BRPI0807802A2

BRPI0807802A2 - Processo para a produção de produto de fermentação de fontes de carbono contendo glicerol usando corynebacteria

Info

Publication number: BRPI0807802A2
Application number: BRPI0807802-5A
Authority: BR
Inventors: Kwang-Myung Cho; Kyung-Oh Choi; Hyun-Ae Bae
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2007-01-24
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2014-06-03
Also published as: DE112008000243B4; CN101617038A; DE112008000243T5; US8426165B2; WO2008091093A1; JP2010516274A; US20100129884A1; CN101617038B; KR100830826B1; JP5264778B2; BRPI0807802B1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PRODUTO DE FERMENTAÇÃO DE FONTES DE CARBONO CONTENDO GLICEROL USANDO CORYNEBACTERiA".

Campo da técnica.

A presente invenção refere-se a um método para produzir o pro- duto de fermentação de fontes de carbono diversas contendo glicerol usando Corynebacteria. Mais particularmente, presente invenção refere-se a um mé- todo para a produção de um produto de fermentação tal como aminoácido usando glicerol com alto rendimento e alta produtividade, pela fermentação com Corynebacteria introduzido com um gene diferente em relação à utiliza- ção de glicerol diferente capaz da acumulação de aminoácidos comercial- mente úteis, tais como aspartato, treonina, lisina, metionina, isoleucina, as- paragina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, alanina, valina, leucina, tripto- fano, tirosina, fenilalanina e os seus intermediários metabólicos no meio de cultura complementado com o glicerol, o subproduto gerado durante a pro- dução do biodiesel na indústria de óleo, como uma fonte de carbono. Antecedentes da Invenção

Os aminoácidos mencionados são muito úteis. Aspartato foi u- sado como uma matéria-prima de aspartame, e lisina, treonina, metionina, triptofano, foram usados como aminoácidos para alimentos, na alimentação e em medicamentos. Asparagina, isoleucina, ácido glutâmico, glutamina, leucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina e tirosina, foram usados como aminoácidos para alimentos e medicamentos. Também, a homosserina e a O-succinil-homosserina podem ser usadas como os precursores da produ- ção de aminoácidos.

De acordo com o aumento contínuo do preço de óleo, o desen- volvimento de uma energia alternativa usando um material de reciclagem na natureza está adquirindo atenção. Entre muitos candidatos para a fonte de energia alternativa, o biodiesel obtido de óleo vegetal e bioetanol produzido pela fermentação são os candidatos mais atraentes. O biodiesel indica o és- ter metílico de ácidos graxos ou o éster etílico de ácidos graxos sintetizados pela esterificação do metanol produzido usando óleo vegetal como um subs- trato na presença de um catalisador. Durante a síntese, o subproduto, glice- rol, é necessariamente gerado como 10 % do peso total.

O glicerol (C3H8O3) é convertido da glicose (ΰβΗ^Οβ) por uma etapa de redução, que pode fornecer uma força de redução melhorada du- rante o metabolismo de um micro-organismo. Muitos produtos produzidos pela fermentação necessitam de uma força de redução nos seus caminhos metabólicos. Desse modo, se o glicerol puder ser eficazmente usado como um substrato, o rendimento e a produtividade do produto de fermentação desejado seriam melhorados. Apesar da expectativa, os estudos sobre o glicerol foram limitados à reuterina (Talarico et al., Antimicrob. Agents Che- mother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-butanodiol (Biebl, et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-propanodiol (Menzel, e. al., Enzyme Mi- crob. Technol., 20:82-86 (1997)), ácido succínico (Patente Coreana N0 10- 0313134), ácido itacônico (Patente dos Estados Unidos N0 5.457.040), 3- hidroxipropanaldeídos (Doleyres et al. Appi Micríbiol. Biotechnol. 68 (4):467- 474 (2005)) e ácido propiônico (Himmi et al., Appi Microbiol. Biotechnol., 53: 435-440 (2000)). Isso se deve ao preço do glicerol ser mais alto do que o de quaisquer outras fontes de carbono usadas para a fermentação nessa indús- tria. Agora, estão em andamento os estudos para produção de glicerol via fermentação (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19 (3):201-223 (2001)).

Entretanto, com o aumento da produção de biodiesel, a produ- ção de glicerol também está aumentando, resultando na rápida redução do preço. Desse modo, houve um relatório informando que o 1,3-propanodiol (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 442-446, (2004)), o 25 hidrogênio e o etanol (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100 (3): 260-265 (2005)) foram produzidos pelo uso do subproduto do biodiesel, incluindo o glicerol. Entretanto, nenhum relatório foi divulgado para a produção do produto de fermentação mais representativo, os aminoácidos, e outros metabólitos prin- cipais pelo uso glicerol.

O glicerol foi produzido até então na indústria de sabão, ácido

graxo, cera e tensoativos. Entretanto, tal como acima mencionado, pode o- correr o problema de se tratar eficazmente um subproduto incluindo o glice- rol de acordo com o aumento da produção de biodiesel. Ao mesmo tempo, também se espera que o preço do glicerol purificado seja reduzido. Desse modo, a produção de produtos úteis de fermentação usando glicerol poderia trazer efeitos melhores do que os esperados.

5 Os casos de utilização do glicerol com micro-organismos foram

relatados para E. coli e Klebsiella pneumoniae. Na E. coli, o glicerol extrace- Iular infiltra em células pelo uso do GIpF, uma das aquagliceroporinas possu- indo a permeabilidade da água, glicerol e ureia, sem consumo de energia (Heller et al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)). O glicerol é convertido no 10 glicerol-3-fosfato pela glicerol quinase, que é convertida novamente no fosfa- to de diidroxiacetona (DHAP) pela glicerol-3-fosfato desidrogenase, e depois é convertido no gliceroaldeído-3-fosfato (G-3-P) pela triosefosfato isomerase (TpiA), seguido pelo metabolismo final (Lin a CE, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). No caso em que a glicerol quinase não tiver nenhuma 15 atividade, o glicerol é convertido na diidroxiacetona (DHA) pela glicerol desi- drogenase (Gdh), que é convertida novamente no fosfato de diidroxiacetona (DHAP) pela glicerol quinase ou pela diidroxiacetona quinase (DHA quina- se), seguida pela conversão novamente no gliceraldeído-3-fosfato (G-3-P) antes do metabolismo final (Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, 20 (2000)). Tal caminho metabólico do glicerol é regulado por fatores diversos. Particularmente, quando o glicerol e a glicose estão em conjunto, o tipo sel- vagem da E. coli usa primeiro a glicose, exclusivamente, e depois usa o gli- cerol (Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)).

Os micro-organismos do gênero Corynebacterium são aqueles 25 que foram amplamente usados no campo industrial. Por exemplo, Coryne- bacterium glutamicum foi usado para a produção de aminoácidos tais como a lisina e o glutamato monossódico, e o C. ammoniagenes foi amplamente usado industrialmente para a produção de ácido nucleico por fermentação. Foi informado que a Corynebacteria pode usar diversas fontes de carbono, 30 tais como glicose e açúcar bruto para a fermentação. Também se informou que Corynebacteria pode usar a xilose pela introdução de um gene, tal como o xylAB (Kawaguchi et al., Appi Envion. Microbiol. 72 (5): 3418-3428 (2006)). Entretanto, há relatos de casos raros em que a Corynebacteria u- sam o glicerol como uma fonte de carbono. Os casos de utilização do glice- rol em Corynebacterium glutamicum são também muito poucos (Pedido de Patente Coreana N0 2006-057633).

Entre os micro-organismos do gênero Corynebacterium, somen-

te 4 micro-organismos foram analisados para identificação das suas seqüên- cias integrais do genoma. E, um gene completo utilizando glicerol foi encon- trado somente no Corynebaeterium diphtheriae e tais genes envolvidos no consumo de glicerol, tal como o GIpF, foi deficiente em outros três micro- 10 organismos, Corynebaeterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, e Corynebacterium jeikeium. A deficiência do gene é o obstáculo principal para que a Corynebacteria utilize o glicerol eficientemente.

Descrição de Invenção Problema Técnico

Como explicado anteriormente, existe um valor agregado pelo

uso de glicerol que é o subproduto da produção do biodiesel como uma fonte de carbono. Assim, baseado nesse fato, os presentes inventores enfocaram seus estudos sobre a disponibilidade de glicerol para uma Corynebacteria com um valor industrialmente elevado, tal como a Corynebacterium glutami- 20 cum e a Corynebacterium ammoniagenes. Como resultado os presentes in- ventores concluíram a presente invenção confirmando que a disponibilidade de glicerol pode ser notavelmente melhorada pela introdução de um gene diferente envolvido com o uso do glicerol naquelas Corynebacteria.

É um objetivo da presente invenção fornecer um gene envolvido no uso do glicerol para melhorar significativamente a assimilação do glicerol pela Corynebacteria.

É outro objetivo da presente invenção fornecer um mutante ori- ginado da Corynebacteria utilizando o glicerol ou sozinho como uma fonte de carbono ou em conjunto com outras fontes de carbono.

