BRPI0707674A2 - bactÉria capaz de produzir Ácido orgÂnico e processo para produÇço do mesmo - Google Patents

Abstract

BACTÉRIA CAPAZ DE PRODUZIR ÁCIDO ORGÂNICO E PROCESSO PARA A PRODUÇçO DO MESMO - Provê-se uma bactéria que é capaz de produzir um ácido orgânico e que é modificada de modo a ter a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase aumentada em comparação com a de uma cepa não modificada. Um ácido orgânico como o ácido succinico pode ser produzido cultivando-se a bactéria.

Description

BACTÉRIA CAPAZ DE PRODUZIR ÁCIDO ORGÂNICO E PROCESSO PARA APRODUÇÃO DO MESMO

Área Técnica

A presente invenção refere-se a uma bactéria produtorade ácido orgânico, tal como uma bactéria corineforme, erefere-se também à produção de um ácido orgânico como oácido succinico, usando a bactéria produtora de ácidoorgânico.

Técnica Antecedente

Para a produção de ácidos orgânicos, inclusive o ácidosuccinico, por fermentação, geralmente são usadas bactériasanaeróbicas como as pertencentes ao gêneroAnaerobiospirillum e ao gênero Actinobacillus (Documentos-Patentes 1 e 2 e Documento Não-Patente 1) . 0 uso debactérias anaeróbicas resulta no alto rendimento dosprodutos, ao mesmo tempo em que exige muitos nutrientespara a proliferação das bactérias anaeróbicas. Portanto, énecessário acrescentar ao meio uma grande quantidade de umafonte de nitrogênio orgânico, tal como milhocina (CSL, doinglês Corn Steep Liquor) . A adição de uma quantidadeabundante dé uma fonte de nitrogênio orgânico não somenteleva a um aumento· do custo do meio, mas leva também a umaumento do custo da purificação para isolar o produto, oque não é econômico.

Além disso, também se conhece um método no qualbactérias aeróbicas como as bactérias corineformes sãoprimeiramente cultivadas sob condições aeróbicas para queas bactérias proliferem e, então, as bactérias são mantidassob condições anaeróbicas, como bactérias em descanso, paraproduzirem um ácido orgânico (Documentos-Patentes 3 e 4).Nesse caso, para que as células bacterianas proliferem,acrescenta-se apenas uma pequena quantidade de nitrogênioorgânico; assim, trata-se de um método econômico, porque ascélulas bacterianas podem crescer suficientemente em ummeio simples; porém, trata-se de um método que aindaprecisa ser aprimorado, em termos da quantidade do ácidoorgânico desejado produzida, sua concentração e sua taxa deprodução por célula bacteriana, bem como em termos desimplificação do método de produção e semelhantes. Alémdisso, foi relatada a produção fermentativa de um ácidoorgânico usando uma bactéria na qual a atividade dafosfoenol piruvato carboxilase aumenta (Documento-Patente5), mas há necessidade de um desenvolvimento adicional daprodução fermentativa de um ácido orgânico.

Foi relatado que a atividade da 2-oxoglutaratodesidrogenase (também chamada alfa-cetoglutaratodesidrogenase) foi detectada em uma bactéria corineforme(Documento Não-Patente 2), e o gene de. 2-oxoglutaratodesidrogenase foi clonado (Documento Não-Patente 3) . Alémdo mais, foi descrito um método de produção para umaminoácido usando um microorganismo em que a atividade da2-oxoglutarato desidrogenase foi reduzida (Documento-Patente 6).

No entanto, a produção de um ácido orgânico usando umabactéria em que a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenaseseja aumentada não foi relatada até o presente.

Documento-Patente 1: Patente U.S. No. 5.143.834Documento-Patente 2: Patente U.S. No. 5.504.004Documento-Patente 3: JP-A-11-113588Documento-Patente 4: JP-A-11-196888Documento-Patente 5: JP-A-11-196887Documento-Patente 6: WO 95/34672Documento Não-Patente 1: International Journal ofSystematic Bacteriology (1999), 49, 207-216Documento Não-Patente 2: Shiio I, Ujigawa-Takeda K.1980. "Presence and regulation of alpha-ketoglutaratedehydrogenase complex in a glutamate-producing bacterium,Brevibaeterium flavum". Agric. Biol. Chem. 44: 1897-1904.Documento Não-Patente 3: Usuda Y, Tujimoto N, Abe C,Asakura Y, Kimura E, Kawahara Y, 0, Matsui H. 1996."Molecular cloning of the Corynebacterium glutamicum('Brevibacterium laetofermentum' AJ12036) odhA geneencoding a novel type of 2-oxoglutaratedehydrogenase.Mierobiology. 142: 3347-54.

Descrição da Invenção

Um objetivo da presente invenção é prover um métodopara a produção de um ácido orgânico como o ácido succinicocom eficiência produtiva mais alta.

Os inventores da presente invenção estudaramintensamente como alcançar o objetivo mencionado acima.

Como resultado, os inventores descobriram que, permitindo-se que uma bactéria modificada de modo a aumentar aatividade da 2-oxoglutarato desidrogenase, ou que umacélula tratada da mesma bactéria aja sobre uma matériaprima orgânica em uma solução de reação contendo, um ioncarbonato, um ion bicarbonato ou gás dióxido de carbono, ataxa de consumo de matéria prima, a produtividade de umácido orgânico como o ácido succinico, ou o rendimento doácido orgânico aumentam, concluindo assim a presenteinvenção.

Isto é, a presente invenção provê o seguinte:

(1) Uma bactéria que tem capacidade de produzir umácido orgânico, caracterizada por: a bactéria sermodificada de tal modo que a atxvidade da 2-oxoglutaratodesidrogenase aumenta em comparação com uma cepa nãomodificada quanto a atividade da 2-oxoglutaratodesidrogenase.

(2) Uma bactéria que tem capacidade de produzir umácido orgânico, caracterizada por: a bactéria sermodificada de tal modo que a produção de ácido acético sereduz e a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenaseaumenta, em comparação com uma .cepa não modificada quanto àatividade da 2-oxoglutarato desidrogenase.

(3) A bactéria de acordo com o item (2) acima,caracterizada por: a produção de ácido acético ser reduzidapor meio da diminuição de uma das atividades da acetatoquinase e fosfotransacetilase, ou de ambas.

(4) A bactéria de acordo com o item (2) acima,caracterizada por: a produção de ácido acético ser reduzidapor meio da diminuição da atividade da acetil-CoAhidrolase.

(5) A bactéria de acordo com o item (2) acima,caracterizada por: a produção de ácido acético ser reduzidapor meio da redução da atividade da piruvato oxidase.

(6) A bactéria de acordo com qualquer dos itens de (1)a (5) acima, caracterizada por: a bactéria seradicionalmente modificada do modo que a atividade dalactato desidrogenase diminui.

(7) A bactéria de acordo com qualquer dos itens de (1)a (6) acima, caracterizada por: a bactéria seradicionalmente modificada de modo que a atividade dapiruvato carboxilase aumenta.

(8) A bactéria de acordo com qualquer dos itens de (1)a (7) acima, caracterizada por: a bactéria ser selecionadano grupo que consiste de uma bactéria corineforme, umabactéria Bacillus, uma bactéria Rhizobium, uma bactériaEscherichia, uma bactéria Lactobacillus e uma bactériaSaccinobacillus.

(9) A bactéria de acordo com qualquer dos itens de (1)a (8) acima, caracterizada por: o ácido orgânico ser oácido succínico.

(10) Um método para produzir um ácido orgânico,caracterizado por: consistir em fazer a bactéria de acordocom qualquer um dos itens de (1) a (9) acima, ou uma célulatratada da mesma bactéria, agir sobre uma matéria primaorgânica em uma solução contendo um ion carbonato, um íonbicarbonato, ou gás de dióxido de carbono, produzindo,desse modo, um ácido orgânico, e coletar o ácido orgânico.

(11) O método de acordo com o item (10) acima,caracterizado por: consistir em fazer a bactéria ou a suacélula tratada agir sobre uma matéria prima orgânica sobatmosfera anaeróbica.

(12) O método de acordo com o item (10) ou (11) acima,caracterizado por: a matéria prima orgânica ser glicose ousucrose.

(13) O método de acordo com qualquer dos itens de (10a (12) acima, caracterizado por: o ácido orgânico ser ácidosuccinico.

(14) Um método para produzir um polímero contendo umácido orgânico, caracterizado por: consistir em: produzirum ácido orgânico pelo método de acordo com qualquer dositens de (10) a (13) acima, e submeter o ácido orgânicoobtido como matéria prima a uma reação de polimerização.

Breve Descrição dos DesenhosA Figura 1 é um diagrama que ilustra um procedimentopara a construção do plasmídeo pC3.14.

A Figura 2 é um diagrama que ilustra um procedimentopara a construção do plasmídeo pODH3.2.

Melhor Maneira para Executar a InvençãoA partir deste ponto, incorporações da presenteinvenção serão descritas com detalhes.

A bactéria da presente invenção é uma bactéria que tema capacidade de produzir um ácido orgânico e que émodificada de modo que a atividade da 2-oxoglutaratodesidrogenase (doravante aqui denominada também ODH - doinglês, Oxoglutarate DeHydrogenase) aumenta, em comparaçãocom uma cepa não modificada.

Na presente invenção, a expressão "capacidade deproduzir ácido orgânico" refere-se à capacidade de acumularum ácido orgânico em um meio quando a bactéria da presenteinvenção é cultivada nesse meio. Os exemplos de "ácidoorgânico» incluem ácidos orgânicos que servem como umintermediário metabólico no ciclo TCA e seus exemplosespecíficos incluem ácido succínico, ácido málico, ácxdofumárico, ácido cxtrico, ácido isocítrico e ácido cis-aconítico. Entre esses, os ácidos succínico, málxco efumárico são preferenciais, e o ácido succínico é maxspreferencial.

