1 y 2 como cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 30 veces, que incluyó desnaturalización a 96° C durante 30 segundos, hibridación a 50°C durante

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30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. De este modo se obtuvo el gen amplificado de aproximadamente 1,9 kb, que contiene el gen nadB y los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción NdeI y BamHI.

El gen nadB obtenido por procedimientos de PCR fue tratado con enzimas de restricción NdeI y BamHI y, a continuación, se clonó por ligación en el vector pProLar (CloneTech) tratado con las enzimas de restricción NdeI y BamHI para construir finalmente un vector recombinante pPro-nadB en el que se clonó el gen nadB, cuya expresión fue controlada en virtud del promotor pPro como promotor constitutivo.

<1-2> Construcción de plásmido que expresa L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa

Se obtuvo el gen nadA que codifica quinolinato sintasa por PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz. Sobre la base de la secuencia base para el gen nadA (No. de registro del NCBI "GI: 89107601") de SEQ ID NO. 28 obtenido del GenBank del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se pudo amplificar la región del marco de lectura abierto de ATG a TAA en el gen nadA y se sintetizaron los cebadores de SEQ ID NO. 3 y 4 que tienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción ApaI y NotI.

Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 3 y 4 como cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. De este modo, se obtuvo el gen amplificado de aproximadamente 1,0 kb, que contiene el gen nadA y los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción ApaI y NotI.

Asimismo, se obtuvo el promotor Pro por PCR utilizando ADN cromosómico del vector pProLar (CloneTech) como matriz. Sobre la base de la secuencia base (SEQ ID NO. 32) para el promotor Pro de CloneTech y se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO. 5 y 6 que tienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción BamHI y ApaI para ligar el promotor pPro y el gen nadA amplificado.

Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 5 y 6 como cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto. De este modo, se obtuvo un gen amplificado de aproximadamente 0,135 kb, que contiene el promotor pPro y los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción BamHI y ApaI,

Se trató el gen nadA obtenido a través de procedimientos de PCR con enzimas de restricción ApaI y NotI y se trató el fragmento de promotor pPro amplificado con ApaI y BamHI. Se clonaron los fragmentos nadA y promotor pPro tratados con las enzimas de restricción por ligación en el vector pPro-nadB tratado con NotI y BamHI preparado en el <Ejemplo 1-1> para construir finalmente un vector recombinante pPro-NBA de 5,7 Kb, en el que el gen nadB, cuya expresión fue controlada en virtud del promotor pPro como promotor constitutivo y se clonó el gen nadA cuya expresión fue controlada por el promotor pPro. El pPro-NBA construido tiene la secuencia de SEQ ID NO. 33. La FIG. 2 presenta la construcción de pPro-NBA como el plásmido que expresa genes que codifican L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa.

<1-3> Construcción de plásmido que expresa NadB-L-NadA

Para construir un plásmido que expresa NadB-L-NadA que contiene un engarce, se llevó a cabo la PCR utilizando pPro-NBA (SEQ iD NO. 33) preparado en el <Ejemplo 1-2> como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 7 y 8 como cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. De esta forma, se obtuvo un gen amplificado de aproximadamente 1,8 kb, que contiene el promotor pPro, el sitio de enzima de restricción Xhol y el engarce en el extremo del gen nadB.

Asimismo, se llevó a cabo la PCR utilizando pPro-NBA como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 15 y 16 como cebador, para amplificar el fragmento del gen nadA que tiene la secuencia homóloga en el extremo del gen amplificado de aproximadamente 1,8 kb, que contiene el sitio de enzima de restricción Xhol, el promotor pPro y el engarce en el extremo del gen nadB y el sitio de enzima de restricción NotI en el extremo del gen nadA. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. De este modo, se obtuvo el gen amplificado de aproximadamente 1,1 kb, que se puede ligar con el engarce por ligación homóloga y que contiene el sitio de enzima de restricción NotI en el extremo del gen nadA.