É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um méto-

do para a produção do produto de fermentação pela fermentação com Cory- nebacteria utilizando uma fonte de carbono compreendendo o glicerol ou uma porção do glicerol.

Solução Técnica

Os objetivos acima e outros objetivos da presente invenção po- dem ser atingidos pelas seguintes modalidades da presente invenção.

A presente invenção é descrita detalhadamente daqui por diante.

Para atingir o objetivo da invenção, a presente invenção fornece um gene envolvido no uso do glicerol para melhorar significativamente a as- similação do glicerol pela Corynebacteria.

O gene envolvido aqui no uso do glicerol indica um gene que 10 codifica proteína facilitadora da absorção do glicerol originada da Coryne- bacterium diphtheriae (referido daqui por diante como glpF), um gene que codifica a glicerol quinase que é a enzima de produção do glicerol-3-fosfato por fosforilação usando o ATP (referido daqui por diante como glpK), e um gene que codifica a glicerol-3-fosfodiidrogenase que é a enzima de produção 15 do diidroxiacetona-3-fosfato pela oxidação do glicerol-3-fosfato (referido da- qui por diante como glpD).

O gene inclui qualquer gene que codifica um polipeptídio na Corynebacteria que desempenha um papel na absorção do glicerol extrace- Iular e na conversão do glicerol no glicerol-3-fosfato por fosforilação, e na 20 conversão de glicerol-3-fosfato em diidroxiacetona-3-fosfato, e depois final- mente na conversão do diidroxiacetona-3-fosfato em gliceraldeído-3-fosfato, o intermediário da glicólise, para metabolizar o glicerol.

O gene pode ser originado de animais, plantas, e micro- organismos. É mais preferido selecionar um gene originado de um micro- organismo, particularmente da Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 (Registro no Banco de Genes N0 NC_002935).

A presente invenção também fornece um mutante originado da Corynebacteria utilizando o glicerol sozinho como uma fonte de carbono ou em conjunto com outras fontes de carbono.

A cepa usada na presente invenção pode ser cultivada consu-

mindo glicerol e glicose simultaneamente para usar o glicerol eficazmente. Quando a glicose e o glicerol são fornecidos simultaneamente como uma fonte de carbono, o tipo selvagem E. coli usa exclusivamente a glicose, e depois de consumir toda a glicose o tipo selvagem E. coli usa o glicerol, que é assim chamado ‘diauxy’. Assim, quando uma fonte de carbono complexa contendo glicerol é fornecida, a eficiência da fermentação é reduzida.

5 Para superar o problema acima, os presentes inventores investi-

garam a possibilidade de utilização simultânea de glicose e glicerol na cepa. E como resultado os inventores confirmaram que o glicerol e outras fontes de carbono podem ser eficazmente usadas pela inserção de um gene dife- rente envolvido no uso do glicerol originado da Corynebacteria.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, os presen-

tes inventores fornecem um micro-organismo contendo o gene que codifica o GIpF (Registro no Banco de Genes N0 NC_940539.1), o GIpK (Registro no Banco de Genes N0 NC_940538.1) e o GIpD (Registro no Banco de Genes N0 NC_040540.1), e a proteína implicada no uso de glicerol, originada da 15 Corynebacterium diphtheriae. A transformação da Corynebacteria com o ge- ne pode ser realizada pelo método convencional conhecido daqueles na téc- nica, e pode ser fornecido um mutante da Corynebacterium para produção de aminoácidos usando uma fonte de carbono compreendendo o glicerol ou uma parte do glicerol.

O vetor para presente invenção não está limitado a um vetor es-

pecífico e qualquer vetor de expressão informado pode ser usado. Particu- larmente, o vetor lançador E.coli-Corynebacterium pECCG 117 (Biotechno- Iogy Ietters yol 13, N0 10, p.721-726 (1991)) é preferido.

Na presente descrição, o termo ‘transformação’ indica o proces- 25 so de introduzir um gene em uma célula hospedeira e expressar o gene na mesma. O gene transformado inclui qualquer gene, ou inserido no cromos- somo da célula hospedeira ou apresentado no exterior do cromossomo, en- quanto puder ser expressado na célula. O gene é um polinucleotídio capaz de codificar um polipeptídio e contendo DNA e RNA. O gene não está Iimita- 30 do na sua forma para a introdução, enquanto puder ser expressado na célula hospedeira. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira como um cassete de expressão, ou o construtor de polinucleotídio que con- tém todos os elementos necessários para a autoexpressão. O cassete de expressão compreende um promotor operacionalmente ligado ao gene, um terminador de transcrição, um sítio de ligação do ribossoma, e um termina- dor de tradução. O cassete de expressão pode ser o vetor de expressão ca- 5 paz de autorreplicação. Também, o gene pode ser operacionalmente ligado à seqüência necessária para a expressão na célula hospedeira pela introdu- ção em uma célula hospedeira como ele próprio, ou na forma de um polinu- cleotídio construtor.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a transfor- mação é realizada transformando uma célula hospedeira com o vetor con- tendo o gene glpDFK e introduzindo o plasmídio obtido pelo método do pulso elétrico. A célula hospedeira transformada pode ser a E. coli C002-0014 (Registro N0 KCCM 10834P).

Na presente invenção, o micro-organismo transformado com um gene envolvido no uso do glicerol para eficazmente produzir aminoácidos usando glicerol, pode ser uma das Corynebacteriaceae, mais preferivelmen- te um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e bem mais preferivel- mente um micro-organismo selecionado do grupo consistindo na Corynebac- terium glutamicum (exemplo ATCC 13032), Corynebacterium ammoniagenes (exemplo ATCC 6872), Brevibacterium Iactofermentum (exemplo ATCC13869), Brevibaeterium flavum (exemplo ATCC14067), Corynebacteri- um thermoaminogenes (exemplo FERM-BP 1539) e Corynebaeterium effici- ens (exemplo C. effieiens str. YS-314), mas nem sempre limitado a esses. E também, o micro-organismo que produz materiais úteis, tais como aminoáci- dos ou ácidos nucleicos, por exemplo, Corynebaeterium glutamicum SM5 para a produção de ácido glutâmico e Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881) para a produção de lisina, podem estar incluídos, mas nem sempre limitado a esses.

Presente invenção também fornece um método de produzir o produto de fermentação pela fermentação com Corynebacteria utilizando uma fonte de carbono compreendendo glicerol ou uma parte do glicerol. Par- ticularmente, a presente invenção fornece um método para produzir o produ- to de fermentação usando o glicerol compreendendo as etapas de: transfor- mação de uma célula hospedeira com o vetor contendo o glpDFK que é um gene complexo facilitador do uso de glicerol; transformação da Corynebacte- ria com o plasmídio obtido da célula hospedeira transformada pelo método 5 de pulso elétrico; cultivo da Corynebacteria transformada pela inoculação em um meio de cultura contendo glicerol ou uma parte de glicerol como uma fonte de carbono; e separando produto de fermentação do meio de cultura.

No método para produzir o produto de fermentação da presente invenção, o cultivo do micro-organismo pode ser realizada em um meio pró- 10 prio e sob condições de cultura adequadas conhecidas daquelas da técnica. Estas condições podem ser reguladas por aquelas da técnica de acordo com a cepa selecionada. Os métodos de cultivo são exemplificados como cultu- ras em batelada, cultura contínua e culturas em batelada alimentada, mas nem sempre limitados a esses. Os vários métodos de cultura são descritos 15 em "Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138-176.

O meio tem que satisfazer as condições para a cultura de uma cepa específica. O meio usado na presente invenção contém o glicerol ou uma parte do glicerol como uma fonte de carbono, preferivelmente contém o 20 glicerol em Iga 300 g por 1 litro do meio de cultura. Além do glicerol, outras fontes de carbono podem ser adequadamente acrescentadas, e neste mo- mento a glicose é preferida como uma fonte de carbono. Como uma fonte de nitrogênio, uma fonte de nitrogênio orgânica tal como a peptona, o extrato de levedura, o caldo de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho e fari- 25 nha de soja, e como uma fonte de nitrogênio inorgânica a ureia, o sulfato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio, o carbonato de amônio e o nitrato de amônio podem ser incluídos no meio. Como uma fonte de fosfa- to, o diidrogenofosfato de potássio, o bifosfato dipotássico e os seus sais correspondentes contendo sódio podem ser incluídos no meio. Além disso, 30 um sal de metal, tal como o sulfato de magnésio ou o sulfato de ferro tam- bém pode ser incluído. Os aminoácidos, as vitaminas e os precursores ade- quados podem também ser incluídos. Esses meios ou precursores podem ser acrescentados à cultura do tipo batelada ou do tipo contínua.

O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo acrescen- tando um composto tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A geração de bolhas de ar pode ser 5 inibida durante o cultivo pelo uso um agente antiespumante, tal como o éster do ácido graxo poliglicólico. Para manter a condição aeróbica da cultura, o oxigênio ou o gás contendo o oxigênio podem ser injetados na cultura. A temperatura da cultura está preferivelmente de 20°C a 45°C, mais preferi- velmente de 25°C 40°C. O cultivo pode ser continuado até que a produção 10 do aminoácido atinja um nível desejado, e o tempo de cultura preferível é de 10 a 160 horas.