A bactéria pode ser uma bactéria obtida modifxcando-seuma bactéria que tenha a capacidade intrínseca de produzirácido orgânico, ou uma bactéria à qual tenha sido conferxdaa capacidade de produzir ácido orgânico por cultxvodirecionado ao aumento da atividade da ODH, ou pode ser umabactéria que venha a ter a capacidade de produzir ácxdoorgânico por meio de modificação para aumentar a atxvxdadeda ODH. Como método para conferir a capacidade de produzxrnnHp-se citar como exemplo umácido orgânico pelo cultxvo, pode setratamento de mutação ou tratamento de recombxnaçãogenética. Exemplos específicos incluem uma modificação paradiminuir a atxvxdade da lactato desxdrogenase e umaátiuiriflde da piruvatomodificação para aumentar a atividade aacarboxilase, conforme descrição abaixo.

A bactéria usada na presente invenção pode ser umabactéria que tenha a capacxdade de produzir doxs ou maistipos de ácido orgânico.

A bactéria que pode ser usada no método da presenteinvenção não tem Ixmxtação, desde que tenha a capacxdade deproduzxr ácxdo orgânxco. Uma bactérxa corineforme, umabactéria pertencente ao gênero Bac1Ilusr uma bactérxapertencente ao gênero Escherxchxa, uma bactérxa pertencente

ao gênero LactobaclIlusl uma bactérxa pertencente ao gênerosaccinobacillus,e uma bactéria pertencente ao gêneroRhizobium são prferiveis. Entre essas, uma bactériacorineforme é mais preferível.Como bactéria pertencente ao' gênero Escherichiaf pode-se citar como exemplo Escherichia eoli. Como bactériapertencente ao gênero Laetobaeillusf pode-se citar comoexemplo LaetobaeiUus helvetieus ( J Appl Mierobiolf 2001,91, p846-852) . Exemplos de bactérias pertencentes ao gêneroBaeillus incluem Baeillus subtilis, Baeillusanyloliquefaeiens, BaeiUus pumilus e BaeiUusstearothermophilus. Como exemplo de bactéria pertencente aogênero Rhizobiumr pode-se citar Rhizobium etli.

A bactéria corineforme não é particularmente limitada,desde que seja classificada como bactéria corineforme.Exemplos incluem uma bactéria pertencente ao gêneroCorynebaeteriumf uma bactéria pertencente ao gêneroBrevibaeteriumf- e uma bactéria pertencente ao gêneroArthrobaeter. Entre essas, é preferível uma bactériapertencente ao gênero Corynebaeterium ou uma bactériapertencente ao gênero Brevibaeterium. Os exemplos maispreferíveis incluem as bactérias classificadas comoCorynebaetenum glutamieumf Brevibaeterium f Iavuml

Brevrbaeterium ammoniagenes e Brevibaeteriumlaetofermentum.

Os exemplos especialmente preferíveis de cepas-mãe dabactéria usada na presente invenção incluem Brevibacteriimflavum MJ-233 (FERM BP-1497), Brevibaetenum flavum MJ-233AB-41 (FERM BP-1498), Brevibaeterium ammoniagenes ATCC6872,Corynebaetenum glutamieum ATCC31831, e Brevibaetenumlaetofermentum ATCC13869. Como a Brevibaeterium flavum é,às vezes, classificada como . Corynebaetenum glutamieum(Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. e Schleifer, K.H.,International Journal of Systematie Baeteriologyf 1991,vol. 41, p255-260), na presente invenção a cepa MJ-233 deBrevibaeterium flavum e sua mutante, cepa MJ-233 AB-41, sãoidênticas à cepa MJ-233 de Corynebaeterium glutamieum e àcepa MJ-233 AB-41 de Corynebacterium glutamieum,respectivamente.

Brevibacterium flavum MJ-233 foi depositada sob No. deAcesso FERM P-3068 no National Institute of Bioscience andHuman Technology, Agency of Industrial Science andTechnology, Ministry of Internacional Trade and Industry(Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana,Agência da Ciência e Tecnologia Industrial, Ministério doComércio e Industria Internacional) (atualmente,International Patent Organism Depositary NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology -Órgão Depositário de Patentes Internacionais, InstitutoNac ional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada)(Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-54566,Japão) , em 28 de abril de 1975 e, então, foi transferidapara um depósito internacional de acordo com as disposiçõesdo Tratado de Budapeste de 1 de maio de 1981, com o Númerode Acesso FERM BP-1497.

As bactérias mencionadas acima usadas como cepas-mãepodem ser quaisquer cepas, inclusive não apenas cepas dotipo selvagem, mas também mutantes obtidas pelo tratamentode mutação costumeiro, tal como irradiação UV e umtratamento com NTG, e cepas recombinantes obtidas ''por ummétodo genético, como fusão celular e um método derecombinação genética.

As bactérias da presente invenção podem ser obtidasmodificando-se as bactérias mencionadas acima que têm acapacidade de produzir um ácido orgânico, de modo que aatividade da ODH aumente. Pode-se realizar uma modificaçãopara conferir a capacidade de produzir um ácido orgânicodepois que a modificação para aumentar a atividade da ODHtiver sido realizada.

No presente documento, o termo "atividade da ODH"refere-se à atividade que catalisa uma reação na qual 2-oxoglutarato (alfa-cetoglutarato) é oxidativamentedescarboxilada para gerar succinil-CoA. 0 termo "aatividade da ODH aumenta" refere-se ao fato da atividade daODH aumentar em comparação com uma cepa não modificadaquanto à ODH. Preferivelmente, a atividade da ODH aumentano mínimo 1,5 vezes mais que a da cepa não modificadaquanto à ODH, por unidade de peso de células bacterianas e,mais preferivelmente, no mínimo 2 vezes mais do que a dacepa não modificada quanto à ODH. A atividade da ODH podeser medida de acordo com o método de Shiio e outros (IsamuShiio e Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric Biol Chemr 44(8), 1897-1904, 1980) .

Uma modificação para aumentar a atividade da ODHusando um gene da ODH pode ser realizada, por exemplo, portransformação usando um plasmídeo ou semelhante, integraçãodo gene da ODH em um cromossomo por recombinação ousemelhante, ou uma modificação de uma seqüência de controleda expressão do gene de ODH.

0 gene da ODH que pode ser usado para ser introduzidoem uma bactéria hospedeira por transformação usando umplasmídeo, etc., recombinação homóloga ou semelhante, nãotem limitação, desde que seja um gene que aumente aatividade da ODH quando o gene for introduzido na bactériahospedeira, isto é, um gene que codifique uma proteína quetenha atividade de ODH. 0 gene da ODH (odhA) derivado deuma bactéria corineforme e que tem a seqüência denucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 3 é um exemplo. 0 geneda ODH pode ser um gene homólogo, tal como um DNA quehibridize com um DNA que tenha a seqüência de nucleotídeosmencionada acima sob condições rigorosas, ou um DNA quetenha uma seqüência de nucleotídeos no mínimo 90% homóloga;preferivelmente, no mínimo 95% homóloga e, maispreferivelmente, no mínimo 99% homóloga à seqüência denucleotídeos mencionada acima, desde que codifique umaproteína que tenha uma atividade de ODH.No presente documento, condições rigorosas incluemcondições de lavagem para hibridização "southern"costumeira e, preferivelmente, incluem condições sob asquais a hibridização é realizada a 60°C, e com umaconcentração de sal equivalente a 1 χ SSC, e 0,1% SDS,preferivelmente 0,1 χ SSC e 0,1% SDS.

Além disso, também pode ser usado um gene da ODHderivado de outras bactérias além da bactéria corineforme,outros microorganismos, animais ou plantas. Como genes daODH derivados de microorganismos, animais ou plantas, podemser usados: um gene cuja seqüência de nucleotideos já tenhasido determinada e um gene com uma seqüência denucleotideos a ser determinada após isolar-se o gene quecodifica uma proteína que tem uma atividade de ODHproveniente de um cromossomo de microorganismos, animais ouplantas com base na homologia ou semelhante. Além disso,após a seqüência de nucleotideos de um gene serdeterminada, um gene sintetizado com base na seqüência denucleotideos também pode ser usado. Esses genes podem serobtidos amplificando-se regiões que incluem um promotor eum ORF, por um método de hibridização, ou por um método dePCR.,

Inserindo-se um fragmento de DNA contendo o gene deODH mencionado acima em um plasmídeo adequado, tal como umvetor plasmídeo contendo pelo menos um gene que controleuma função de replicação de plasmídeo em uma bactériacorineforme, pode-se obter um plasmídeo recombinante capazde expressar ODH em alto grau em uma bactéria corineforme.No plasmídeo recombinante mencionado acima, um promotorpara expressar o gene da ODH pode ser um promotor originadodo próprio gene da ODH, mas o promotor pode ser substituídopor outro promotor forte que possa funcionar em umabactéria hospedeira. Um promotor derivado de E. coli, talcomo um promotor tac ou um promotor trc pode ser umexemplo.

Quando o gene da ODH é introduzido na bactériacorineforme, o vetor plasmideo que pode ser usado não temlimitação, desde que contenha pelo menos um gene quecontrole uma função de replicação na bactéria corineforme.Exemplos específicos de vetores plasmídeos incluem: pCRY30,descrito em JP-A-3-210184; os plasmídeos pCRY21, pCRY2KE,pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX descritos em JP-A-2-72876 na Patente US No. 5.185.262; os plasmídeos pCRY2 epCRY3 descritos em JP-A-1-191686; pAM330 descrito em JP-A-58-67679; pHM1519 descrito em . JP-A-58-77895; pAJ655,pAJ611, e pAJ184 4 descritos em JP-A-58-192900; pCGldescrito em JP-A-57-134500; pCG2 descrito em JP-A-58-35197 ;pCG4 e pCGll descritos em JP-A-57-183799; e pPK4 descritoem WO 95/34672. Entre esses, como vetor plasmideo a serusado no sistema vetor-hospedeiro da bactéria corineforme,é preferível um vetor plasmideo tendo um gene que controleuma função de replicação de plasmideo na bactériacorineforme e um gene que controle a função deestabilização de plasmideo na bactéria corineforme. Porexemplo, os plasmídeos pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, p£RY2KX,pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX podem ser usadospreferencialmente.