Se mezclaron el gen amplificado de aproximadamente 1,8 kb que contiene el promotor pPro, el sitio de enzima de restricción XhoI y el engarce en el extremo del gen nadB y el fragmento del gen nadA que tiene la secuencia homóloga en el extremo del gen amplificado de aproximadamente 1,8 kb y el sitio de enzima de restricción NotI en el

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extremo del gen nadA así preparado y se realizó la PCR Sewing. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se realizó la PCR repitiendo el ciclo 10 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 60 segundos, hibridación a 50 °C durante 60 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto. Se siguió llevando a cabo la PCR por adición de los oligonucleótidos de las sEq ID NO. 7 y 16 a la mezcla de reacción PCR. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se llevó a cabo la PCR repitiendo el ciclo 20 veces incluyendo desnaturalización a 96°C durante 30 segundos, hibridación a 50°C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 3 minutos. Finalmente, se obtuvo el gen de la proteína de fusión amplificado de aproximadamente 2,9 kb que contiene la "enzima de restricción XhoI_promotor pPro_nadB_engarce_nadA_enzima de restricción NotI".

Se trató el fragmento del gen, la "enzima de restricción XhoI_promotor pPro_nadB_engarce_nadA_enzima de restricción NotI" obtenido por PCR con enzimas de restricción, XhoI y NotI. Se clonó el "promotor pPro_nadB_engarce_ fragmento de gen nadA" tratado con las enzimas de restricción por ligación en un vector pProLar (CloneTech) tratado con las enzimas de restricción XhoI y NotI para construir finalmente un vector recombinante pNBHL1A, cuya expresión fue controlada en virtud del promotor pPro como promotor constitutivo y en el que se clonó la proteína de fusión simple de nadB y nadA unidas a través del engarce. Los engarces utilizados en este ejemplo se componen de 5 a 30 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO. 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60, respectivamente.

Se amplificó el fragmento del gen nadB cambiando el oligonucleótido de la SEQ ID NO. 8 que contiene el engarce por los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12, 13 o 14, para amplificar varios genes que contienen varios engarces, que contienen cada uno de ellos el promotor pPro y el engarce en el extremo de nadB. De igual modo que anteriormente, se prepararon los vectores recombinantes pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A y pNBFL4A. Los pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A y pNBFL4A preparados tienen las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO. 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente. Las proteínas de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa así preparadas tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 47, 48, 49, 50, 51, 52 y 53, respectivamente. En la FIG. 2 se presenta la construcción de pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A o pNBFL4A, que es un plásmido que expresa cada gene que codifica proteínas de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de varios engarces.

<1-4> Construcción de plásmido que expresa fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato transaminasa

Se obtuvo por PCR el gene ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz. Sobre la base de la secuencia base para el gen ppc (No. de registro del NCBI "GI: 89110074") de SEQ ID NO. 29 obtenido del GenBank del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se pudo amplificar la región desde el promotor al terminador en el gen ppc y se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO. 17 y 18 que tienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción HindIII y BamHI.

Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 17 y 18 como el cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se llevó a cabo la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 4 minutos. De esta forma, se obtuvo el gen amplificado de aproximadamente 3,1 kb, que contiene el gen ppc y los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción HindIII y BamHI.

Se trató el gen ppc obtenido a través de procedimientos de PCR con enzimas de restricción HindIII y BamHI y a continuación se clonó por ligación en el vector pCL1920 (AB236930) tratado con enzimas de restricción HindIII y BamHI para construir finalmente un vector recombinante pCP en el que se clonó el gen ppc.

Para clonar el gen aspC en el vector recombinante pCP en el que se clonó el gen ppc, se obtuvo el gen aspC que codifica L-aspartato transaminasa por PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz. Sobre la base de la secuencia base para el gen aspC (No. de registro del NCBI "GI: 89107778") de SEQ ID NO. 30 obtenido del GenBank del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se pudo amplificar la región desde el promotor al terminador en el gen aspC y se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO. 19 y 20 que tienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción BamHI y KpnI.

Se llevó a cabo PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 19 y 20 como cebador. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se llevó a cabo la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 50 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos. De este modo, se obtuvo el gen amplificado de aproximadamente 1,5 kb, que contiene el gen aspC y los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción BamHI y KpnI,.

Se trató el gen aspC obtenido por PCR con enzimas de restricción, BamHI KpnI y a continuación se clonó por ligación en el vector pCP tratado con las enzimas de restricción BamHI y KpnI para construir finalmente un vector recombinante pCPA en el que se clonó el gen aspC y el gen ppc al mismo tiempo. El vector pCPA construido de esta forma tiene la secuencia SEQ ID NO. 41. En la FIG. 3 se presenta la estructura de construcción de pCPA, que es un plásmido que expresa los genes que codifican fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato transaminasa.