Breve Descrição dos Desenhos.

A aplicação das modalidades preferidas da presente invenção é melhor entendida com referência aos desenhos que acompanham, em que: a figura 1 ilustra as taxas de crescimento dependentes do tem-

po, representadas pelas densidades óticas, da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032/p ECCG 117-cdi glpDFK-1 e Corynebacterium glutamicum aTCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2 no meio mínimo complementado com glicose a 100 % como uma fonte de carbono.

A figura 2 ilustra as taxas de crescimento dependentes do tempo dos micro-organismos no meio mínimo complementado com glicose:glicerol (50:50 %) como uma fonte de carbono, representada pelas densidades óti- cas.

A figura 3 ilustra as taxas de crescimento dependentes do tempo

dos micro-organismos no meio mínimo complementado com o glicerol a 100% como uma fonte de carbono, representada pelas densidades óticas. ATCC13032: Corynebacterium glutamicum ATCC13032 DFK-1: Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117- cdi glpDFK-1

DFK-2: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032/pECCG 117- cdi glpDFK-2 Melhor Modo para Executar a Invenção

As modalidades práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas, tal como mostrado nos Exemplos que se seguem.

Entretanto, será apreciado que os versados na técnica, em con- 5 sideração à presente descrição, possam fazer modificações e melhorias dentro do espírito e do alcance da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Avaliação e clonagem de um gene envolvido no uso de glicerol que é operável na Corynebacteria A seqüência de nucleotídios do gene envolvido no uso do glice-

rol da Corynebacterium diphtheriae já foi identificada e oficialmente liberada. A informação a respeito dos genes que codificam GIpF, GIpK e GIpD (glpF, glpK e glpD respectivamente) que são proteínas da Corynebacterium diph- theriae associadas com o uso do glicerol e as seqüências adjacentes de nu- 15 cleotídio foi obtida do GeneBank, NIH, EUA. O Número de Registro no Ban- co de Genes do GIpF da Corynebacterium diphtheriae foi NC_940539.1, o Número de Registro no Banco de Genes do GIpK foi NC_940538.1, e o Nú- mero de Registro no Banco de Genes do GIpD foi NC_940540.1. Os genes foram confirmados como estando arranjados como uma série no genoma. 20 Deste modo, um tempo de um PCR poderia amplificar todos dos três genes como um único polinucleotídio. Os iniciadores representados pelas SEQ. ID. NO: 1 e NO: 2 são usados para que a PCR possa amplificar os genes envol- vidos no uso do glicerol da Corynebaeterium diphtheriae.

SEQ. ID. NO: 1: 5’ GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG 3’ SEQ. ID. NO: 2: 5’ GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3’

O cromossomo da Corynebaeterium diphtheriae NCTC13129 foi comprado da Coleção Americana de Cultura de Tipos (ATCC) (ATCC ID. NO: 700971D-5) para amplificar o gene envolvido no uso do glicerol da Corynebaeterium diphtheriae. A PCR foi executada usando o cromossomo 30 da Corynebaeterium diphtheriae NCTC13129 como um padrão para amplifi- car o gene envolvido no uso do glicerol. A PCR foi executada como se se- gue; pré-desnaturação a 94°C durante 3 minutos, desnaturação em 94°C por 30 segundos, anelamento da 56°C por 30 segundos, polimerização a 72°C durante 4 minutos e 30 segundos, 25 ciclos de desnaturação a polimeriza- ção, e a extensão final a 72°C durante 5 minutos. Como resultado foi obtido o polinucleotídio ajustado 4281 bp. O polinucleotídio foi clonado no pCR2.1 pelo uso do kit de clonagem da TOPO TA (Invitrogen).

Exemplo 2: Determinação de seqüência de nucleotídios e restauração da mutação de aminoácidos do gene qlpDFK.

O plasmídio obtido acima foi digerido com solução Não I para obter um fragmento de DNA contendo o gene envolvido no uso do glicerol. O 10 fragmento de DNA foi clonado em pECCG117, vetor lançador E.coli- Corynebacterium, seguido pela transformação de E. coli TOPIO. A cepa transformada foi nomeada "E. coli C002-0014" que foi depositada no KCCM (Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos) da KFCC (a Federação coreana de Coleção de Cultura), a Autoridade de Depósito Internacional Ιο- ί 5 calizada em 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seul, Coréia, no dia 8 de janeiro de 2007 (Registro N0 KCCM 10834P).

O plasmídio obtido pelo minipreparativo convencional de plasmí- dio foi denominado de pECCG117-cdi glpDFK-1. A seqüência de nucleotí- dios do DNA do pECCG117-cdi glpDFK-1 foi determinada e conseqüente- 20 mente confirmou-se que a seqüência de nucleotídios do 171° ao 1904° gene codificado do glpD (SEQ. ID. NO: 4), a seqüência de nucleotídios do 1904° ao 2644° gene codificado do glpF (SEQ. ID. NO: 5) e a seqüência de nucleo- tídios do 2663° a 4181° gene codificado do glpK (SEQ. ID. NO: 6) e foram 5 modificações de seqüência de nucleotídios (SEQ. ID. NO: 3), comparadas 25 com a seqüência obtida pelo sequenciamento convencional do genoma. As modificações na seqüência de nucleotídios foram como se segue; a 54a timi- na foi modificada em citidina, a 1598a adenina foi modificada em guanina, a 2608a adenina foi modificada em guanina, a 2829a adenina foi modificada ema guanina, e a 3037a adenina foi modificada em guanina. Entre estas mo- 30 dificações, a modificação da mutação 2829a somente induzida do aminoáci- do e as restantes 4 modificações da seqüência de nucleotídios foram confir- madas como sendo uma mutação silenciosa. A mutação do aminoácido foi aquela da 56a asparagina da região glpK que foi modificada em serina. A seqüência de aminoácidos da glpK possuindo o aminoácido mutado é repre- sentada pela SEQ. ID. NO: 6.

Para restituir o aminoácido transformado à asparagina original, 5 foi realizada a mutagênese direcionada para o sítio. Os iniciadores da muta- gênese direcionada para o sítio para modificar o 56° aminoácido, a serina mutada em asparagina, foram construídos e representados pelas SEQ. ID. NO: 7 e N0 8.

SEQ. ID. NO: 7: 5’ GGAAATCTGGGCCAACACGCGCCAAGCC 3’

SEQ. ID. NO: 8: 5’ GGCTTGGCGCGTGTTGGCCCAGATTTCC 3’

A mutagênese direcionada para o sítio foi realizada com os inici- adores acima usando o kit de mutagênese direcionada para o sítio Quick- Change Il XL (Stratagene). O experimento foi realizado de acordo com a ins- trução do fabricante. O plasmídio foi extraído das colônias obtidas de acordo 15 com o método convencional, pelo qual a seqüência de nucleotídios foi de- terminada. Como resultado confirmou-se que a 2829a adenina foi modificada em guanina, de modo que a 56a serina da região glpK do pECCG117-cdi glpDFK-1 foi modificada em asparagina, sugerindo que isto poderia produzir a mesma proteína que a proteína GIpK da Corynebacterium diphtheriae pro- 20 duziu (SEQ. ID. NO: 9; SEQ. ID. NO: 10). O plasmídio glpDFK obtido foi de- nominado pECCG117-cdi glpDFK-2.

Exemplo 3: Introdução no Corynebacterium slutamicum ATCC13032.

Os pECCG117-cdi glpDFK-1 e o pECCG117-cdi glpDFK-2 pre- parados são introduzido na Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, res- 25 pectivamente pelo método de pulso elétrico. As células são cultivadas num meio em placa contendo bacto-peptona 10 g/L, extrato de levedura 10 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCI 2,5 g/L e canamicina 25 ?/mL. As colônias obti- das seguiram com a clonagem por PCR para selecionar as colônias conten- do o plasmídio compreendendo o gene envolvido no uso do glicerol. As ce- 30 pas selecionadas são denominadas respectivamente de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1, e Corynebacterium glu- tamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2. Exemplo 4: Disponibilidade de glicerol da Corvnebacterium glutamicum ATCC 13032

Para confirmar a disponibilidade de glicerol da Corynebacterium glutamicum/pECCGIM-cdl glpDFK-1 e Corynebacterium glutamicum/ 5 pECCG117-cdi glpDFK-2, a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 con- tendo o plasmídio acima e Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 não contendo o plasmídio são respectivamente cultivados no meio mínimo sóli- do. A composição do meio mínimo é tal como se segue.

Composição do meio mínimo da cultura de Corvnebacterium slutamicum (pH 7,2):

Glicerol 10 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO4-H2O 0,4 g/L, ureia 2 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, NaCI 0,5 g/L, amida de ácido nicotínico 5 mg/L, pantotenato de cálcio 1 mg/L, tiamina 3 mg/L, biotina 200 ?/L, elemen- tos traço 1 mL, agar-agar 20 g/L.