Transformando-se uma bactéria corineforme como aBrevibacterium flavurn, cepa MJ-233 (FERM BP-1497) com umvetor recombinante obtido inserindo-se o gene da ODH em umsítio adequado de um vetor plasmideo, obtém-se uma bactériacorineforme na qual a expressão do gene de ODH é aumentada.A transformação pode ser realizada por um método conhecido,tal como o método de pulso elétrico (Res Microbiol, Vol.144, p.181-185, 1993).

A atividade da ODH também pode ser aumentadaincorporando-se múltiplas cópias do gene da ODH em umcromossomo por um método conhecido de recombinaçãohomóloga, de modo que o gene da ODH seja expresso em altograu.

Dm exemplo usando a baotéria corineforme foi descritoacima, mas a atividade da ODH também pode ser aumentada demaneira semelhante quando outras bactérias são usadas.

Além do mais, a atividade da ODH também pode seraumentada substituindo-se um promotor em um cromossomo deum hospedeiro. Informações sobre a seqüência de uma regraopromotora podem ser obtidas, por exemplo, por mero doGenBank, No. de Acesso ao Banco de Dados AP005276. 0 tipode promotor a ser substituído não tem limitação, desde queseja capaz de funcionar em uma bactéria hospedeira. Epreferível um promotor cuja atividade de transcrição naoseja suprimida sob condições anaerôbicas. Exemplos incluemum promotor tac e um promotor trc que são usados em E.coli.

Como exemplo de método para substituição do promotor,pode-se citar o método que usa o gene SacB mostrado nosExemplos descritos abaixo (Schafer, A. e outros. Gene 145(1994) 69-73).

Na presente invenção, a modificação para aumentar aatividade da ODH pode ser realizada em uma bactériaprodutora de ácido orgânico que tenha sido modificada demodo que a produção de ácido acético se]a reduzida. Em umabactéria produtora de ácido orgânico modificada para que aprodução de ácido acético seja reduzida, 2-oxoglutarato asvezes se forma como um produto secundário. Como a ODHcatalisa uma reação para descarboxilar oxidativamente o 2-oxoglutarato para gerar succiml-CoA, o aumento daatividade de ODH leva a uma redução da quantidade de 2-oxoglutarato como produto secundário e a um aumento daprodução do áciclo orgânico alvo.

Exemplos de uma modificação para que a produção deácido acético seD a reduzida incluem uma modificação paradiminuir as respectivas atividades da acetato quinasedoravante no presente denominada também ACK),fosfotransacetilase (doravante no presente denominadatambém PTA), acetil-CoA hidrolase (doravante no presentedenominada também ACH) e piruvato oxidase (doravante nopresente denominada também POXB).

Por motivo do ácido acético ser gerado da acetil-CoAcomo um produto intermediário em um caminho biossintéticode oxaloacetato e derivados de oxaloacetato, é preferxvelque qualquer uma das atividades das enzimas mencionadasacima, ou que as atividades de todas as enzimas se3amreduzidas, de modo que a quantidade de ácido acético comoum produto secundário seja reduzida bloqueando-se o caminhobiossintético do ácido acético.

O termo "atividade da PTA" refere-se a uma atividadede catalisação de uma reação que gera acetil-fosfatotransferindo fosfato para acetil-CoA. A expressão"modificado (a) de modo que a atividade da PTA" seDareduzida significa que a atividade da PTA é mais baixa queuma atividade especifica de uma cepa não modxfxcada, talcomo uma cepa do txpo selvagem. A atxvxdade da ? PTA ereduzida, prefenvelraente, para 30% ou menos, ou, maxspreferivelmente, 10% ou menos por célula bacteriana, em.comparação com uma cepa não modxfxcada. A atxvidade da PTApode ser elimxnada completamente. A redução da atxvxdade daPTA pode ser confirmada por medxção da atxvxdade da PTapelo método de Klotzsch e outros (Klotzsch, H>R., MethEnzymol 12, 381-386 (1969)).

O termo "atxvxdade da ACK" refere-se a uma atividadede catalisação de uma reação que gera ácxdo acétxco deacetil-fosfato e ADP. A expressão "modxfxcado(a) de modoque a atxvxdade da ACK se3a reduzida» sxgnxfxca que aatxvxdade da ACK é maxs baixa do que uma atxvxdadeespecifica de uma cepa não modxfxcada, como uma cepa dotipo selvagem. A atividade da ACK é reduzida,preferivelmente, a 30% ou menos e, mais preferivelmente,10% ou menos por célula bacteriana, em comparação com umacepa não modificada. A atividade da ACK pode sercompletamente eliminada. A redução na atividade da ACK podeser confirmada por medição da atividade da ACK pelo métodode Ramponi e outros (Ramponi G., Meth Enzymol 42, 409-426(1975) ) .

Na Corynebacterium glutamicum (inclusive uma bactériaclassificada como Brevibacterium flavum), ambas as enzimassão codificadas pelo operon pta-ack, conforme descrição emMicrobiology Fev. de 1999; 145 (Pt 2) : 503-13, de modo queas atividades de ambas as enzimas, PTA e ACK, podem serreduzidas rompendo-se o gene pta.

0 rompimento do gene pta pode ser conduzido de acordocom um método conhecido, tal como um método que usa umarecombinação homóloga, ou um método que usa o gene sacB(Schafer, A. e outros. Gene 145 (1994) 69-73). Como exemplode gene pta, pode-se citar um DNA contendo a seqüência denucleotideos de números 1 a 1383 mostrada na SEQ ID NO: 7.Além disso, como o gene a ser usado para rompimento do genepta pode ter homologia em um grau que seja suficiente paracausar recombinação homóloga com o gene pta em um DNAcromossômico de uma bactéria corineforme como alvo pararompimento, um gene homólogo à seqüência também pode serusado. Nesse caso, a homologia em um grau que sejasuficiente para causar recombinação homóloga significahomologia de, preferivelmente, no mínimo 70%, maispreferivelmente no mínimo 80% e ainda mais preferivelmente,no mínimo 90% e, particularmente preferível, no mínimo 95%.Além disso, DNAs que podem hibridizar com o gene mencionadoacima sob condições rigorosas podem sofrer recombinaçãohomóloga entre si.

A bactéria usada na presente invenção pode ser umabactéria obtida por uma combinação de dois ou mais tipos demodificação mencionados acima, além da modificação paraaumentar a atividade da ODH. Quando são realizadasmúltiplas modificações, a ordem de cada modificação não éparticularmente limitada.

0 termo "atividade da ACH" refere-se a uma atividadede catalisação de uma reação que gera ácido acético deacetil-CoA e água. A expressão "modificada(o) de tal modoque a atividade da ACH é reduzida" significa que aatividade da ACH é mais baixa do que uma atividadeespecifica de uma cepa não modificada, tal como uma cepa dotipo selvagem. A atividade da ACH é reduzida a 50% oumenos, preferivelmente 30% ou menos e, mais desejavelmente,10% ou menos por célula bacteriana, em comparação com umacepa não modificada. 0 termo "reduzida" também inclui aeliminação completa da atividade. A redução da atividade daACH pode ser confirmada por medição da atividade da ACHpelo método de Gergely, J. e outros (Gergely, J., Hele, P.& Ramkrishnan, C.V. (1952) J Biol Chem 198 p323-334).

Exemplos do gene que codifica a ACH de uma bactériacorineforme incluem a seqüência de Corynebacteriumglutamicum (NCgl240, No. de Acesso NC_003450 no GenBank(uma fita complementar aos números de nucleotideos de2729376 a 2730884 em NC 003450)) depositada no GenBank (WO2005/113744). A seqüência do gene ach da Corynebacteriumglutamicum também é mostrada em 1037 a 2545 da SEQ IDNO:14. Além disso, um gene que tenha homologia com aseqüência em um grau que seja suficiente para causarrecombinação homóloga com o gene ach em um cromossomotambém pode ser usado. Aqui, a homologia em um grau queseja suficiente para causar recombinação homóloga significahomologia de, preferivelmente, no mínimo 70%; maispreferivelmente, no mínimo 80%; mais preferivelmente ainda,no mínimo 90% e, particularmente preferível, no mínimo 95%.Além disso, DNAs que possam hibridizar com o gene acimamencionado sob condições rigorosas podem sofrerrecombinação homóloga entre si.

O termo "atividade da POXB" refere-se a uma atividadede catalisação de uma reação que gera ácido acético deácido pirúvico e água. A expressão "modificada de modo quea atividade da POXB é reduzida" significa que a atividadeda POXB é mais baixa do que uma atividade especifica de umacepa não modificada, como uma cepa do tipo selvagem. Aatividade da POXB diminui, pref erivelmente, para 50% oumenos; mais preferivelmente, 30% ou menos e,particularmente preferível, 10% ou menos por célulabacteriana em. comparação com uma cepa não modificada. 0termo "reduzida" também inclui a completa eliminação daatividade. A redução da atividade da POXB pode serconfirmada por medição da atividade da POXB pelo método deChang e outros (Chang Y. e Cronan J.E.JR, J Bacteriol 151,1279-1289 (1982)) . Exemplos do gene poxB de uma bactériacorineforme incluem a seqüência (uma fita complementar aosnúmeros de nucleotídeos de 2776766 a 2778505, No. de AcessoGenbank NC_003450) depositada no GenBank (WO 2005/113745).A seqüência do gene poxB de Corynebacterium glutamicumtambém é mostrada em 996 a 2735 da SEQ ID NO: 16. Alémdisso, também pode ser usado um gene que tenha homologiacom a seqüência em um grau que seja suficiente para causara recombinação homóloga com o gene poxB em um cromossomo.Aqui, a homologia em' um grau que seja suficiente paracausar recombinação homóloga significa preferivelmente umahomologia de no mínimo 70%; mais preferivelmente, no mínimo80%; mais pref erivelmente ainda, no mínimo 90% e,particularmente preferível, no mínimo 95%. Além disso, DNAsque possam hibridizar com o gene mencionado acima sobcondições rigorosas podem sofrer recombinação homólogaentre si.O rompimento do gene ach e do gene poxB pode serrealizado por um método conhecido, de maneira semelhante aorompimento do gene pta, conforme descrição acima.