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<1-5> Construcción de cepa deficiente en quinolinato fosforibosiltransferasa

En este ejemplo, se obtuvo por PCR el gen nadC que participa en la ruta de descomposición de ácido quinolínico utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz. Sobre la base de la información de la secuencia base del gen nadC (No. de registro del NCBI "GI:89106990") obtenido del GenBank del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO. 21 y 22 para amplificar la región en dirección 3' del gen nadC, los cebadores de las SEQ ID NO. 23 y 24 para amplificar las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen nadC y loxpCm y los cebadores de las SEQ ID NO. 25 y 26 para amplificar la región en dirección 5' del gen nadC.

Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de E.coli W3110 como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 21 y 22 y 25 y 26 como cebador para amplificar las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen nadC de 0,5 kb y 0,3 kb, respectivamente. Asimismo, Se llevó a cabo la PCR utilizando el vector plásmido pLoxpCat2 que contiene loxpCm como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO. 23 y 24 como cebador para amplificar el gen loxpCm de 1,0 kb, que tiene la secuencia homóloga a la del gen nadC en ambos extremos. Se utilizó ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa y se llevó a cabo la PCR repitiendo el ciclo 30 veces que comprendió desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos, hibridación a 53 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto. A continuación, se utilizaron el fragmento en dirección 5' de nadC, el fragmento en dirección 3' de nadC y el fragmento loxpCm obtenidos de las reacciones de PCR como matriz para realizar la PCR en condiciones de PCR incluyendo 10 repeticiones del ciclo que incluyó desnaturalización a 96 °C durante 60 segundos, hibridación a 50 °C durante 60 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto y 20 repeticiones del ciclo tras la adición de los cebadores de las SEQ ID NO. 21 y 26. De este modo, se obtuvo un casete nadC deficiente de 1,8 kb, que contiene la región en dirección 5' del gen nadC - región dirección 3' del gen loxpCm-región dirección 3' del gen nadC.

Se transformó E.coli W3110 que contiene pKD46 como vector de expresión de lambda red recombinasa con el casete nadC deficiente por electroporación, y a continuación se manchó la cepa sobre medio para placa LB (Luria- Bertani) (triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 10 g y agar 1,5 %/l) que contenía cloranfenicol como marcador selectivo y se incubó a 37 °C durante toda la noche para seleccionar cepas de microorganismo que exhibieran resistencia contra cloranfenicol.

Se sometieron directamente a PCR las cepas seleccionadas como matriz utilizando los cebadores de las SEQ ID NO. 21 y 26 en las mismas condiciones y a continuación, se confirmó la deleción del gen nadC identificando que el tamaño del gen en la cepa silvestre y la cepa nadC-deficiente cepa era 1,0 kb y 1,8 kb, respectivamente, sobre 1,0 % de gel de agarosa. Asimismo, se separó el gen nadC de E. coli W3110 como cepa silvestre de acuerdo con el mismo procedimiento que anterior.

Ejemplo 2. Preparación y evaluación de cepa que expresa proteína de fusión <2-1> Preparación de cepa que expresa proteína de fusión

Se utilizaron los plásmidos pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A y pNBFL4A y pPro- NBA que expresan genes que codifican las proteínas de fusión simples que se prepararon uniendo L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa a través de varios engarces del <Ejemplo 1-3> por procedimiento de CaCl2 para transformar la cepa W3110AnadC según la construcción del <Ejemplo 1-5>, que se mancharon después sobre un medio de placa LB-Km (extracto de levadura de 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, kanamicina 25 pg/l) y se incubó a 37 °C durante toda la noche. A continuación, se seleccionaron colonias resistentes a kanamicina. De este modo, se obtuvieron las cepas que expresan L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa como proteína de fusión simple.

<2-2> Comparación de la productividad de ácido quinolínico desde ácido aspártico entre proteínas de fusión que tienen varios engarces

Para comparar la capacidad de sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido aspártico entre proteínas de fusión que tienen diversos engarces, se inoculó cada una de las proteínas de las cepas que expresan proteína de fusión obtenidas en el <Ejemplo 2-1> en 5 ml de LBKm-IPTG (extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, kanamicina 25 pg/l, IPTG 10 mM) medio líquido en una incubadora a 37°C y se cultivó a 37 °C con 250 rpm durante toda la noche para obtener un caldo de cultivo. Se centrifugó el caldo de cultivo así obtenido 4000 rpm durante 10 minutos para obtener solamente la cepa que expresa proteína de fusión, que se resuspendió en 500 pl de tampón Tris pH 7,0 y después se interrumpió por sonicación.