A cepa inoculada foi culta em uma incubadora 30? durante 48

horas. Como resultado o crescimento da Corynebacterium glutamicum intro- duzida com o pECCG117-cdi glpDF-1 ou pECCG117-cdi glpDF-2 foi confir- mado no meio mínimo. Mas, o crescimento da cepa não introduzida com o plasmídio foi insignificante.

O crescimento das duas cepas no meio mínimo líquido também

foi investigado. Em primeiro lugar, as duas cepas são inoculadas no meio de semeadura, seguido pela cultura durante 24 horas. O meio foi eliminado por centrifugação. O meio restante foi completamente eliminado por dispersão por duas vezes em tampão de fosfato (pH 7,0). A cepa é inoculada em 40 25 mL do meio mínimo, seguido pelo cultivo em 30°C durante 36 horas. O cres- cimento foi comparado entre as duas cepas. Os meios mínimos foram su- plementados com diferentes fontes de carbono, 12 g/L de glicose; 12 g/L de glicerol; 6 g/L de cada glicose e glicerol, para comparar a disponibilidade de glicerol. E os resultados são mostrados na figura 1.

Tal como mostrado na figura 1, o Corynebacterium glutamicum

ATCC 13032 não introduzido com o gene envolvido no uso do glicerol não cresceu tão bem porque ele não pode usar o glicerol eficazmente. Ao mes- mo tempo, a cepa introduzida com o gene envolvido no uso do glicerol foi bem cultivada pelo uso o glicerol como uma fonte de carbono. Quando o gli- cerol foi acrescentado sozinho, favoreceu o crescimento da Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG 117-cdi glpDFK-2. Mas, quando a glicose so- 5 zinha ou ambos a glicose e o glicerol são acrescentados em conjunto, foi favo- recido o crescimento da Corynebacterium glutamicum ATCC13032/ pECCGI 17-cdi glpDFK-1, e desse modo elas são usadas nesse experimento. Exemplo 5: Disponibilidade de glicerol a partir de uma cepa produtora de ácido glutâmico.

Para confirmar se foi possível não somente produzir materiais

úteis, mas também estimular o crescimento de Corynebacteria utilizando glicerol, o de vetor de expressão pECCGI 17-cdi glpDFK-1 foi introduzido na Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112), que é uma cepa produto- ra de ácido glutâmico, da mesma maneira que descrito no Exemplo 3. A pro- 15 dutividade de ácido glutâmico foi comparada entre Corynebacterium glutami- cum SM5 e Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 com diferentes fontes de carbono (glicerol sozinho, glicose sozinha, e glicose e glicerol em conjunto (misturados na proporção necessária)). A Corynebac- terium glutamicum SM5 e a Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117- 20 cdi glpDFK-1 são inoculadas no meio de semeadura com um laço de platina, seguido pelo cultivo em 30°C durante 18 horas. A composição do meio de semeadura foi como se segue: peptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, caldo de carne 0,5 g/L, glicose 1 g/L, cloreto de sódio 0,25 g/L, ureia 0,13 g/L, pH 7,2. Para a fermentação, 1 mL da solução da cultura de semeadura foi 25 inoculado no meio de cultura, seguido pelo cultivo em 30°C durante 24 ho- ras. A composição do meio de cultura foi tal como se segue: HSM 3 mL, bio- tina 1 ?/L, resíduo de melaço 0,05 g/L, sulfato de amônio 0,1 g/L, sulfato de ferro 0,002 g/L, sulfato de manganês 0,002 g/L, sulfato de magnésio 0,05 g/L, tiamina-HCI 500 ?/L, fosfato de monopotássio 0,2 g/L, ureia 0,95 g/L, pH 30 7,2. Uma fonte de carbono foi acrescentada ao mesmo considerando as condições de cultura. Como resultado a produção de L-ácido-glutâmico foi confirmada e os resultados de comparação são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Comparação do crescimento e produtividade de ácido glutâmico em meio de fermentação contendo glicerol entre

Corynebacterium glutamicum SM5 e SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1.

SM5 S M5/117-cd i glpDFK-' 24h 51h 72h 120h 24 h 51 h 72h 120h Glicose 7,73 10,15 9,36 9,72 5,94 9,92 9,0 9,89 30 g/L D.O. Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 4,69 7,09 6,86 6,27 4,68 7,94 6,8 6,77 Glicerol 1,45 2,16 1,56 1,14 1,87 1,82 1,4 1,38 30 g/L Glucose consumida Glicose 10,47 30,93 30,93 30,93 8,73 30 30 30 30 g/L (g/L) Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 5,21 15,21 15,21 15,21 3,96 15 15 15 Glicerol 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 30 g/L Glicerol consumido Glicose 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 30 g/L (g/L) Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 1,46 2,3 2,30 2,30 2,15 15 15 15 Glicerol 2,75 3,4 4,75 4,31 3,62 6,5 8,0 7,89 30 g/L Ácido glutâmico Glicose 0,85 6,63 6,42 6,55 1,17 11,06 11,1 11,21 30 g/L produzido (g/L) Glicose 30 g/L, glicerol 15 g/L 0,23 1,69 1,76 1,71 0,82 11,86 12,0 12,47 Glicerol 0,03 0 0,05 0,00 0,19 1,6 1,9 1,96 30 g/L Tal como mostrado na Tabela 1, quando o glicerol foi usado so- zinho como uma fonte de carbono, o crescimento da Corynebacterium glu- tamicum SM5 foi muito pobre e a produtividade de ácido glutâmico foi insig- nificante. Ao mesmo tempo, a Corynebacterium glutamicum 5 SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 pode crescer até com a utilização de glicerol sozinho como uma fonte de carbono, e pode produzir o ácido glutâmico com rendimento semelhante, mesmo se a produtividade foi reduzida. Quando o glicerol foi acrescentado em conjunto com a glicose (aproximadamente 50:50), o ácido glutâmico foi produzido sem reduzir o rendimento ou a produ- 10 tividade. Mas, a SM5 exibiu uma produção reduzida de ácido glutâmico.

Exemplo 6: Introdução de um gene envolvido no uso de glicerol em uma ce- pa produtora de lisina e produção de lisina usando o mesmo.

Para investigar se foi possível produzir não somente os materiais úteis, mas também estimular o crescimento da Corynebacteria utilizando de glicerol, o vetor de expressão pECCGI 17-cdi glpDFK-1 foi introduzido na Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881), uma cepa produtora de lisina, pelo mesmo modo que foi descrito no Exemplo 3.

A cepa original Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 e KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1, as cepas da presente invenção, fo- 20 ram inoculadas respectivamente em frascos de cantos arredondados de 250 ml contendo 25 ml do meio de semeadura, seguido pela agitação da cultura (200 revoluções por minuto) em 30°C durante 20 horas. 1 ml da solução de cultivo de sementes foi inoculado em frascos de cantos arredondados de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção, seguido pela agitação da cultu- 25 ra (200 revoluções por minuto) em 30°C durante 72 horas. Quando da finali- zação da cultura, a produção de L-Iisina foi medida com um analisador de aminoácido. Os níveis de L-Iisina nas culturas de Corynebacterium glutami- cum KFCC10881 e KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1 foram investiga- dos e os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

Fonte de Carbono 72 horas DO Consumo de Consumo de Lisina glucose (g/L) glicerol (g/L) KFCC Glicose 100 g/L 42,4 100,0 23,90 43,2 100,0 21,74 Glicose 50 g/L 32,8 50,0 0,00 13,22 32,7 50,0 0,00 13,52 KFCC 10881/ Glicose 100 g/L 27,4 100,0 41,27 22,3 100,0 41,27 Glicose 50 g/L 34,3 50,0 50,0 28,95 33,9 50,0 50,0 30,89 Tal como mostrado na Tabela 2, quando o vetor pECCGI 17-cdi glpDFK-1 contido no gene envolvido no uso do glicerol foi introduzido na ce- pa produtora de lisina, a cepa exibiu a disponibilidade ao glicerol diferente da cepa original, e a produção de lisina foi aumentada.

Meio de Semeadura (pH 7.0):

Açúcar bruto 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, K2HPO4 8 g, MgS04.7H20 0,5 g, biotina 100?, tiamina-HCI 1000?, pantotenato de cálcio 2000?, nicotinamida 2000? (em 1 litro de água de pro- cesso).

Meio de produção (pH 7.0):

Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de Soja 2,5g, Sóidos de infusão de milho 5 g, ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgS04.7H20 0,5 g, biotina 100?, tiamina HCI 1000?, cálcio-ácido pantotênico 2000?, nicotinamida 3000?, CaCO3 30 g (em 1 litro de água de processo).

Aplicabilidade Industrial

Tal como explicado anteriormente, a presente invenção fornece um método para produção de um produto de fermentação com alto rendi- mento, utilizando eficazmente glicerol que é o subproduto da indústria do 20 óleo e da produção de biodiesel. O micro-organismo da presente invenção pode produzir o produto de fermentação eficazmente no meio contendo uma fonte complexa de carbono compreendendo glicerol e no meio contendo gli- cerol sozinho como uma fonte de carbono. Desse modo, o micro-organismo capaz de produzir o produto de fermentação, baseado no micro-organismo da presente invenção, pode usar eficazmente o glicerol como uma fonte de carbono.