A bactéria da presente invenção pode ser uma bactériamodificada de modo que a atividade da lactato desidrogenase(doravante aqui denominada também LDH) seja reduzida, emacréscimo ao aumento da atividade da ODH. A referidabactéria é partxcularmente efetiva quando o ácido orgânicoé o ácido succinico. Essa bactéria pode ser obtida, porexemplo, por mexo da preparação de uma bactéria com o geneda LDH rompido, seguida por modificação da bactéria com ogene da ODH. Deve-se notar que qualquer uma das duasmodificações, seja a que reduz a atividade da LDH, ou a que

Ser realizada em primeiroaumenta a atxvxdade da ODH, poae serlugar.

A expressão "a atividade da LDH é reduzida» significaque a atividade da LDH é mais baixa em comparação com a deuma cepa não modificada quanto ao gene da LDH. A atividadeda LDH é preferive lmente reduzida para 10% ou menos porcélula bacteriana, em comparação com a da cepa nao

Além disso, a atividadecompletamente eliminada. Λ redução da atividade da LDH podeser confirmada por medição da atividade da LDH por umdt h-í l 1 J Biol Chem 2 39,método conhecido (L.Kanarek e R.L. Hxll,4202 (1964)). Como exemplos de métodos específicos para aobtenção de uma cepa de bactéria corineforme cu,a atividadeda LDH é reduzida, pode-se citar o método que usa arecombinação homóloga em um cromossomo, descrito em JP-A-11-206385, o método que usa o gene sacB (Schafer, A. eoutros. Gene 145 (1994) 69-73) e semelhantes.

Além disso, a bactéria usada na presente invenção podeser uma bactéria modificada de modo que a atividade dapiruvato carboxilase (doravante aqui denominada também PC)seja aumentada, em acréscimo ao aumento da atividade daODH. A expressão "a atividade da PC é aumentada" significaque a atividade da PC aumenta preferivelmente 100% ou maise, mais preferivelmente, 300% ou mais, em comparação com adas cepas não modificadas, como uma cepa do tipo selvagemou uma cepa-mãe. A atividade da PC pode ser medida, porexemplo, por um método para medir uma redução de NADH (WO2005/021770). A referida bactéria pode ser obtida, porexemplo, introduzindo-se o gene da PC em uma bactériacorineforme na qual a expressão do gene da ODH foiaumentada. Deve-se notar que tanto a introdução do gene daPC quanto a modificação para aumentar a atividade da ODHpodem ser realizadas em primeiro lugar.

A introdução do gene da PC pode ser realizadaexpressando-se em um alto grau o gene da piruvatocarboxilase (PC) em uma bactéria corineforme, de maneirasemelhante à descrita em JP-A-11-196888. Como gene da PC,pode ser usado, por exemplo, um gene da PC derivado deCorynebacterium glutamicum (Peters-Wendish, P.G. e outros.Microbiologyr vol. 144 (1998) p915-927 (SEQ ID NO:5)). Naseqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 5, uma parte dosnucleotideos pode ser substituída com outros nucleotideos,ou pode ser suprimida; novos nucleotideos podem serinseridos, ou uma parte dos nucleotideos pode serdeslocada, desde que a atividade da PC não sejasubstancialmente prejudicada. Qualquer um desses derivadospode ser usado na presente invenção. Além disso, osseguintes DNAs também podem ser adequadamente usados: umDNA que hibridize com um 'DNA contendo a seqüência denucleotideos de SEQ ID NO:5 sob condições rigorosas; um DNAque tenha homologia de, no mínimo, 90%, preferivelmente nomínimo 95% e, mais preferivelmente, no mínimo 99% emrelação à seqüência de nucleotideos de SEQ ID NO: 5 e quecodifique uma proteína que tenha atividade de PC.

Além do mais, um gene da PC derivado de bactérias quenão sejam Corynebacterium glutamicum, ou de outrasbactérias, animais, ou plantas, também pode ser usado. Emparticular, as seqüências dos genes da PC derivados dasseguintes bactérias, animais e plantas já são conhecidas(os documentos de referência são indicados abaixo), ou osgenes podem ser obtidos por hibridização de maneirasemelhante à descrita acima, ou amplificando-se a ORF porum método de PCR.

Humano [Biochem. Biophys. Res. Comm., 202, 1009-1014,(1994)]

Camundongo [Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 90, 1766-1779, (1993)]

Rato [Gene, 165, 331-332, (1995)]

Levedura Saccharomyees eerevisiae [Mol. Gen. Genet.,229, 307-315, (1991)]

Schizosaccharomyces pombe [DDBJ No. de AcessoNo.; D78170]

Baeillus stearothermophilus [Gene, 191, 47-50, (1997)]

Rhizobium et li [J. Baeteriol., 178, 5960-5970, (1996)]

O aumento da atividade da PC pode ser realizado demodo semelhante ao do aumento da atividade da ODH, conformedescrito acima.

Método para a Produção de Ácido Orgânico

O método para a produção de um ácido orgânico dapresente invenção consiste em permitir que as bactériasmencionadas acima, ou células tratadas das mesmas, ajamsobre uma matéria prima orgânica em uma solução de reaçãocontendo um ion carbonato, um ion bicarbonato, ou gásdióxido de carbono para produzir um ácido orgânico, e emcoletar o ácido orgânico. Os ácidos orgânicos a seremproduzidos incluem os ácidos orgânicos mencionados acima.

Entre esses, o ácido succínico, ácido fumárico, ácidomálico ou ácido pirúvico são preferenciais, e o ácidosuccínico é o mais preferencial.Quando as bactérias mencionadas acima são usadas naprodução de um ácido orgânico, as bactérias submetidas àcultura em um meio sólido inclinado, tal como o agar, podemser usadas diretamente para a reação, mas as célulasbacterianas preparadas cultivando-se antecipadamente asbactérias mencionadas acima em um meio liquido (isto é,cultura semeada) podem ser usadas preferencialmente. 0 meioa ser usado para a cultura semeada pode ser qualquer um dosque são usados normalmente para o cultivo de bactérias.Pode-se usar, por exemplo, um meio comum, que é preparadoadicionando-se· fontes naturais de nutrientes como extratode carne, extrato de levedura e peptona a uma composiçãoformada por sais inorgânicos como sulfato de amônio,fosfato de potássio e sulfato de magnésio. Após a culturasemeada, as células bacterianas são usadas preferivelmentepara a reação de produção de um ácido orgânico depois deterem sido colhidas por centrifugação, separação pormembrana, ou procedimentos semelhantes. 0 ácido orgânicopode ser produzido permitindo-se que a bactéria obtida pelacultura semeada reaja com uma matéria prima orgânica aomesmo tempo em que prolifera em um meio contendo a ,matériaprima orgânica.

Alternativamente, o ácido orgânico pode serproduzido permitindo-se que as células bacterianas obtidaspor proliferação antecipada reajam com a matéria primaorgânica em uma solução de reação contendo a matéria primaorgânica.

Na presente invenção, também podem ser usadas célulasbacterianas tratadas.. Exemplos de células bacterianastratadas incluem células bacterianas imobilizadas comacrilamida, carragenano, ou semelhante; restos de célulasbacterianas esmagadas, um sobrenadante de centrifugação dasmesmas, ou frações obtidas purificando-se parcialmente osobrenadante com um tratamento de sulfato de amônio ousemelhante.A matéria prima orgânica" a ser usada no método deprodução da presente invenção não é particularmentelimitada, desde que seja uma fonte de carbono que possa serassimilada pelas bactérias descritas no presente para gerarum ácido orgânico como o ácido succinico. Em geral, usa-seum carboidrato fermentável, inclusive: um carboidrato comogalactose, lactose, glicose, frutose, glicerol, sucrose,sacarose, amido, ou celulose; ou poliálcoois, comoglicerina, manitol, xilitol ou ribitol. Entre esses, sãopreferíveis a glicose ou a sucrose, e a glicose éespecialmente preferível.

Além disso, também pode ser usado um líquido parasacarificação de amido, melado ou semelhantes, que contenhaqualquer um dos carboidratos fermentáveis mencionadosacima. Qualquer um desses carboidratos. fermentáveis podeser usado isoladamente ou em combinação com outro(s). Aconcentração em que a matéria prima orgânica mencionadaacima é usada não é especialmente limitada, mas é vantajosoque se aumente a concentração tanto quanto for possível,dentro de uma faixa que não iniba a geração de um ácidoorgânico como o ácido succinico. A reação geralmente érealizada na faixa de 5 para 30% (Peso/Volume) epreferivelmente na faixa de 10 para 20% (P/V). A matériaprima orgânica mencionada acima pode ser adicionada àmedida que diminuir durante o decorrer da reação.

A solução de reação contendo as matérias primasorgânicas não é especificamente limitada. A solução dereação a ser usada pode ser um meio para cultivo debactérias ou um tampão, tal como um tampão fosfato. Asolução de reação é preferivelmente uma solução aquosacontendo uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos esemelhantes. Aqui, a fonte de nitrogênio não éespecificamente limitada, desde que possa ser assimiladapelas bactérias descritas no presente para gerar um ácidoorgânico como o ácido succínico. Exemplos específicos defontes de nitrogênio incluem vários compostos de nitrogênioorgânico e inorgânico, tais como sais de amônio, nitrato,uréia, um hidrolisado de soja, um catabólito de caseina,peptona, extrato de levedura, extrato de carne, é milhocina(CSL). Exemplos de sais inorgânicos incluem vários tipos defosfatos, sulfatos e sais metálicos de magnésio, potássio,manganês, ferro, zinco e semelhantes. Além disso, quaisquerfatores que promovam o crescimento, inclusive vitaminascomo a biotina, o ácido pantotênico, inositol e ácidonicotínico; nucleotídeos, e aminoácidos, podem seracrescentados se necessário. Também é desejável que umaquantidade adequada de um agente anti-espumante disponívelno mercado seja adicionado à solução de cultura paraimpedir a formação de espuma na hora da reação.