Se utilizaron los lisados celulares enteros que contienen la proteína de fusión expresada obtenida según el procedimiento anterior para comparar la capacidad para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico a través de la reacción enzimática. En la Tabla 1 se muestra la composición de la mezcla de reacción de enzima para comparar la capacidad de sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico.

[Tabla 1]

Composición de la mezcla de reacción: Unidad (ml)

Ácido L-aspártico 200 mM: 0,1

Dihidroxiacetona fosfato 200 mM: 0,1

Lisado celular: 0,1

Tampón Tris 1 M (pH 7,0): 0,1

Agua destilada: 0,6

Total: 1,0

Se dejó reaccionar la composición de reacción a 37 °C durante 30 minutos. Se analizaron ácido L-aspártico y ácido quinolínico en el caldo de cultivo por HPLC. En la Tabla 2 se muestra el resultado de los análisis y se indica la 5 capacidad de cada proteína de fusión para producir ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico.

[Tabla 2]

Cepa: Plásmido Aminoácido de engarce Ácido quinolínico (g/l) Rendimiento (índice de conversión en % en moles*)

W3110AnadC: pPro-NBA 1,5 44.9%

pNBHL1A: LA(EAAAK)1AAA (SEQ ID NO, 54) 2,5 74.9 %

pNBHL2A: LA(EAAAK) 2AAA (SEQ ID NO, 55) 2,4 71.9 %

: pNBHL3A LA(EAAAK)3TAA (SEQ ID NO, 56) 2,7 80.8 %

: pTdBHL4A LA(EAAAK)4AAA (SEQ ID NO, 57) 3,1 92.8 %

: pNBHL5A LA(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO, 58) 3,2 95.8 %

: pNBFL3A L(GGGS)3AAA (SEQ ID NO, 59) 2,4 71.9 %

: pNBFL4A L(GGGS)4AAA (SEQ ID NO, 60) 2,2 65.9 %

*índice de conversión en moles (%) = ácido quinolínico (M) producido / ácido L-aspártico (M) añadido

pPro-NBA que expresa L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa produjo 1,5 g/l de ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico y presentó 44,9% de rendimiento de conversión enzimática a partir de ácido L-aspártico en ácido 10 quinolínico, mientras que pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A y pNBFL4A que produjeron las proteínas de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de varios engarces produjeron 2,2 ~ 3,2 g/l de ácido quinolínico y presentó 65,9 ~ 95,8 % de rendimiento de conversión enzimática a partir de ácido L-aspártico a ácido quinolínico, respectivamente.

Este resultado indica que la expresión de una proteína de fusión simple de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa 15 presenta un rendimiento de conversión superior de ácido quinolínico en comparación con expresiones de enzimas por separado. Asimismo, todas las cepas introducidas con varios tipos de engarces presentaron altos índices de conversión enzimática, lo que indica que la expresión de la proteína de fusión simple de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidos a través del engarce es más eficiente en la biosíntesis de ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico. pNBHL4A y pNBHL5A introducidos con el engarce LA(EAAAK)4~5AAA presentó el índice de 20 conversión en ácido quinolínico más alto, lo que indica que LA(EAAAK)4~5AAA son los engarces de proteína de fusión más eficientes en la producción de ácido quinolínico.

Ejemplo 3. Preparación y evaluación de cepa que produce ácido quinolínico

<3-1> Preparación de cepa que produce ácido quinolínico

Para comparar la capacidad para sintetizar ácido quinolínico a partir de glucosa entre proteínas de fusión que tienen 25 diversos engarces, se utilizó el plásmido pCPA construido en el <Ejemplo 1-4> por el procedimiento de CaCh para

transformar la cepa W3110AnadC según la construcción del <Ejemplo 1-5>, que se mancharon a continuación sobre un medio para placa LB-SP (extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, espectinomicina 50 mg/l) y se incubó a 37 °C durante toda la noche. A continuación, se seleccionaron las colonias resistentes a espectinomicina.