Os versados na técnica apreciarão que os conceitos e as moda- 5 Iidades específicas divulgadas na descrição precedente podem ser pronta- mente utilizados como uma base para modificar ou projetar outras modalida- des para executar os mesmos objetivos da presente invenção. Os versados na técnica também apreciarão que tais modalidades equivalentes não fogem do espírito e do alcance da invenção tal como apresentado nas reivindica- 10 ções anexas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> CJ Cheiljedang Corporation

<120> Processo para a produção de produto de fermentação de fontes

carbono

contendo glicerol usando corinebacteria

<130> P009-0177 <150> KR 10-2007-007513 <151> 2007-01-24 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Sequencia Artificial <220> <223> Iniciador 1 <400> 1

gatgcggccg cgctgtgtgg cgtatgtcg

<210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Sequencia Artificial <220> <223> iniciador 2 <400> 2

gatgcggccg caatcatcaa acccaacccc a

<210> 3

<211> 4261

<212> DNA

<213> Sequencia Artificial <220>

<223> Sequencia do DNA da glpDFK-1 da pECCG117-cdi glpDFK-1

<220>

<221> mutação

<222> (54)

<223> timina -> citidina

<220>

<221> mutação

<222> (1598)

<223> adenina -> guanina

<220>

<221> mutação <222> (2608) <223> adenina -> guanina <220>

<221> mutação <222> (2829)

<223> adenina -> guanina

<220>

<221> mutação <222> (3037)

<223> adenina -> guanina

<4 00> 3

gctgtgtggc gtatgtcgcg cagcccgttt tttgccgcca ccaccactgg ttacatcacc 60

tgctaccagt tgttatcatc tccgaaacta aaaaacttgc tctaggggtc tagtctgcct 120

aacttacggt tcagtagggt tggggcaaac ctcggacgca aagaaggagt gtggcaacta 180

tgaccacgaa atcccattgc acattcaacc Gcgactacta ccaggacgtc tggcagcgct 240

tcggtgaaga agaatacgac gttgtcgtca tcggtggcgg ctccgtcggc gcaggcgcag 300

gcctcgacgc agccatccgc ggcctcaaag tggccgtcgt agagtcccga gacttcgcag 360

ccggcacctc ctcacgatca tcaaaaatgt tccacggtgg cctgcgatat ctcgccatgc 420

tggacttcaa gctagtggcc gaatccctcc acgagcgcga actcaacatg tcgacgctcg 4 80

caccgcacct agtcaagccg ctgaaattcc tcttccccct cacacaccac gtgtgggaac 540

gggtgatgat gttcggcggc tttactcttt acgacctcat gggcggcgca aaatcagtcc 600

ccatgcaaaa gcactactcc cgcaagggaa cactcgccat ggccccagga ctaaaagacg 660

acgctgtggt cggatccgtc cgctactttg acacgcttgt cgacgacgcc cgccacacca 720

tgacagtcct acgcaccgcc ggcgaactcg gcgcagatgt tcgcccctcc acccaagtag 780

tcggctttga aaaagacggc caacgcgtgg tcggcgccat cctccaagac accgacaccg 840

gcgaacaaac caccatccgc ggcaaggtat tcatcaacgc caccggcgta tggaacgacc 900

acattgaaaa gctcgccggc ggcaacggcc ccttctcggt ccacgcctcc aagggcgtac 960

acatcgtggt accaaagaac gtctttgatg ccgacgcagc catgtgcttt gtcaccgaaa 1020

agtccgtgct cttcgtgatc ccatggggtg aatactggat catcggcacc accgacaccg 1080

actgggatct caaccgcgca gaccccgcac caactgccgc cgacatcaac tacatcctcg 114 0

acgaagtcaa ccagcgagtc cgccggccca tccaacactc cgacatcgtc ggcgtgtact 1200

ccggactccg cccgctgctc tccggcaaat ccgacaccac caccaagctg tcgcgcaacc 1260

acgccgtagc aaaggtcatg cctggactcg tctccgtcgc cggcggtaag tacaccacct 1320

accgtgtgat cggcaaggat gcagtcgacc tcgccaccga agacttggac ttccgcgtac 1380

cagcctccga atcggaacgc accccgatcc tcggtgccga cggctaccac gccctacaaa 1440

accaagcacc acgcatcgcc cgcaccttcg gcaccacaga ggacgtcgtc gagcacctgc 1500

tcggccgcta cggctccctc gtccatgagg tcctagaacc gagcgtcgat aaacctgagc 1560 tgctcgaacc catcccaggc gcgccgggct acattaaggc agaggcegtc tatgccgtca 1620 cccacgaggg tgccctgcac gtcgaggaca tcgtggaacg tcgcctacgt gccggcatcg 1680 aatacgccga ccgtggcgtt gccgcagctc ccgccatcgc cgagctcgtt gccgactacc 1740 ttggctggga cgccgagcgc accgccgccg aggtcaccgc gttcaccgac cgcgtgtccg 1800 ccgaaatcgc cgccgagaag gagctcactg acaaagccgc caacgagcac atcgtggcag 1860 gctccgcggt gcgcagctat gtggatgtgt caggtgataa ctaatgaccg ccctacaagc 1920 attcggctgg gagtttttgg gcacagccct cctgcttctc ctcggtaacg gcgtttgcgc 1980 cgtcaacagc ctgcgcacct ccgcaggcaa aggcactggc tgggtgctta tcgctttcgg 2040 ctggggcatg gcggtattcg tcggtgcctc agtggcaagc cccagcggcg gccacctcaa 2100 cccagcggtc actatcgcgc tggcgatcaa aggcagcaca ccatggaacc tggtaggcgg 2160 ctatgttctc gggcagttcc tcggagccat gtttggtgca atcctgtgct ggctgacatt 2220 caagcagctt ttcgacgcca acaacaccga cgaaaacgga aacgtcacgg gagctaaccg 2280 caccaccggc ggtatcttct tcaccggccc cgcccacaat cagaacgggt ggaacatggt 2340 caccgagttc atcggcacct gcgtactgct gctgttcatc ttcttcggcc ccaccggcgg 2400 cgacctaggc cccatgacct atttcgcagt cgcctttgtg atcgttgcca taggcttgtc 2460 gctaggcaca ccgaccggct acgccatcaa ccctgtgcgt gacctcggcc cccgcctgat 2520 gtacgccttc gtgctgccca ttaaagacaa aggatccgcg aactggggct atgcctgggt 2580 tccgatcgtc ggccccatga tcgccgcggt cttctgcgga gtgctggcca ctgtagtgct 2640 gtagtgaaag ggaaccacac caatgaatca accacagtat gttgctgcga ttgaccaagg 2700 aacgacgtcg acacgctgca tcattttcga ccacaacggc caacaagtag gcgttggcca 2760 gtacgaacac gaacaaatct tcccccaaaa aggetgggta gagcacaacc caatggaaat 2820 ctgggccagc acgcgccaag ccgttgggac agcactcgcc gaaagcgacg tctcccgtga 2880 agacatcgta gccgtaggca taacaaacca gcgtgaaacc acggtggtct ggaacaaaac 2940 tactggtgaa cccatatata acgccattgt gtggcaggac acccgcacta actccatctg 3000 ctcggagtta gcccaaggcg accctgcccg gtggcagaaa cgtaccggtt tgctcatcaa 3060 ctcatacccc gcgggccccc gactcaagtg gatattggae aacgtcgagg gtgcccgcga 3120 actagcagag aacggcgatt tgctcttcgg aaccattgat acgtggttgc tgtggaacct 3180 gaccggcggt gccgagggtg acaacggcca gcctgccgtt cacgctaccg acgtaaccaa 3240 tgcctcccgc accctactca tggatctgga ateeetgcaa tgggatgagg aactatgtgc 3300 cgcgttggat attccaatgc aggtgttgcc agagattcgt ccttcagttg gtaacttcgg 3360 ccaagtacgt gcacgtggat cactagctgg tgttcegatc cgcgccatcc tcggtgacca 3420 gcaagccgca atgttcggac aggcatgctt eeggeeaggt gatgccaaat gtacatacgg 3480 cacggggttg ttccttctgg agaacacagg caaaaccccg aagcattccg aaaacggttt 3540 gctcaccacc gtgtgtttcc agctcgaagg cgaaaaaecg gtctatgccc tcgaaggatc 3600 cgttgccatg gggggctcgc tcgtccaatg gctacgcgac aaccttcaaa tcatcccgaa 3660

ctcgcccgcc attgaaaacc tcgcacgcga agtacccgac aacggtggcg tgtacatcgt 3720

ccccgcattc tccggactat tcgcaccacg ctggcgcccc gacgcccgcg gggtcatcgt 3780

gggcctgacc cgctttgcca accgcaagca cctcgcccgc gcagtactcg aggccaccgc 3840

ctaccaagtg cgcgaagtga tcgatgccat ggtcgcggat tccggagtag aactcaccga 3900

aatgcgtgtc gacggcggca tggtcatgaa cgaactgctc atgcaattcc aagccgacgt 3960

cctacgatcc gacgtcacgc gccccaagaa catcgagacc acagccaccg gcgtagccta 4020

cgcagccggc ctcggcgtgg gctactggga cagcctcgac gtactccgca acatgaacga 4080

agtggacaaa acctggcacg ccaagatgga cgccgacaag atcgacgagc tccttgccga 4140

atggaacaaa gcagtcgaac gcacctacaa ctgggaaaac taactgcctc ctgaaataac 4200

agcaaacccg acgaactatc cagctcgtcg ggtttgtttt gtggggttgg gtttgatgat 42 60

t 4261

<210> 4 <211> 577 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de aminoácidos do GlpD da pECCG117-cdi glpDFK-1 <400> 4