A solução de reação contém íons carbonato, íonsbicarbonato e gás de dióxido de carbono, além das matériasprimas orgânicas, da fonte de nitrogênio, dos saisinorgânicos e semelhantes mencionados acima. Os íonscarbonato ou os íons bicarbonato podem ser fornecidos porcarbonato de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato desódio, carbonato de potássio, ou bicarbonato de potássio,que também pode ser usado como agente neutralizante.Entretanto, se necessário, os íons carbonato ou íonsbicarbonato também podem ser fornecidos por carbonato oubicarbonato, ou sais desses, ou gás de dióxido de carbono.Exemplos específicos dos sais de carbonato ou bicarbonatoincluem carbonato de magnésio, carbonato de amônio,carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato deamônio, bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio. Osíons carbonato ou íons bicarbonato são adicionados com umaconcentração de 1 para 500 mM, pref eri velmente 2 para 300mM, e mais preferivelmente, 3 para 200 mM. Quando a soluçãocontiver gás de dióxido de carbono, a quantidade de gás dedióxido de carbono a ser contida é de 50 mg a 25 g;preferivelmente, de 100 mg a 15 g e, mais preferivelmente,de 150 mg a 10 g por litro de solução.

O pH da solução de reação pode ser ajustado por meiodo acréscimo de carbonato de sódio, bicarbonato de sódio,carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonatode magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio,hidróxido de magnésio, ou semelhante. O pH para a reação é geralmente de 5 a 10, preferivelmente de 6 a 9,5; assimsendo, o pH da solução de reação é ajustado, se necessário,dentro da faixa mencionada acima, com um material alcalino,carbonato, uréia, ou semelhante, mesmo durante a reação.

A temperatura ótima para o crescimento das bactérias aserem usadas na reação fica geralmente na faixa de 25°C a35°C. A temperatura no momento da reação fica geralmente nafaixa de 25°C a 40°C, e preferivelmente, na faixa de 30°C a37°C. A quantidade de células bacterianas a serem usadas nareação não é especificamente limitada, mas a quantidade éajustada na faixa de 1 a 700 g/L, preferivelmente de 10 a500 g/L e, mais preferivelmente, de 20 a 400 g/L. O períodode tempo da reação é preferivelmente de 1 a 168 horas e,mais preferivelmente, de 3 a 72 horas.

Quando se realiza a cultura semeada de bactérias, épreciso fornecer oxigênio por aeração e agitação. Por outrolado, uma reação para produzir um ácido orgânico como oácido succínico pode ser realizada com aeração e agitação,ou pode ser realizada sob condição anaeróbica, sem aeraçãoe sem fornecimento de oxigênio. Aqui, o termo "condiçãoanaeróbica" significa que uma reação é conduzida ao mesmotempo em que o nível de oxigênio dissolvido é mantido baixona solução. Nesse caso, é desejável que se conduza a reaçãocom níveis de oxigênio dissolvido de 0 a 2 ppm,preferivelmente de 0 a 1 ppm e, mais preferivelmente, de 0a 0,5 ppm. Para tal fim, podem ser usados métodos queincluem conduzir a reação com um vaso hermeticamente seladosem aeração; conduzir a reação ao mesmo tempo em que sefornece um gás inerte, tal como gás nitrogênio, e realizaraeração com um gás inerte contendo gás de dióxido decarbono.

A reação bacteriana mencionada acima leva à geração eacumulação, em uma solução de reação, de ácidos orgânicoscomo o ácido succinico, ácido fumárico, ácido málico, ouácido pirúvico. Os ácidos orgânicos acumulados na soluçãode reação (solução de cultura) podem ser coletados dasolução de reação de acordo com procedimentosconvencionais. Especificamente, os ácidos orgânicos podemser coletados removendo-se a substância sólida, comocélulas bacterianas, por meio de centrifugação, filtração,ou semelhante e dessalgando-se o restante com uma resinatrocadora de ions ou semelhante, seguido por cristalizaçãoou purificação da solução por cromatografia de coluna.

Além disso, na presente invenção, após a produção dosácidos orgânicos pelo método da presente invenção descritoacima, pode-se conduzir uma reação de polimerização usandoos ácidos orgânicos obtidos como uma matéria prima paraproduzir polímeros contendo ácidos orgânicos.

Nos últimos anos, ao mesmo tempo em que o número deprodutos industriais favoráveis ao ambiente estáaumentando, polímeros preparados usando-se matérias primasde origem vegetal têm atraído atenção. 0 ácido succinico aser produzido na presente invenção pode ser processado comopolímero, tal como poliéster e poliamida, e usado como tal.Exemplos específicos de polímeros contendo ácido succinicoincluem os poliésteres de ácido succinico obtidos por meioda polimerização entre um diol, tal como butanodiol ouetileno glicol e ácido succinico, e poliamidas de ácidosuccinico obtidas por meio da polimerização entre umadiamina, tal como hexametilenodiamina e ácido succinico.Além disso, o ácido succinico obtido pelo método deprodução da presente invenção, ou uma composição contendo oácido succinico, podem ser usados em aditivos alimentares,produtos farmacêuticos, cosméticos e semelhantes.

Exemplo 1

Preparação de Cepa Amplificada com Plasmideo de ODH

(A) Extração de DNA Genômico da Cepa MJ233

Em 10 mL de meio A [2 g de uréia,.. 7 g de (NH4)2SO4, 0,5g de KH2PO4, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 ·7Η20, 6 mg deFeSO4 · 7H20, 6 mg de MnSO4 4-5H20, 200 μg de biotina, 100 ugde tiamina, 1 g de extrato de levedura, 1 g de ácidocasamino, e 20 g de glicose dissolvidos em 1 L de águadestilada], a cepa MJ-233 de Brevibacterium flavum foicultivada até a última etapa da fase logaritmica e ascélulas bacterianas foram coletadas por centrifugação(10.000 χ g, 5 minutos). As células bacterianas obtidasforam suspensas, a uma concentração de 10 mg/mL, em 0,15 mLde uma solução contendo uma lisozima, . 10 mM NaCl, 20 mMtampão Tris (pH 8,0) e 1 mM EDTA-2Na. Em seguida,adicionou-se proteinase K à suspensão, de modo a obter-seuma concentração final de 100 pg/mL, e o resultado foimantido a 379C por uma hora. Acrescentou-se ainda dodecilsulfato de sódio, de modo a obter-se uma concentração finalde 0,5% e o resultado foi mantido a 50°C por 6 horas parabacteriólise. Ao lisato, foi adicionada uma solução de umaquantidade equivalente de fenol e clorofórmio, e a misturafoi lentamente agitada à temperatura ambiente, por 10minutos. Subseqüentemente, a mistura toda foi centrifugada(5.000 χ g por 20 minutos a uma temperatura de 10 a 12°C) ea fração sobrenadante foi coletada. Acrescentou-se acetatode sódio de modo a alcançar 0,3 M e 2 equivalentes deetanol foram acrescentados e misturados. A mistura foisubmetida a centrifugação (15.000 χ g por 2 minutos) paracoletar-se o precipitado. 0 precipitado coletado foi lavadocom etanol 70% e, então, foi secado por sopro de ar. Ao DNAobtido, foram adicionados 5 mL de uma solução de 10 mMtampão Tris (pH 7,5) contendo 1 mM de EDTA-2Na, e deixou-sedescansar durante a noite, a 4 °C. 0 DNA obtido foi usadocomo DNA "template" para a PCR conduzida mais tarde.

(B) Clonagem do Gene da ODH e Construção de um Plasmideopara Aumento

0 gene (odhA), incluindo uma região promotora de 2-oxoglutarato desidrogenase componente do complexo El,derivado da cepa MJ-233 de Brevibacterium flavum foi obtidorealizando-se PCR, usando o DNA preparado em (A) acima como" templa te", e DNAs sintetizados (SEQ ID N0:1 e SEQ IDN0:2), que foram configurados com base na seqüência do gene(uma fita complementar a 1172498-1176271 do No. de AcessoBAO00036 da Base de Dados do GenBank) da cepa ATCC13032 deCorynebacterium glutamicum, cuja seqüência genômica inteirafoi relatada. Uma solução de reação foi composta com 1 yLdo DNA "template", 0,5 yL de PfxDNA polimerase (fabricadapor Invitrogen Corporation), o tampão anexo na concentração1, 0,4 pL de cada um dos "primers", 1 mM MgSO4, e 0,2 μMdNTPs, e o volume total foi ajustado em 50 μί. Atemperatura de reação e as condições da reação foram asseguintes: foi usado o ciclador térmico para DNA PTC-200(fabricado por MJ Research Inc.), e um ciclo de 94°C por 10segundos e 68°C por 5 minutos foi repetido 35 vezes, sendoa solução de reação mantida em 94 0C por 2 minutos noprimeiro ciclo e mantida em 68°C por 10 minutos no ciclofinal. Após a conclusão da reação de PCR, 0,1 μΐ, de TakaraEx Taq (TAKARA BIO INC.) foi acrescentado, e a mistura foiainda mantida a 72°C.por 30 minutos. 0 produto amplificadofoi confirmado como segue: o produto amplificado foiseparado sendo submetido a eletroforese em gel de agarose0,75% (SeaKem GTG agarose, fabricada por FMC BioproductsInc.); então, foi visualizado sendo submetido a coloraçãocom brometo de etidio e, desse modo, foi detectado umcoletado do ,el usando-se o QIAQuick Gel Extractlon Kxtfabricado por QIAGEN GmbH,. 0 fragmento de DNA coletadofoi misturado com um vetor de clonagem do produto da PCR,pTVBlue T-Vector (fabricado por Novagen Inc.) e ambos foramiigados entre si usando-se o Ligation Kit ver. 2 (TAKARABIO INC ). o DNA de plasmideo obtido £oi usado paratransformar E. coU (cepa DHSalfa,. A E.coli recombinanteassim obtida foi espalhada em um meio agar LB contendo 50pg/mL ampicilina e 50 ug/mL X-Gal. 0 clone que formou umacolônia branca no meio foi cultivado em um meio liquido porum método convencional, seguido por purificação do DNA deplasmideo. 0 DNA de plasmideo obtido foi clivado com asenzimas de restrição SseI e BamHI e, desse modo, detectou-se um fragmento inserido de cerca de 4.4 Kb. 0 DNA deplasmideo obtido foi denominado pODHl.O.