Se utilizaron los plásmidos pPro-NBA, pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A y pNBFL4A 5 construidos en el <Ejemplo 1-2> y el <Ejemplo 1-3> a través del procedimiento de CaCl2 para transformar la cepa W3110AnadC que contienen pCPA construido según lo anterior, que se mancharon sobre medio para placa LB-Km- Sp (extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, espectinomicina 50 pg/l, kanamicina 25 pg/l) y se incubó a 37 °C durante toda la noche. A continuación, se seleccionaron 10 colonias resistentes a kanamicina y a espectinomicina. Las cepas que producen ácido quinolínico preparadas de esta forma fueron denominadas CV01- 10 0600, CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 y CV01-0607, respectivamente. En

la Tabla 3 se muestra el genotipo de la cepa huésped, el plásmido contenido y la secuencia de aminoácidos / ácido L-aspártico (M) añadido del engarce de la proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa.

[Tabla 3]

Genotipo de cepa: Plásmido Secuencia de aminoácidos de engarce Cepa No.

W3110AnadC: pCPA pPro-NBA - CV01-0600

pNBHL1A: LA(EAAAK)1AAA CV01-0601

pNBHL2A: LA(EAAAK)2AAA CV01-0602

pNBHL3A: LA(EAAAK)3AAA CV01-0603


: pNBHL4A LA(EAAAK)4AAA CV01-0604

pNBHL5A: LA(EAAAK)5AAA CV01-0605

pNBFL3A: L(GGGS)3AAA CV01-0606

pNBFL4A: L(GGGS)4AAA CV01-0607

15 <3-2> Evaluación de cepa que produce ácido quinolínico

Para conformar la capacidad para producir ácido quinolínico a partir de glucosa, se tituló ácido quinolínico según el siguiente experimento. Se cultivó la cepa que produce ácido quinolínico preparada en el <Ejemplo 3-1> sobre medio para placa LB-SP-Km en una incubadora a 37 °C durante toda la noche para obtener una colonia simple, que se inoculó después en 25 ml de medio de titulación de ácido quinolínico con 1 bucle de platino y se incubó con 250 rpm 20 a 37 °C durante 24 a 72 horas. En la Tabla 4 se muestra la composición del medio de producción de ácido quinolínico.

[Tabla 4]

Composición: Conc. (por litro)

Glucosa: 70 g

Sulfato de amonio: 17 g

KH2PO4: 1,0 g

MgSO4-7H2O: 0,5 g

FeSO4-7H2O: 5 mg

MnSO4-8H2O: 5 mg

ZnSO4: 5 mg

Carbonato cálcico: 30 g

Extracto de levadura: 2 g

Se analizó ácido quinolínico en el caldo de cultivo por HPLC. En la Tabla 5 se muestran los resultados del análisis y

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se indica la capacidad de la cepa para producir ácido quinolínico a partir de glucosa.

[Tabla 5]

Cepa: Ácido quinolínico (g/l) Rendimiento (%)*

CV01-0600: 5,5 7,9

CV01-0601: 7,0 10,0

CV01-0602: 6,5 9,3

CV01-0603: 7,5 10,7

CV01-0604: 9,7 13,9

CV01-0605: 10,3 14,7

CV01-0606: 6,5 9,3

CV01-0607: 6,0 8,6

*Rendimiento (% = ácido quinolínico producido (g) glucosa añadida (g)

La cepa CV01-0600 que se preparó eliminado quinolinato fosforibosiltransferasa de E.coli W3110 para suprimir la descomposición de ácido quinolínico intracelular mediante quinolinato fosforibosiltransferasa y a continuación, potenciando las expresiones de fosfoenolpiruvato carboxilasa, L-aspartato aminotransferasa y L-aspartato oxidasa, quinolinato sintasa, produjo 5,5 g/l de ácido quinolínico, mientras que las cepas CV01-0601, CV01-0602, CV01- 0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 y CV01-0607 que expresan las proteínas de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de varios engarces produjeron 6,0 ~ 10,3 g/l de ácido quinolínico, respectivamente.