Met Ala Thr Met Thr Thr Lys Ser His Cys Thr Phe Asn Pro Asp Tyr 10 15

Tyr Gln Asp Val Trp Gln Arg Phe Gly Glu Glu Glu Tyr Asp Val Val 20 25 30

Val He Gly Gly Gly Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Leu Asp Ala Ala 35 40 45

He Arg Gly Leu Lys Val Ala Val Val Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ala 50 55 60

Gly Thr Ser Ser Arg Ser Ser Lys Met Phe His Gly Gly Leu Arg Tyr 65 70 75 80

Leu Ala Met Leu Asp Phe Lys Leu Val Ala Glu Ser Leu His Glu Arg 85 90 95

Glu Leu Asn Met Ser Thr Leu Ala Pro His Leu Val Lys Pro Leu Lys 100 105 HO

Phe Leu Phe Pro Leu Thr His His Val Trp Glu Arg Val Met Met Phe 115 120 125

Gly Gly Phe Thr Leu Tyr Asp Leu Met Gly Gly Ala Lys Ser Val Pro 130 135 140

Met Gln Lys His Tyr Ser Arg Lys Gly Thr Leu Ala Met Ala Pro Gly 145 150 155 160

Leu Lys Asp Asp Ala Val Val Gly Ser Val Arg Tyr Phe Asp Thr Leu 165 170 175 Val Asp Asp Ala Arg His Thr Met Thr Val Leu Arg Thr Ala Gly Glu 180 185 190

Leu Gly Ala Asp Val Arg Pro Ser Thr Gln Val Val Gly Phe Glu Lys 195 200 205

Asp Gly Gln Arg Val Val Gly Ala He Leu Gln Asp Thr Asp Thr Gly 210 215 220

Glu Gln Thr Thr Ile Arg Gly Lys Val Phe Ile Asn Ala Thr Gly Val 225 230 235 240

Trp Asn Asp His Ile Glu Lys Leu Ala Gly Gly Asn Gly Pro Phe Ser 245 250 255

Val His Ala Ser Lys Gly Val His Ile Val Val Pro Lys Asn Val Phe 260 265 270

Asp Ala Asp Ala Ala Met Cys Phe Val Thr Glu Lys Ser Val Leu Phe 275 280 285

Val Ile Pro Trp Gly Glu Tyr Trp Ile Ile Gly Thr Thr Asp Thr Asp 290 295 300

Trp Asp Leu Asn Arg Ala Asp Pro Ala Pro Thr Ala Ala Asp Ile Asn 305 310 315 320

Tyr Ile Leu Asp Glu Val Asn Gln Arg Val Arg Arg Pro Ile Gln His 325 330 335

Ser Asp Ile Val Gly Val Tyr Ser Gly Leu Arg Pro Leu Leu Ser Gly 340 345 350

Lys Ser Asp Thr Thr Thr Lys Leu Ser Arg Asn His Ala Val Ala Lys 355 360 365

Val Met Pro Gly Leu Val Ser Val Ala Gly Gly Lys Tyr Thr Thr Tyr 370 375 380

Arg Val Ile Gly Lys Asp Ala Val Asp Leu Ala Thr Glu Asp Leu Asp 385 390 395 400

Phe Arg Val Pro Ala Ser Glu Ser Glu Arg Thr Pro Ile Leu Gly Ala 405 410 415

Asp Gly Tyr His Ala Leu Gln Asn Gln Ala Pro Arg Ile Ala Arg Thr 420 425 430

Phe Gly Thr Thr Glu Asp Val Val Glu His Leu Leu Gly Arg Tyr Gly 435 440 445

Ser Leu Val His Glu Val Leu Glu Pro Ser Val Asp Lys Pro Glu Leu 450 455 460

Leu Glu Pro Ile Pro Gly Ala Pro Gly Tyr Ile Lys Ala Glu Ala Val 465 470 475 480

Tyr Ala Val Thr His Glu Gly Ala Leu His Val Glu Asp Ile Val Glu 485 490 495

Arg Arg Leu Arg Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Arg Gly Val Ala Ala 500 505 510

Ala Pro Ala Ile Ala Glu Leu Val Ala Asp Tyr Leu Gly Trp Asp Ala 515 520 525 Glu Arg Thr Ala Ala Glu Val Thr Ala Phe Thr Asp Arg Val Ser Ala 530 535 540

Glu Ile Ala Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Lys Ala Ala Asn Glu His 545 550 555 560

Ile Val Ala Gly Ser Ala Val Arg Ser Tyr Val Asp Val Ser Gly Asp 565 570 575

Asn

<210> 5

<211> 246

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de aminoácidos do GlpF da pECCG117-cdi glpDFK-1

<4 00> 5

Met Thr Ala Leu Gln Ala Phe Gly Trp Glu Phe Leu Gly Thr Ala Leu 10 15

Leu Leu Leu Leu Gly Asn Gly Val Cys Ala Val Asn Ser Leu Arg Thr 20 25 30

Ser Ala Gly Lys Gly Thr Gly Trp Val Leu Ile Ala Phe Gly Trp Gly 35 40 45

Met Ala Val Phe Val Gly Ala Ser Val Ala Ser Pro Ser Gly Gly His 50 55 60

Leu Asn Pro Ala Val Thr Ile Ala Leu Ala Ile Lys Gly Ser Thr Pro 65 70 75 80

Trp Asn Leu Val Gly Gly Tyr Val Leu Gly Gln Phe Leu Gly Ala Met 85 90 95

Phe Gly Ala Ile Leu Cys Trp Leu Thr Phe Lys Gln Leu Phe Asp Ala 100 105 110

Asn Asn Thr Asp Glu Asn Gly Asn Val Thr Gly Ala Asn Arg Thr Thr 115 120 125

Gly Gly Ile Phe Phe Thr Gly Pro Ala His Asn Gln Asn Gly Trp Asn 130 135 140

Met Val Thr Glu Phe Ile Gly Thr Cys Val Leu Leu Leu Phe Ile Phe 145 150 155 160

Phe Gly Pro Thr Gly Gly Asp Leu Gly Pro Met Thr Tyr Phe Ala Val 165 170 175

Ala Phe Val Ile Val Ala Ile Gly Leu Ser Leu Gly Thr Pro Thr Gly 180 185 190

Tyr Ala Ile Asn Pro Val Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Met Tyr Ala 195 200 205

Phe Val Leu Pro Ile Lys Asp Lys Gly Ser Ala Asn Trp Gly Tyr Ala 210 215 220

Trp Val Pro Ile Val Gly Pro Met Ile Ala Ala Val Phe Cys Gly Val 225 230 235 240 Leu Ala Thr Val Val Leu 245

<210> 6

<211> 506

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de aminoácidos do GlpK da pECCG117-cdi glpDFK-1

<4 00> 6

Met Asn Gln Pro Gln Tyr Val Ala Ala Ile Asp Gln Gly Thr Thr Ser 15 10 15

Thr Arg Cys Ile Ile Phe Asp His Asn Gly Gln Gln Val Gly Val Gly 20 25 30

Gln Tyr Glu His Glu Gln Ile Phe Pro Gln Lys Gly Trp Val Glu His 35 40 45

Asn Pro Met Glu Ile Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ala Val Gly Thr Ala 50 55 60

Leu Ala Glu Ser Asp Val Ser Arg Glu Asp Ile Val Ala Val Gly Ile 65 70 75 80

Thr Asn Gln Arg Glu Thr Thr Val Val Trp Asn Lys Thr Thr Gly Glu 85 90 95

Pro Ile Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr Asn Ser Ile 100 105 110

Cys Ser Glu Leu Ala Gln Gly Asp Pro Ala Arg Trp Gln Lys Arg Thr 115 120 125

Gly Leu Leu Ile Asn Ser Tyr Pro Ala Gly Pro Arg Leu Lys Trp Ile 130 135 140

Leu Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Leu Ala Glu Asn Gly Asp Leu 145 150 155 160