Um vetor para bactéria corineforme que é capaz decoexistir com PTZ4 foi construído substituindo-se o generesistente à canamicina do vetor plasmideo pC3 (Plas.xd 3662(1996)) que tem uma região de replicação compatível compTZ4 com o gene resxstente à estreptomicina/espectinomicina. Deve-se notar que PTZ4 é o plasmideooriginal de um plasmideo para amplxficaçâo daintroduzido na cepa MJ233/PCMLDH descrita abaxxo.

0 gene resistente à estreptomicina/espectinomicma (£.coli Tm, foi obtido por PCR na qual o vetor bxnârxotransformação de vegetal, que carrega o gene, fox usadocomo "template".uma solução de reação £oi composta com 10 ng do DNA"terapia te", 0,2 µL de PfKDNA polimerase (fabricada porInvltrogen Corporation), o tampão anexo com ooncentraçao 1,0 3 µL de cada um dos "primers' (DNAs sintetizadosmostrados na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11), 1 mM MgSO4 eo 25 μ MdMTPs, e o volume total foi ajustado em 20µL.

A temperatura da reação e as condições de reação foramcomo segue: foi utilizado o ciclador térmico de DNA PTC-200(fabricado por MJ Research Inc.), e um ciclo de 94'°C por 20segundos, 60°C por 20 segundos e 72°C por 60 segundos foirepetido 20 vezes, sendo que a solução de reação Io1mantida em 94''C por 1 minuto e 20 segundos no primeirociclo e foi mantida em 72°C por 2 minutos no ciclo final.

O produto amplificado foi confirmado como segue: oproduto amplificado foi separado sendo submetido aeletroforese em gel de agarose 0,81 (agarose Seakem GTG:fabricada por FMC Bioproducts Inc.); o produto foivisualizado sendo submetido a coloração com brometo deetidio, e um fragmento de 937 bp foi detectado. 0 fragmentode DNA-alvo foi coletado do gel usando-se o QIAQuick GelExtraction Kit (fabricado por QIAGEN GmbH). 0 fragmento deDNA coletado foi submetido a fosforilação no terminal 5'com T4 Polynucleotide Kinase (TARARA BIO INC.).

Apôs o pC3 ser clivado com as enzimas de restriçãoHindIII e NruI, ambas as extremidades foram cegadas comKlenow Fragment (TAKARA BIO INC.). 0 fragmento de DNA foimisturado com os genes resistentes a estreptomieina/espectinomicina preparados conforme descrição acima, e ofragmento e o gene foram ligados um ao outro usando-se oLigation Kit ver. 2 (TAKARA BIO INC.). 0 DNA de plasmideoobtido foi usado para transformar B. coU (cepa DHSalfa) e50 µL/mL de espectinomicina foram espalhados sobre um mexoagar LB. A colônia obtida foi cultivada em um meio liquidoe o DNA de plasmideo foi preparado por um métodoconvencional. Como resultado da análise de PCR mencionadaacima na qual os DNAs sintetizados de SEQ ID NO:10 e SEQ IDNO: 11 foram usados como "primers", a inserção do generesistente à estreptomicina/espectinomicina foi confirmada.O DNA de plasmideo obtido foi denominado pC3.

Em seguida, um fragmento de DNA foi preparadoclivando-se o PC3 com as enzimas de restrição BamHI ePvuII, e ambas as extremidades do fragmento do DNA foramcegadas com Klenow Fragment. 0 fragmento de DNA foimisturado com pBglII Linker (TAKARA BIO INC.: CAGATCTG)para realizar a ligação usando-se o Ligation Kit ver. 2(TAKARA BIO INC.). 0 DNA de plasmideo obtido foi usado paratransformar S. coli (cepa DHSalfa) e a E. coli transformadafoi espalhada sobre um meio agar LB contendo 50 μς/ιαΐ deespectinomicina. A colônia obtida foi cultivada em um meiolíquido e o DNA de plasmideo foi preparado por um métodoconvencional. Um DNA de plasmideo que podia ser clivado coma enzima de restrição foi selecionado e denominado pC3.1.

(ii) Introdução de um sítio de multiclonagem

O gene de alfa-peptídeo incluindo o sítio demulticlonagem LacZ foi preparado por PCR usando-seplasmideo de E. coli, pT7Blue (Novagen Inc.) como"template", e os DNAs sintetizados mostrados nas SEQ IDNO·12 e SEQ ID NO:13 como "primers".

Uma solução de reação foi composta com 10 ng do DNA"template" 0,2 UL de PDNA polimerase (fabricada porInvitrogen Corporation), o tampão anexo em concentração 1,0,3 μΜ de cada um dos «primers», 1 mM de MgS04, e 0,25 μMdNTPs, e o volume total foi ajustado em 20 μΐ,.

A temperatura de reação e as condxções da reação foramcomo segue: for usado o cxclador térmxco de DNA PTC-200(fabricado por MJ Research Inc.), e um cxclo de 94°C por 20segundos, 60°C por 20 segundos e 72"C Por 30 segundos foirepetido 20 vezes, sendo a solução de reação mantxda em94 °C por 1 minuto e 20 segundos no primeiro ciclo e em 72°C,por 2 minutos no ciclo final.

0 produto amplificado foi confirmado como segue: oproduto amplificado foi separado, sendo submetido aeletroforese em gel de agarose 1% (agarose SeaKem GTG:fabricada por FMC Bioproducts Inc.); o produto foivisualizado sendo submetido a coloração com brometo deetidio, e um fragmento de 5,777 bp foi detectado. 0fragmento de DNA alvo foi coletado do gel usando-se oQIAQuick Gel Extraction Kit (fabricado por QIAGEN GmbH). 0fragmento de DNA coletado passou por fosforilação noterminal 5' com T4 Polynucleotide Kinas (TAKARA BIO INC.).

Após o pC3.1 ter sido clivado com as enzimas derestrição PstI e HpaI, ambas as extremidades do fragmentode DNA foram cegadas com Klenow Fragment.(TAKARA BIO INC.).0 fragmento de DNA foi misturado com o fragmento de gene dealfa-peptideo preparado conforme a descrição acima, seguidopor ligação usando-se o Ligation Kit ver. 2 (TAKARA BIOINC.). 0 DNA de plasmideo obtido foi usado para transformarE. coli (cepa DH5alfa) e a E. coli transformada foiespalhada sobre um meio agar LB contendo 50 pg/mL de X-Gale 50 pg/mL de espectinomicina. Entre as colônias dbtidas,foram selecionadas as colônias azuis. As colônias foramcultivadas em um meio liquido e os DNAs de plasmideo foramentão preparados por um método convencional. Foi confirmadoque cada um dos DNAs de plasmideo tinha um sitio declivagem clivado por EcoRV, sendo o sitio derivado do sitiode multiclonagem LacZ inserido. 0 DNA de plasmideo obtidofoi denominado pC3.14 (a Figura 1 mostra o procedimentopara a construção).

Em seguida, um fragmento de DNA de cerca de 4,4 kbobtido clivando-se o pODHl.0 com as enzimas de restriçãoSsel e BamHI foi separado por eletroforese em gel deagarose 0,75% e coletado. 0 fragmento obtido foi misturadocom um fragmento de DNA preparado clivando-se o plasmideopC3.14 com as enzimas de restrição PstI e BamHI, seguidopor ligação usando-se o Ligation Kit ver. 2 (TAKARA BIOINC.). 0 DNA de plasmideo obtido foi usado para transformarE. coli, cepa DH5alfa. A E. coli transformada foi espalhadasobre um meio agar LB contendo 50 pg/mL de espectinomicinae 50 pg/mL de X-Gal. Uma colônia branca que cresceu no meiofoi cultivada em um meio liquido por um métodoconvencional, seguido por purificação de um DNA deplasmideo. 0 plasmideo de DNA obtido foi clivado com asenzimas de restrição Ssel e BamHI, selecionado-se, dessemodo, um plasmideo contendo um fragmento de cerca de 4,4kb, que foi denominado pODH3.2 (Figura 2).

(D Preparação de Cepa Amplificada com Plasmideo de QDH

Um DNA de plasmideo (pODH3.2) para aumento da ODH foiintroduzido na Brevibacterium flavum, cepa MJ233/PC/ALDH(uma cepa na qual o gene de PC foi amplificado e o gene deLDH foi rompido: JP-A-2005-95169: WO 2005/21770) pelométodo de pulso elétrico (Res Microbiol, Vol. 144, p. 181-185, 1993) . 0 transformante obtido foi espalhado sobre ummeio agar LBG [10 g de triptona, 5 g de extrato delevedura, 5 g de NaCl, 20 g de glicose e 15 g de agar,dissolvidos em 1 L de água destilada] contendo 10 μg/mL deestreptomicina e 25 μg/mL de canamicina. Cada uma das cepasque cresceu no meio foi cultivada em um meio liquido por ummétodo convencional. Então, os DNAs de plasmideo foramextraídos e analisados por clivagem com enzimas derestrição. Como resultado, foi confirmado que a cepacarregava pODH3.2 e ela foi denominada Brevibacteriumflavum cepa MJ233/pODH/PC/ALDH.