Este resultado coincide con el resultado de la conversión enzimática de ácido L-aspártico en ácido quinolínico en el <Ejemplo 2> e indica también que la expresión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa como proteína de fusión simple reduce al mínimo la reacción secundaria de conversión de a-iminosuccinato en oxaloacetato aumentando la reacción de un a-iminosuccinato metabolito intermedio con quinolinato sintasa, aumentando así la producción de ácido quinolínico. Asimismo, todas las cepas introducidas con varios tipos de engarces presentaron una alta productividad relativamente alta de ácido quinolínico, lo que indica la expresión de la proteína de fusión simple de L- aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través del engarce es más eficiente en la biosíntesis de ácido quinolínico.

Por otra parte, en conformidad con el resultado del <Ejemplo 2>, pNBHL4A y pNBHL5A, que se introdujeron con los engarces de LA(EAAAK)4~5AAA, respectivamente, presentaron la máxima productividad de ácido quinolínico, lo que indica que LA(EAAAK)4~5AAA son los engarces de proteína de fusión más eficientes en la producción de ácido quinolínico.

Por otra parte, se confirmó que cuando se potencia la ruta de biosíntesis de ácido L-aspártico con una combinación de una mejor velocidad de reacción por la expresión de la proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa, la eliminación de la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa y la potenciación de las expresiones de fosfoenolpiruvato carboxilasa y L-aspartato aminotransferasa, se puede producir ácido quinolínico con una alta eficiencia en comparación con la cepa convencional.

Efecto de la invención

La presente invención proporciona un microorganismo que expresa una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidos a través de un engarce para reducir al mínimo la reacción de descomposición natural de a-iminosuccinato, que constituye un problema en el proceso de producción biológico convencional, produciendo así ácido quinolínico con una alta productividad. .

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico y procedimiento de producción de ácido quinolínico utilizándolo

<130> OPA12191/PCT

<150> KR10-2012-0001845

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<151> <160> 63

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1 <211> 25 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de nadB <400> 1

catatgaata ctctccctga acatt 25

<210> 2 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de nadB <400> 2

ggatccctat accactacgc ttgatcac 28

<210> 3 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de nadA <400> 3

gggcccatga gcgtaatgtt tgatcca 27

<210> 4 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de nadA <400> 4

gcggccgctc gtgcctaccg cttcg 25

<210> 5 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de promotor Pro <400> 5

ggatccctcg agcatagcat ttttatcc 28

<210> 6 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> cebador para amplificación de promotor Pro <400>6

gggcccatgt acctttctcc tct 23

<210>7 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de promotor Pro <400> 7

ctcgagcata gcatttttat 20

<210>8 <211> 69 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB con engarce helicoidal (HL1) <400> 8

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc cttcgcggct gcttctgcca ggattctgtt

tatgtaatg

<210>9 <211> 84 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB co engarce helicoidal (HL2)

<400> 9

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc

tgccaggatt ctgtttatgt aatg

<210> 10 <211> 99 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB co engarce helicoidal (HL3)

<400> 10

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc cttcgcggct gcttctgcca ggattctgtt tatgtaatg

<210> 11 <211> 114

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

60

69

60

84

60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> cebador para amplificación de gen nadB con engarce helicoidal (HL4)

<400> 11

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc tgccaggatt ctgtttatgt aatg

<210> 12 <211> 129 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB con engarce helicoidal (HL5)

<400> 12

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc

cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc cttcgcggct gcttctgcca ggattctgtt

tatgtaatg

<210> 13 <211> 87 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB con engarce flexible (FL3)

<400> 13

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc gctaccacca ccgctaccac caccgctacc accacccagg attctgttta tgtaatg

<210> 14 <211> 99 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadB con engarce flexible (FL4)

<400> 14

aaacattacg ctcatctgca gggctgctgc gctaccacca ccgctaccac caccgctacc accaccgcta ccaccaccca ggattctgtt tatgtaatg