Leu Phe Gly Thr Ile Asp Thr Trp Leu Leu Trp Asn Leu Thr Gly Gly 165 170 175

Ala Glu Gly Asp Asn Gly Gln Pro Ala Val His Ala Thr Asp Val Thr 180 185 190

Asn Ala Ser Arg Thr Leu Leu Met Asp Leu Glu Ser Leu Gln Trp Asp 195 200 205

Glu Glu Leu Cys Ala Ala Leu Asp Ile Pro Met Gln Val Leu Pro Glu 210 215 220

Ile Arg Pro Ser Val Gly Asn Phe Gly Gln Val Arg Ala Arg Gly Ser 225 230 235 240

Leu Ala Gly Val Pro Ile Arg Ala Ile Leu Gly Asp Gln Gln Ala Ala 245 250 255

Met Phe Gly Gln Ala Cys Phe Arg Pro Gly Asp Ala Lys Cys Thr Tyr 260 265 270

Gly Thr Gly Leu Phe Leu Leu Glu Asn Thr Gly Lys Thr Pro Lys His 275 280 285 Ser Glu Asn Gly Leu Leu Thr Thr Val Cys Phe Gln Leu Glu Gly Glu 290 295 300

Lys Pro Val Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Met Gly Gly Ser Leu 305 310 315 320

Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Gln He Ile Pro Asn Ser Pro Ala 325 330 335

Ile Glu Asn Leu Ala Arg Glu Val Pro Asp Asn Gly Gly Val Tyr Ile 340 345 350

Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Arg Trp Arg Pro Asp Ala 355 360 365

Arg Gly Val Ile Val Gly Leu Thr Arg Phe Ala Asn Arg Lys His Leu 370 375 380

Ala Arg Ala Val Leu Glu Ala Thr Ala Tyr Gln Val Arg Glu Val Ile 385 390 395 400

Asp Ala Met Val Ala Asp Ser Gly Val Glu Leu Thr Glu Met Arg Val 405 410 415

Asp Gly Gly Met Val Met Asn Glu Leu Leu Met Gln Phe Gln Ala Asp 420 425 430

Val Leu Arg Ser Asp Val Thr Arg Pro Lys Asn Ile Glu Thr Thr Ala 435 440 445

Thr Gly Val Ala Tyr Ala Ala Gly Leu Gly Val Gly Tyr Trp Asp Ser 450 455 460

Leu Asp Val Leu Arg Asn Met Asn Glu Val Asp Lys Thr Trp His Ala 465 470 475 480

Lys Met Asp Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Leu Ala Glu Trp Asn Lys 485 490 495

Ala Val Glu Arg Thr Tyr Asn Trp Glu Asn 500 505

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> iniciador 3

<400> 7

ggaaatctgg gccaacacgc gccaagcc

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> iniciador 4

<400> 8

ggcttggcgc gtgttggccc agatttcc

28 <210> 9

<211> 4261

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sequencia de DNA do glpDFK-2 do pECCG117-cdi glpDFK-2

<400> 9 gtatgtcgcg cagcccgttt tttgccgcca ccaccactgg ttacatcacc 60 gctgtgtggc tgctaccagt tgttatcatc tccgaaacta aaaaacttgc tctaggggtc tagtctgcct 120 aacttacggt tcagtagggt tggggcaaac ctcggacgca aagaaggagt gtggcaacta 180 tgaccacgaa atcccattgc acattcaacc ccgactacta ccaggacgtc tggcagcgct 240 tcggtgaaga agaatacgac gttgtcgtca tcggtggcgg ctccgtcggc gcaggcgcag 300 gcctcgacgc agccatccgc ggcctcaaag tggccgtcgt agagtcccga gacttcgcag 3 60 ccggcacctc ctcacgatca tcaaaaatgt tccacggtgg cctgcgatat ctcgccatgc 420 tggacttcaa gctagtggcc gaatccctcc acgagcgcga actcaacatg tcgacgctcg 480 caccgcacct agtcaagccg ctgaaattcc tcttccccct cacacaccac gtgtgggaac 540 gggtgatgat gttcggcggc tttactcttt acgacctcat gggcggcgca aaatcagtcc 600 ccatgcaaaa gcactactcc cgcaagggaa cactcgccat ggccccagga ctaaaagacg 660 acgctgtggt cggatccgtc cgctactttg acacgcttgt cgacgacgcc cgccacacca 720 tgacagtcct acgcaccgcc ggcgaactcg gcgcagatgt tcgcccctcc acccaagtag 780 tcggctttga aaaagacggc caacgcgtgg tcggcgccat cctccaagac accgacaccg 840 gcgaacaaac caccatccgc ggcaaggtat tcatcaacgc caccggcgta tggaacgacc 900 acattgaaaa gctcgccggc ggcaacggcc ccttctcggt ccacgcctcc aagggcgtac 960 acatcgtggt accaaagaac gtctttgatg ccgacgcagc catgtgcttt gtcaccgaaa 1020 agtccgtgct cttcgtgatc ccatggggtg aatactggat catcggcacc accgacaccg 1080 actgggatct caaccgcgca gaccccgcac caactgccgc cgacatcaac tacatcctcg 1140 acgaagtcaa ccagcgagtc cgccggccca tccaacactc cgacatcgtc ggcgtgtact 1200 ccggactccg cccgctgctc tccggcaaat ccgacaccac caccaagctg tcgcgcaacc 1260 acgccgtagc aaaggtcatg cctggactcg tctccgtcgc cggcggtaag tacaccacct 1320 accgtgtgat cggcaaggat gcagtcgacc tcgccaccga agacttggac ttccgcgtac 1380 cagcctccga atcggaacgc accccgatcc tcggtgccga cggctaccac gccctacaaa 1440 accaagcacc acgcatcgcc cgcaccttcg gcaccacaga ggacgtcgtc gagcacctgc 1500 tcggccgcta cggctccctc gtccatgagg tcctagaacc gagcgtcgat aaacctgagc 1560 tgctcgaacc catcccaggc gcgccgggct acattaaggc agaggccgtc tatgccgtca 1620 cccacgaggg tgccctgcac gtcgaggaca tcgtggaacg tcgcctacgt gccggcatcg 1680 aatacgccga ccgtggcgtt gccgcagctc ccgccatcgc cgagctcgtt gccgactacc 1740 ttggctggga cgccgagcgc accgccgccg aggtcaccgc gttcaccgac cgcgtgtccg 1800 ccgaaatcgc cgccgagaag gagctcactg acaaagccgc caacgagcac atcgtggcag 1860 gctccgcggt gcgcagctat gtggatgtgt caggtgataa ctaatgaccg ccctacaagc 1920 attcggctgg gagtttttgg gcacagccct cctgcttctc ctcggtaacg gcgtttgcgc 1980 cgtcaacagc ctgcgcacct ccgcaggcaa aggcactggc tgggtgctta tcgctttcgg 2040 ctggggcatg gcggtattcg tcggtgcctc agtggcaagc cccagcggcg gccacctcaa 2100 cccagcggtc actatcgcgc tggcgatcaa aggcagcaca ccatggaacc tggtaggcgg 2160 ctatgttctc gggcagttcc tcggagccat gtttggtgca atcctgtgct ggctgacatt 2220 caagcagctt ttcgacgcca acaacaccga cgaaaacgga aacgtcacgg gagctaaccg 2280 caccaccggc ggtatcttct tcaccggccc cgcccacaat cagaacgggt ggaacatggt 2340 caccgagttc atcggcacct gcgtactgct gctgttcatc ttcttcggcc ccaccggcgg 2400 cgacctaggc cccatgacct atttcgcagt cgcctttgtg atcgttgcca taggcttgtc 2460 gctaggcaca ccgaccggct acgccatcaa ccctgtgcgt gacctcggcc cccgcctgat 2520 gtacgccttc gtgctgccca ttaaagacaa aggatccgcg aactggggct atgcctgggt 2580 tccgatcgtc ggccccatga tcgccgcggt cttctgcgga gtgctggcca ctgtagtgct 2640 gtagtgaaag ggaaccacac caatgaatca accacagtat gttgctgcga ttgaccaagg 2700 aacgacgtcg acacgctgca tcattttcga ccacaacggc caacaagtag gcgttggcca 2760 gtacgaacac gaacaaatct tcccccaaaa aggctgggta gagcacaacc caatggaaat 2820 ctgggccaac acgcgccaag ccgttgggac agcactcgcc gaaagcgacg tctcccgtga 2880 agacatcgta gccgtaggca taacaaacca gcgtgaaacc acggtggtct ggaacaaaac 2940 tactggtgaa cccatatata acgccattgt gtggcaggac acccgcacta actccatctg 3000 ctcggagtta gcccaaggcg accctgcccg gtggcagaaa cgtaccggtt tgctcatcaa 3060 ctcatacccc gcgggccccc gactcaagtg gatattggac aacgtcgagg gtgcccgcga 3120 actagcagag aacggcgatt tgctcttcgg aaccattgat acgtggttgc tgtggaacct 3180 gaccggcggt gccgagggtg acaacggcca gcctgccgtt cacgctaccg acgtaaccaa 3240 tgcctcccgc accctactca tggatctgga atccctgcaa tgggatgagg aactatgtgc 3300 cgcgttggat attccaatgc aggtgttgcc agagattcgt ccttcagttg gtaacttcgg 3360 ccaagtacgt gcacgtggat cactagctgg tgttccgatc cgcgccatcc tcggtgacca 3420 gcaagccgca atgttcggac aggcatgctt ccggccaggt gatgccaaat gtacatacgg 3480 cacggggttg ttccttctgg agaacacagg caaaaccccg aagcattccg aaaacggttt 3540 gctcaccacc gtgtgtttcc agctcgaagg cgaaaaaccg gtctatgccc tcgaaggatc 3600 cgttgccatg gggggctcgc tcgtccaatg gctacgcgac aaccttcaaa tcatcccgaa 3660 ctcgcccgcc attgaaaacc tcgcacgcga agtacccgac aacggtggcg tgtacatcgt 3720 ccccgcattc tccggactat tcgcaccacg ctggcgcccc gacgcccgcg gggtcatcgt 3780 gggcctgacc cgctttgcca accgcaagca cctcgcccgc gcagtactcg aggccaccgc ctaccaagtg cgcgaagtga tcgatgccat ggtcgcggat tccggagtag aactcaccga