(E) Medição ,da Atividade Enzimática da ODHA cepa Brevibacterium flavum MJ233/pODH/PC/ALDHmencionada acima foi cultivada durante a noite em 100 ml demeio A contendo 2% de glicose. 50 ml da cultura obtidaforam submetidos a centrifugação a 4000 rpm a 4 0C por 10minutos, para coleta de células. Depois disso, a cepa foilavada duas vezes com 30 mL de tampão 100 mM TES-NaOH (pH7,5). As células bacterianas lavadas foram suspensas em 10mL de tampão A (tampão 100 mM TES-NaOH (pH 7,5), 30%glicerol) e 1 mL da suspensão de células bacterianas foitransferido para um tubo Falcon de 15 ml para lise, e foiadicionado 1 mg de glóbulos de vidro. A suspensão decélulas bacterianas foi submetida a lise ultra-sônica (umciclo de 1 minuto de sonicação em nivel Alto seguido por 2minutos de quebra foi repetido 7 vezes) com Bioruptor(fabricado por Cosmo Bio Co., Ltd.) na condição deresfriamento a 4°C. A solução de lise das célulasbacterianas foi submetida a centrifugação a 40C a 18.000 χg por 5 minutos para remoção dos glóbulos e foi aindasubmetida a centrifugação a 18.000 χ g por 25 minutos. 0sobrenadante obtido foi usado como uma fração de enzimabruta para medir a atividade enzimática da ODH. Aconcentração de proteína foi medida com Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc., #500-0006), usando-se umaconcentração BSA como padrão.

A atividade da ODH foi medida como segue, comreferência ao método descrito em Agric Biol Chemr 44(8),1897-1904, 1980, I Shiio e K Ujigawa-Takeda. Primeiramente,uma solução de reação foi preparada de modo a conter oseguinte, na concentração final: 100 mM tampão de NaOH TES(DOJINDO LABORATORIES, #344-02653) (pH 7,7); 0,2 mMcoenzima A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., #306-50481); 0,3 mM pirofosfato de tiamina (Sigma-AldrichCorporation, #8754); 5 mM 2-oxoglutarato (Sigma-AldrichCorporation, #305-72-6); 3 mM L-cisteína (Wako PureChemical Industries, Ltd., #033-05272) 5mM MgCl2, 1 mM 3-acetilpiridina adenina dinucleotídeo (Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd., #44047000). Depois que a solução dereação foi transferida para uma "cuvette" para medição, asolução de enzima bruta foi adicionada para dar inicio auma reação. A elevação da absorvência (A365) foi medida em365 nra. 1U foi definido como quantidade de enzimas quandoA365 aumentou em 1 por minuto. A atividade especifica de ODHda cepa Brevibacterium flavum MJ233/pODH/PC/ALDH foi medidapelo método mencionado acima como 0,028 U/mg de proteína.Por outro lado, as células bacterianas obtidas cultivando-se a cepa Brevibacterium flavum MJ233/PC/ALDH como cepa-mãede maneira semelhante, mostraram uma atividade específicade ODH de 0,009 U/mg de proteína. Como resultado, foiconfirmado que a atividade da ODH aumentou cerca de 3 vezesna cepa amplificada pelo plasmídeo da ODH.

Exemplo 2

Avaliação da Cepa Amplificada com o Plasmídeo da ODH

(A) Condição Isenta de Amônia

Em um frasco cônico de 500 mL foram adicionados 100 mLde um meio obtido dissolvendo-se 4 g de uréia, 14 g desulfato de amônio, 0,5 g de fosfato monopotássico, 0,5 g defosfato de potássio dibásico, 0,5 g de sulfato de magnésioheptaidrato, 20 mg de sulfato ferroso heptaidrato, 20 mg desulfato de manganês hidrato, 200 pg de D-biotina, 200 pg dehidrocloreto de tiamina, 5 g de extrato de levedura, e 5 gde ácido casamino em 1000 mL de água destilada, meio esseque foi aquecido a 120°C por 20 minutos para esterilizaçãoe depois foi resfriado até a temperatura ambiente. Foramentão adicionados 4 mL de uma solução aquosa de glicose a50% previamente esterilizada, 50 pL de solução aquosa decanamicina a 5% filtrada assepticamente e 50 pL de soluçãoaquosa de estreptomicina a 2% assepticamente filtrada.Então, a cepa Brevibacterium flavum MJ233/pODH/PC/ALDHpreparada em (D) do Exemplo 1 foi inoculada no meio acimapara cultura semeada a 300C, por 24 horas.

Em um fermentador de 5 L, foi adicionado um meioobtido dissolvendo-se 42. g de sulfato de amônio, 1,5 g defosfato monopotássico, 1,5 g de fosfato de potássiodibásico, 1,5 g de sulfato de magnésio. heptaidrato, 60 mgde sulfato ferroso heptaidrato, 60 mg de sulfato demanganês hidrato, 600 pg de D-biotina, 600 yg dehidrocloreto de tiamina, 15 g de extrato de levedura, 15 gde ácido casamino e 1 mL de um anti-espumante (AdekanolLG294, fabricado por Asahi Denka Co., Ltd.) em 2.500 mL deágua destilada. Esse meio foi então aquecido a 120°C por 20minutos para esterilização e, então, foi resfriado atétemperatura ambiente. Foram adicionados 500 mL de soluçãoaquosa de glicose a 12%, previamente esterilizada, 1,5 mLde solução aquosa de canamicina a 5% filtradaassepticamente e 1,5 mL de solução aquosa de estreptomicinaa 2% assepticamente filtrada. 100 mL da cultura semeadamencionada acima foram acrescentados ao meio e mantidos a30 °C, seguido por cultura principal por 16 horas com pH7,5, mantido usando-se 2 M carbonato de amônio, com aeraçãode 500 mL por minuto, e agitação a 500 rpm.

Em um frasco cônico de 500 mL, foi acrescentado ummeio obtido dissolvendo-se 0,2 g de sulfato de magnésioheptaidrato, 8 mg de sulfato ferroso heptaidrato, 8 mg desulfato de manganês hidrato, 80 pg de D-biotina, 80 pg dehidrocloreto de tiamina, e 1 mL de um anti-espumante(Adekanol LG294, fabricado por Asahi Denka Co., Ltd.) em200 mL de água destilada. 0 meio foi então aquecido a 120°Cpor 20 minutos para esterilização e, então, resfriado atétemperatura ambiente. 0 meio foi adicionado às célulasobtidas centrifugando-se a cultura principal mencionadaacima a 8.000 rpm por 5 minutos, e as células foramnovamente suspensas de modo que O.D. (660 nm) tornou-se 60.200 mL da suspensão e 200 mL de solução cie glicose a 20%esterilizada previamente foram carregados em uma jarrafermentadora de IL e misturados, sendo a mistura resultantemantida em 35°C. A mistura foi submetida a uma reação compH 7,6 mantido com 2 M carbonato de amônio, na condiçãoisenta de aeração e agitação a 400 rpm. A reação foiconcluída cerca de 47 horas após o seu início.

Como resultado, na cepa Brevibacterium flavumMJ233/pODH/PC/ALDH, o rendimento de ácido succínicoaumentou em 3,4% e a quantidade de produção de aminoácidospor ácido succínico diminuiu em 47%, em comparação com acepa MJ233/PC/ALDH. Isto é, descobriu-se que o aumento daODH teve efeitos significativos de melhora no rendimento deácido succínico e de redução na produção de aminoácidos.

(B) Condição Isenta de Sódio

Em um frasco cônico de 500 mL, foram carregados 100 mLde um meio obtido dissolvendo-se 4 g de uréia, 14 g desulfato de amônia, 0,5 g de fosfato monopotássico, 0,5 g defosfato de potássio dibásico, 0,5 g de sulfato de magnésioheptaidrato, 20 mg de sulfato ferroso heptaidrato, 20 mg desulfato de manganês hidrato, 200 μg de D-biotina, 200 yg dehidrocloreto de tiamina, 5 g de extrato de levedura e 5 gde ácido casamino em 1000 mL de água destilada. O meio foientão aquecido a 120°C por 20 minutos para esterilização e,então, foi resfriado até temperatura ambiente. 4 mL desolução aquosa de glicose a 50% previamente esterilizada,50 μL de solução aquosa de canamicina filtradaassepticamente e 50 pL de solução aquosa de estreptomicinaa 2% filtrada assepticamente foram adicionados ao meio.

Então, a cepa Brevibacterium flavum MJ233/pODH/PC/ALDHpreparada em (D) do Exemplo 1 foi inoculada no meio paracultura semeada a 30°C por 24 horas.

Em um fermentador de 5 L, foi carregado um meio obtidodissolvendo-se 42 g de sulfato de amônio, 1,5 g de sulfatomonopotássico, 1,5 g de fosfato de potássio dibásico, 1,5 gde sulfato de magnésio heptaidrato, 60 mg de sulfatoferroso heptaidrato, 60 mg de sulfato de manganês hidrato,600 uy de D-biotina, 600. yg de hidrocloreto de tiamina, 15g de extrato de levedura, 15 g de ácido casamino, e 1 mL deum anti-espumante (Adekanol LG294, fabricado por AsahiDenka Co., Ltd.) em 2500 mL de água destilada. 0 meio foientão aquecido a 120° por 20 minutos para esterilização eentão foi resfriado até temperatura ambiente.Acrescentaram-se então 500 mL de solução aquosa de glicosea 12% previamente esterilizada, 1,5 mL de solução aquosa decanamicina a 5% assepticamente filtrada e 1,5 mL de soluçãoaquosa de estreptomicina a 2%, assepticamente filtrada.Então, 100 mL do meio de cultura semeada mencionado acimaforam acrescentados, e o resultado foi mantido em 30°C,seguido por cultura principal por 16 horas com pH 7,5,mantido usando-se 2 M de carbonato de amônio, com aeraçãode 500 mL por minuto e agitação a 500 rpm.