<210> 15 <211> 43 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadA <400> 15

ctgcagatga gcgtaatgtt tgatccagac acggcgattt atc 43 <210> 16

60

114

60

120

129

60

87

60

99

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<211> 23 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen nadA <400> 16

attaattaat taagcggccg ctc 23

<210> 17 <211> 37 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen ppc <400> 17

aagcttctgt aggccggata aggcgctcgc gccgcat 37

<210> 18 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen ppc <400> 18

cggatccttt gaataaaatg cagacag 27

<210> 19 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen aspC <400> 19

ggatccgtcc acctatgttg actaca 26

<210> 20 <211> 31 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de gen aspC <400> 20

ggtaccgagc tcataagcgt agcgcatcag g 31

<210> 21 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de región en dirección 3' de nadC <400> 21

gaaacgggaa agcagattcc 20

<210> 22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<211> 41 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de región en dirección 3' de nadC <400> 22

cggtaggtac cgagctcgaa aagtagagaa tctggaagaa c 41

<210> 23 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de loxCm <400> 23

gttcttccag attctctact tttcgagctc ggtacctacc g 41

<210> 24 <211> 42 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de loxpCm <400> 24

tgaagaggtg tttattcaac tgggggtacc gttcgtataa tg 42

<210> 25 <211> 42 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de región en dirección 5' de nadC <400> 25

cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42

<210> 26 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para amplificación de región en dirección 5' de nadC <400> 26

gtggtgctaa tacccggtt 19

<210> 27

<211>1623 <212> ADN <213> Escherichia coli

<220>

<221> gen <222> (1)..(1623)

<223> Marco de lectura abierto de nadB <400> 27

5

atgaatactc: tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60

ctttcactgg: cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaaggcccg 120

gtaacggaag: gttcaacatt ttatgcccag ggcggtattg ccgccgtgtt tgatgaaact 180

gacagcattg: actcgcatgt ggaagacaca ttgattgccg gggctggtat ttgcgatcgc 240

catgcagttg: aatttgtcgc cagcaatgca cgatcctgtg tgcaatggct aatcgaccag 300

ggggtgttgt: ttgataccca cattcaaccg aatggcgaag aaagttacca tctgacccgt 360

gaaggtggac: atagtcaccg tcgtattctt catgccgccg acgccaccgg tagagaagta 420

gaaaccacgc: tggtgagcaa ggcgctgaac catccgaata ttcgcgtgct ggagcgcagc 480

aacgcggttg: atctgattgt ttctgacaaa attggcctgc cgggcacgcg acgggttgtt 540

ggcgcgtggg: tatggaaccg taataaagaa acggtggaaa cctgccacgc aaaagcggtg 600

gtgctggcaa: ccggcggtgc gtcgaaggtt tatcagtaca ccaccaatcc ggatatttct 660

tctggcgatg: gcattgctat ggcgtggcgc gcaggctgcc gggttgccaa tctcgaattt 720

aatcagttcc: accctaccgc gctatatcac ccacaggcac gcaatttcct gttaacagaa 780

gcactgcgcg: gcgaaggcgc ttatctcaag cgcccggatg gtacgcgttt tatgcccgat 840

tttgatgagc: gcggcgaact ggccccgcgc gatattgtcg cccgcgccat tgaccatgaa 900

atgaaacgcc: tcggcgcaga ttgtatgttc cttgatatca gccataagcc cgccgatttt 960

attcgccagc: atttcccgat gatttatgaa aagctgctcg ggctggggat tgatctcaca 1020

caagaaccgg: taccgattgt gcctgctgca cattatacct gcggtggtgt aatggttgat 1080

gatcatgggc: gtacggacgt cgagggcttg tatgccattg gcgaggtgag ttataccggc 1140

ttacacggcg: ctaaccgcat ggcctcgaat tcattgctgg agtgtctggt ctatggctgg 1200

tcggcggcgg: aagatatcac cagacgtatg ccttatgccc acgacatcag tacgttaccg 1260

ccgtgggatg: aaagccgcgt tgagaaccct gacgaacggg tagtaattca gcataactgg 1320

cacgagctac: gtctgtttat gtgggattac gttggcattg tgcgcacaac gaagcgcctg 1380

gaacgcgccc: tgcggcggat aaccatgctc caacaagaaa tagacgaata ttacgcccat 1440

ttccgcgtct: caaataattt gctggagctg cgtaatctgg tacaggttgc cgagttgatt 1500

gttcgctgtg: caatgatgcg taaagagagt cgggggttgc atttcacgct ggattatccg 1560

gaactgctca: cccattccgg tccgtcgatc ctttcccccg gcaatcatta cataaacaga 1620

taa: 1623

<210> 28 <211> 1044 <212> ADN <213> Escherichia coli

<220>

<221> gen <222> (1)..(1044)