aatgcgtgtc gacggcggca tggtcatgaa cgaactgctc atgcaattcc aagccgacgt

cctacgatcc gacgtcacgc gccccaagaa catcgagacc acagccaccg gcgtagccta

cgcagccggc ctcggcgtgg gctactggga cagcctcgac gtactccgca acatgaacga

agtggacaaa acctggcacg ccaagatgga cgccgacaag atcgacgagc tccttgccga

atggaacaaa gcagtcgaac gcacctacaa ctgggaaaac taactgcctc ctgaaataac

agcaaacccg acgaactatc cagctcgtcg ggtttgtttt gtggggttgg gtttgatgat t

<210> 10

<211> 506

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de aminoácidos do GlpK do pECCG117-cdi glpDFK-2

<4 00> 10

Met Asn Gln Pro Gln Tyr Val Ala Ala Ile Asp Gln Gly Thr Thr Ser 10 15

Thr Arg Cys Ile Ile Phe Asp His Asn Gly Gln Gln Val Gly Val Gly 20 25 30

Gln Tyr Glu His Glu Gln Ile Phe Pro Gln Lys Gly Trp Val Glu His 35 40 45

Asn Pro Met Glu Ile Trp Ala Asn Thr Arg Gln Ala Val Gly Thr Ala 50 55 60

Leu Ala Glu Ser Asp Val Ser Arg Glu Asp Ile Val Ala Val Gly Ile 65 70 75 80

Thr Asn Gln Arg Glu Thr Thr Val Val Trp Asn Lys Thr Thr Gly Glu 85 90 95

Pro Ile Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr Asn Ser Ile 100 105 110

Cys Ser Glu Leu Ala Gln Gly Asp Pro Ala Arg Trp Gln Lys Arg Thr 115 120 125

Gly Leu Leu Ile Asn Ser Tyr Pro Ala Gly Pro Arg Leu Lys Trp Ile 130 135 140

Leu Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Leu Ala Glu Asn Gly Asp Leu 145 150 155 160

Leu Phe Gly Thr Ile Asp Thr Trp Leu Leu Trp Asn Leu Thr Gly Gly 165 170 175

Ala Glu Gly Asp Asn Gly Gln Pro Ala Val His Ala Thr Asp Val Thr 180 185 190

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4261

Asn Ala Ser Arg Thr Leu Leu Met Asp Leu Glu Ser Leu Gln Trp Asp 195 200 205 Glu Glu Leu Cys Ala Ala Leu Asp Ile Pro Met Gln Val Leu Pro Glu 210 215 220

Ile Arg Pro Ser Val Gly Asn Phe Gly Gln Val Arg Ala Arg Gly Ser 225 230 235 240

Leu Ala Gly Val Pro Ile Arg Ala Ile Leu Gly Asp Gln Gln Ala Ala 245 250 255

Met Phe Gly Gln Ala Cys Phe Arg Pro Gly Asp Ala Lys Cys Thr Tyr 260 265 270

Gly Thr Gly Leu Phe Leu Leu Glu Asn Thr Gly Lys Thr Pro Lys His 275 280 285

Ser Glu Asn Gly Leu Leu Thr Thr Val Cys Phe Gln Leu Glu Gly Glu 290 295 300

Lys Pro Val Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Met Gly Gly Ser Leu 305 310 315 320

Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Gln Ile Ile Pro Asn Ser Pro Ala 325 330 335

Ile Glu Asn Leu Ala Arg Glu Val Pro Asp Asn Gly Gly Val Tyr Ile 340 345 350

Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Arg Trp Arg Pro Asp Ala 355 360 365

Arg Gly Val Ile Val Gly Leu Thr Arg Phe Ala Asn Arg Lys His Leu 370 375 380

Ala Arg Ala Val Leu Glu Ala Thr Ala Tyr Gln Val Arg Glu Val Ile 385 390 395 400

Asp Ala Met Val Ala Asp Ser Gly Val Glu Leu Thr Glu Met Arg Val 405 410 415

Asp Gly Gly Met Val Met Asn Glu Leu Leu Met Gln Phe Gln Ala Asp 420 425 430

Val Leu Arg Ser Asp Val Thr Arg Pro Lys Asn Ile Glu Thr Thr Ala 435 440 445

Thr Gly Val Ala Tyr Ala Ala Gly Leu Gly Val Gly Tyr Trp Asp Ser 450 455 460

Leu Asp Val Leu Arg Asn Met Asn Glu Val Asp Lys Thr Trp His Ala 465 470 475 480

Lys Met Asp Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Leu Ala Glu Trp Asn Lys 485 490 495

Ala Val Glu Arg Thr Tyr Asn Trp Glu Asn 500 505 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO- ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

... I. IDENTIFICAÇAO DO MICROORGANISMO Referência de identificação fornecida pelo depositante Número de acesso fornecido pela Escherichia coli C002-0014 AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO KCCM10834P II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA O microorganismo identificado acima (!) foi acompanhado por: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável). III. RECIBO E ACEITAÇÃO A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 08-01-2007 (data do depósito original)1. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: Korean Culture Centerof Microorganisms Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de repre¬ Endereço: 361-221, Yurim B/D sentação da Autoridade Internacional de Depósito ou Hongje-I-dong, de oficial(is) responsável(is) Seodaermun-gu Data: 08-01-2007 SEOUL120-091 Republic a da coreia 1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Interna- cional de depósito foi obtido; onde um depósito efetuado fora do Tratado de Budapeste após a aquisição do status da Autoridade Internacional de depósito é convertido em um depósito sob o Tratado de Budapeste, tal data é a data em que o microorganismo foi rece- bido pela Autoridade Internacional de depósito.

Para CJ

500 5-GA NAMDAEMEN-RO CHUNG-KU, SEOUL REPUBLICA DA COREIA

Formato DSMZ-BP/4

Claims

1. Corynebacteria possuindo uma seqüência de nucleotídios re- presentada pela SEQ. ID. NO: 9 originada da Corynebacterium diphtheríae NCTC13129, que é transformada com o glpDFK, um gene complexo facilita- dor do uso de glicerol.

2. Corynebacteria possuindo uma seqüência de nucleotídios re- presentada pela SEQ. ID. NO: 3 originada da Corynebacterium diphtheríae NCTC13129, que é transformada com o glpDFK, um gene complexo facilita- dor do uso de glicerol.

3. Corynebacteria de acordo com reivindicação 1 ou a reivindi- cação 2, em que a Corynebacteria é selecionada do grupo consistindo na Corynebaeterium glutamieum, Corynebaeterium glutamieum SM5 (KFCC- 11112) e Corynebaeterium glutamieum CF 905 (KFCC-10881).

4. Método para produzir um produto de fermentação utilizando glicerol, compreendendo as seguintes etapas de: inoculação e cultivo de Corynebaeteria transformada com glpDFK, o gene complexo facilitador do uso de glicerol em um meio de cultura contendo glicerol ou uma parte de glicerol como uma fonte de carbono; e separando da cultura o produto da fermentação.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o glpDFK possui a seqüência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 9 origi- nada da Corynebaeterium diphtheríae NCTC13129.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o glpDFK possui a seqüência de nucleotídios representada pela SEQ. ID. NO: 3 origi- nada da Corynebaeterium diphtheríae NCTC13129.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a transfor- mação é realizada com o vetor contendo o gene glpDFK.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a transfor- mação é realizada introduzindo um plasmídio que é obtido após a transfor- mação de uma célula hospedeira com o vetor contendo o gene glpDFK, na Corynebaeteria pelo método de pulso elétrico.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a célula hospedeira é a E. coli C002-0014 (Registro N0 KCCM 10834P).

10. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a Coryne- bacteria é selecionada do grupo consistindo na Corynebacterium glutami- cum, Corynebacterium glutamieum SM5 (KFCC-11112) e Corynebaeterium glutamieum CF 905 (KFCC-10881).

11. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o produto de fermentação é o ácido glutâmico ou a lisina.