Em um frasco cônico de 500 mL, carregou-se um meioobtido dissolvendo-se, em 200 mL de água destilada, 0,2 gde sulfato de magnésio heptaidrato, 8 mg de sulfato ferrosoheptaidrato, 8 mg de sulfato de manganês hidrato, 80 yg deD-biotina, 80 yg de hidrocloreto de tiamina, e 1 mL de umanti-espumante (Adekanol LG294, fabricado por Asahi DenkaCo., Ltd.). 0 meio foi então aquecido a 120°C por 20minutos para esterilização e, depois, resfriado àtemperatura ambiente. 0 meio foi acrescentado às célulasbacterianas coletadas por centrifugação da cultura obtidapela cultura principal mencionada acima a 8.000 rpm por 5minutos, e as células foram suspensas novamente, de modoque O.D. (660 nm) tornou-se 60. 200 mL da suspensão e 200mL de solução de glicose a 20% previamente esterilizadaforam carregados em uma jarra fermentadora de 1 L, forammisturados e a mistura resultante foi mantida a 35°C. Areação foi realizada com pH 7,6, mantido usando-se 2 Mcarbonato de amônia, em condição sem aeração, e agitação a400 rpm. A reação foi concluída cerca de 47 horas após oseu inicio.

Como resultado, na cepa Brevibacterium flavumMJ233/pODH/PC/ALDH o rendimento de ácido succinico aumentouem 3,8% e a quantidade da produção de ácido acético porácido succinico diminuiu em 27%, em comparação com a cepaMJ233/PC/ALDH. Isto é, descobriu-se que o aumento da ODHteve efeitos significativos de melhora do rendimento doácido succinico e de redução da produção de ácido acético.

Exemplo 3

O Efeito do Aumento da ODH em uma Cepa na qual a Produçãode Ácido Acético foi Reduzida

(A) Preparação de uma Cepa ODH-Amplificada

Avaliou-se o efeito da 2-oxoglutarato desidrogenaseaumentada sobre uma cepa na qual a produção de ácidoacético foi reduzida. Como cepa na qual a produção de ácidoacético foi reduzida, usou-se uma cepa 2256 Δ (ldh, pta,ack, ach, poxB). A cepa foi obtida diminuindo-se cada umadas atividades da lactato desidrogenase (ldh), acetil-CoAhidrolase (ach), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase(ack), e piruvato oxidase (poxB) na Brevibacteriumlactofermentum 2256 (Corynebaeterium glutamieum ATÇC13869)(WO 2005/113744 e WO 2005/113745).

Como plasmideo para amplificação da ODH, foi usado opPKS-X (WO 95/34672) contendo o gene da ODH; o plasmideopPK4 (WO 95/34672), que é o vetor correspondente, foi usadocomo controle. A cepa Brevibaeterium lactofermentum 2256 Δ(ldh, pta, ack, ach, poxB) foi transformada pelo método depulso elétrico. A cepa transformada foi espalhada sobre ummeio agar CM-Dex contendo 25 pg/mL de canamicina (contendo1,5% agar em 5 g/L glicose, 10 g/L polipeptona, 10 g/Lextrato de levedura, 1 g/L K2HPO4, 0,4 g/L MgSO4 · 7H20, 0,01g/L FeSO4 ·7Η20, 0,01 g/L MnSOWH2O, 3 g/L uréia, e 1,2 g/Lhidrolisado de soja, e tendo pH 7,5 (KOH)) e foi cultivadaa 31,5°C por cerca de 24 horas. Então a colônia obtida foipurificada e o plasmideo foi extraído por ura métodoconvencional. Como resultado, confirmou-se que o plasmídeo-alvo havia sido introduzido. Uma cepa obtida introduzindo-se o plasmideo com ODH amplificada na cepa em que aprodução de ácido acético foi reduzida foi denominada 2256(Idh, pta. ack,. ach, poxB)/pPKS-X. Uma cepa obtidaintroduzindo-se o vetor foi denominada 2256 Δ (ldh, pta.ack, ach, poxB)/pPK4.

(B) Produção de Ácido Succinico pela Cepa ODH-AmplificadaA cepa na qual o plasmideo ODH-amplifiçado descritoacima foi introduzido (2256 Δ (ldh, pta. ack, ach,poxB) /pPKS-X) e a cepa na qual o vetor . descrito acima foiintroduzido (2256 Δ (ldh, pta. ack, ach, poxB)/pPK4) foramcultivadas em meio agar CM-DEX. As células bacterianasobtidas foram inoculadas em 3 ml de meio semeado (20 g/Lglicose, 14 g/L (NH4)2SO4, 0,5 g/L KH2PO4, 0,5 g/L K2HPO4,0,5 g/L MgSO4-7H20, 4 g/L uréia, 0,02 g/L FeSO4-7H20, 0,02g/L MnSO4 · 7H20, 200 pg/L biotina, 200 μq/L VB1-HC1, 1 g/Lextrato de levedura e 1 g/L ácido casamino). As célulasbacterianas foram cultivadas em tubos de teste a 31,5°C porcerca de 8 horas sob condição aeróbica com agitação.

Em seguida, em cada tubo de teste foram acrescentados3 ml do meio principal (200 g/L de glicose foram filtradose carbonato de magnésio esterilizado com calor seco foimisturado à glicose filtrada de modo a se obter umaconcentração final de 143 g/L) . Os tubos de teste foramselados com rolhas de silicone para impedir aeração, eforam submetidos a cultivo para produção de ácido succínicoa 31,5 0C por cerca de 48 horas com agitação. A quantidadede ácido succínico produzida foi analisada porcromatografia líquida. Como coluna, foram usados duas peçasde Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomex Inc.) ligadas entresi em tandem, e as amostras foram eluídas com 5 mM de ácidotoluenosulfônico a 50°C. 0 eluato foi neutralizado com 20mM de solução aquosa Bis-Tris' contendo 5 mM de ácido p-toluenosulfônico e 100 μΜ de EDTA. A condutividade elétricada mistura foi medida por CDD-10AD (Shimadzu Corporation)para medir o ácido succinico. Vários espécimes de cada cepabacteriana foram submetidos a avaliação e os resultadosmédios estão na Tabela 1. A coluna "Rendimento(%)" mostra orendimento de ácido succinico em relação à glicose e acoluna "α-KG/AS(%)" mostra a proporção da concentração dea-cetoglutarato (α-KG) em relação ao ácido succinico (AS)no meio de cultura.

Tabela 1. Produção de Ácido Succinico pela cepaODH-Aumentada

<table>table see original document page 40</column></row><table>No caso da cepa 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB,ach)/(pPKS-X) usada como cepa ODH-amplifiçada, o rendimentoaumentou em cerca de 3% na média e a quantidade de a-KGcomo produto secundário diminuiu para cerca da metade emcomparação com a cepa 2256Δ (ldh, pta, ack, poxB,ach)/(pPK4) como controle. Com base nesses resultados,descobriu-se que, em uma bactéria produtora de ácidosuccinico que foi modificada de modo que a produção deácido acético diminuísse, o aumento da atividade da ODHcontribuiu para uma diminuição da produção de α-KG comoproduto secundário e para um aumento da produção de ácidosuccinico.

Aplicabilidade Industrial

De acordo com o método de produção da presenteinvenção, um ácido orgânico como o ácido succinico pode serproduzido rapidamente, com alto grau de eficiência. 0 ácidoorgânico obtido, tal como o ácido succinico, pode ser usadocomo aditivo alimentar, ou em produtos farmacêuticos,cosméticos, e semelhantes. Além disso, um polímero contendoácido orgânico também pode ser produzido por meio de umareação de polimerização, usando-se o ácido orgânico obtidocomo matéria prima.

Claims (14)

1. Uma bactéria capaz de produzir ácido orgânico, caracterizada por:a dita bactéria ser modificada de modo que a atividade de 2-oxoglutarato dehidrogenização seja aumentada se comparada com aatividade de 2-oxoglutarato dehidrogenização a partir de material nãomodificado.

2. Uma bactéria capaz de produzir ácido orgânico, caracterizada por:a dita bactéria ser modificada de modo que a atividade de produçãode ácido acético decresça, e a atividade de 2-oxoglutaratodehidrogenização seja aumentada se comparada com a atividade de-2-oxoglutarato dehidrogenização a partir de material não modificado.

3. A bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por:a produção de ácido acético ser diminuída pelo decréscimo daatividade acetato quinílica e/ou da atividade fosfotransacetílica.

4. A bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por:a produção de ácido acético ser diminuída pelo decréscimo daatividade acetil-CoA hidroxílica.

5. A bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por:a produção de ácido acético ser diminuída pelo decréscimo daatividade piruvato oxidílica.

6. A bactéria de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5,caracterizada por:a dita bactéria ser posteriormente modificada de modo que a atividadeIactato hidrogeneizadora seja diminuída.

7. A bactéria de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6,caracterizada por:a dita bactéria ser posteriormente modificada de modo que a atividadepiruvato carboxílica seja aumentada.

8. A bactéria de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 7,caracterizada por:a dita bactéria ser selecionada dentre o grupo cujos nomes científicossão: bactéria corineforme, Bacillus bacterium, Rhizobium bacterium,Escherichia bacterium, Lactobacillus bacterium e Saccinobacillusbacterium.

9. A bactéria de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 8,caracterizada por:o ácido orgânico ser o ácido succínico.

10. Um processo para produção de ácido orgânico, caracterizado por:compreender as etapas de:permitir à bactéria de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 9 ou a uma célula tratada dela derivada a agir como matéria primanuma reação de solução contendo um íon carbonato, ou um íonbicarbonato, ou gás dióxido de carbono para daí produzir um ácidoorgânico; ecoletar o ácido orgânico.

11. O processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por:à bactéria ou à célula tratada dela derivada ser permitida agir comomatéria prima orgânica sob uma atmosfera anaeróbica.

12. O processo de acordo com uma das reivindicações 10 ou 11,caracterizado por:a matéria prima orgânica ser glucose ou sucrose.

13. O processo de acordo com qualquer das reivindicações de 10 a 12,caracterizado por:o ácido orgânico ser o ácido succínico.

14. Um processo para produzir um ácido orgânico contendo polímero,caracterizado por:compreender as etapas de:produzir um ácido orgânico pelo processo de acordo com qualquerdas reivindicações de 10 a 13; esujeitar o ácido orgânico obtido com a matéria prima a uma reação depolimerização.