<223> Marco de lectura abierto de nadA <400> 28

atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg

ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc

aatgcggtga tggttgccca ctactatacc

accggtggct gtatttctga ttctctggaa

tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt

gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag

gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc

aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca

gaacttattg atcatcttga tagtttgggt

ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt

attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg

gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca

ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg

gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg

gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc

gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag

gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg

5 tttgcggcta cactacgtgg ataa

<210> 29 <211> 3096 <212> ADN

10 <213> Escherichia coli W3110

<220>

<221> gen <222> (1)..(3096)

15 <223> ppc

<400> 29

ataaggcgct cgcgccgcat ccggcactgt atgcgatact tgcgcatctt atccgaccta aacatttcca taagttacgc ttatttaaag

atttatcctt: tccccccgaa gccgacgccg 60

gagaagataa: aacgtctgct aaaagaacgt 120

gatcccgaaa: ttcaacaact ggcagaagaa 180

atggcgcgct: tcggtgcaaa gcatcccgct 240

atgggagaaa: ccgccaaaat tctcagtccg 300

gctgaatgtt: cactggatct cggctgccct 360

catcccgatc: gtactgtcgt cgtctacgcc 420

gattgggtgg: taacttcaag cattgccgtc 480

gaaaaaatca: tctgggcacc cgacaaacat 540

ggagacattc: tatgctggca gggtgcctgt 600

ttaacccgct: tgcaagaaga atacccggat 660

caagctattg: tcgatatggc ggatgcggtc 720

aaaacattgc: cacatcagag gcttattgtg 780

cagcaggcgg: tgccagataa agagttactg 840

tgccgcagct: gcgcgcattg tccgtggatg 900

gcattagaac: aggaaggaag caatcacgag 960

gcgctggtgc: cgctcaatcg tatgctggat 1020



: 1044

tgccaaactc cagtgccgca ataatgtcgg 60 cacctttggt gttacttggg gcgatttttt 120 cgtcgtgaat ttaatgacgt aaattcctgc 180

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

1. Un microorganismo recombinante que produce ácido quinolínico, que expresa una proteína de fusión de L- aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce.
2. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa tienen una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43, respectivamente.
3. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el engarce se compone de 5 a 30 aminoácidos.
4. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el engarce tiene una secuencia de aminoácidos de LA(EAAAK)nAAA (n es un número entero de 1 a 5) o L(GGGS)nAAA (n es un número entero de 1 a 5).
5. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el engarce tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60.
6. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 47, 48, 49, 50, 51, 52 y 53.
7. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que además se debilita la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa, en comparación con la actividad endógena de un microorganismo nativo.
8. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 7, en el que se debilita la actividad de quinolinato fosforibosiltransferasa a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en 1) deleción parcial o total de un gen que codifica la enzima, 2) modificación de una secuencia de control de expresión para reducir la expresión del gen, 3) modificación de la secuencia del gen en el cromosoma para debilitar la actividad de la proteína actividad y 4) combinaciones de los mismos.
9. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que se potencian además las actividades de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en fosfoenolpiruvato carboxilasa, L-aspartato aminotransferasa y la proteína de fusión.
10. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 9, en el que se potencia la actividad de la proteína a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en 1) aumentar el número de copias del gen que codifica la enzima, 2) modificar una secuencia de control de la expresión para aumentar la expresión del gen, 3) modificar la secuencia del gen en el cromosoma para potenciar la actividad de la enzima y 4) combinaciones de los mismos.
11. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Erterbacter sp., Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Coryrebacterium sp. y Brevibacterium sp.
12. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el microorganismo es E.coli.
13. El microorganismo recombinante de acuerdo con reivindicación 1, en el que el microorganismo se identifica por el No. de acceso KCCM11235P o KCCM11236P.
14. Un procedimiento para producir ácido quinolínico, que comprende:

(a) cultivo de un microorganismo recombinante que expresa una proteína de fusión de L-aspartato oxidasa y quinolinato sintasa unidas a través de un engarce en un medio que comprende una fuente de carbono; y

(b) recuperación de ácido quinolínico producido durante el cultivo.

imagen1

co

o

imagen2

Km R

orí p15A

■Promotor pPro nadB

TerminadornadB Promotor Pro

nadA

imagen3

Promotor Pro NadB

Engarce'

NadA

HL1

HL2

HL3

HL4

HL5

FL3

FL4

imagen4