JP2844511B2 - 酢酸資化性遺伝子及びその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は大腸菌 (Escherichia co
li) の酢酸資化性遺伝子及びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌の液体培養を行う際に培地中にグ
ルコースを加えておくと、これを資化することにより生
じる酢酸が菌体外に放出され、培養時間及び菌の生育と
共に培地の pH が低下することがよく知られている。 p
H の低下は菌の生育を抑制し、発酵によるアミノ酸等の
物質生産を行う上で大きな問題となっている。このため
菌の改良によりこの問題の解決を図る試みがいくつかの
グループによりなされてきた。バウアーらは、ホスホト
ランスアセチラーゼの変異株を用いることにより、酢酸
の合成経路に欠損を持つ株を IL-2 の発酵生産に利用し
た。この株では培地中に酢酸の蓄積がみられず、菌の生
育も阻害されなかった （Keith A. B. etal.,Appl. Env
iron. Microbiol. 56:1296,1990）。また、松山らは大
腸菌の酢酸合成経路に関与する、アセテート・キナーゼ
をコードする遺伝子（ackA）の単離を行った（Asahi M.
et sl.,J.Bacteriol. 171:577, 1989）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明が解決し
ようとする課題は、発酵による物質生産において培地中
の酢酸の蓄積が原因で起こる菌の生育の阻害の問題を解
決することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌の酢酸資
化に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以
下、この遺伝子をace遺伝子、同遺伝子がコードするタ
ンパク質を Ace protein と称する。）、その単離及び
構造解析を行い、本発明を完成するに至らしめた。即ち
本発明は、 (i)エシェリヒア属に属する微生物を培地に培養し、目
的物質を培地に蓄積生成させ、該目的物質を採取する物
質の製造法において、配列表の配列番号（１）に示され
ているアミノ酸配列を有する蛋白質の細胞内濃度を上昇
させることを特徴とする当該目的物質の製造法； (ii)配列表の配列番号（１）に示されているアミノ酸配
列を有する蛋白質の細胞内濃度を上昇させる手段が、当
該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を上昇させるもの
である(i)記載の目的物質の製造法； (iii)配列表の配列番号（１）に示されているアミノ酸
配列を有する蛋白質の細胞内濃度を上昇させる手段が、
当該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数を増加させる
ものである(ii)記載の目的物質の製造法； (iv)配列表の配列番号（１）に示されているアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードする遺伝子が、配列表の配列
番号（１）の1138〜1140番目のACAから2350〜2352番目
のAATの塩基配列を有するものである(iii)記載の目的物
質の製造法； である。 以下、本発明について詳細に説明する。

【０００５】大腸菌を、グルコースを炭素源として培養
するとき、分解産物として酢酸が生じ、これが菌体外へ
分泌されるため、培養培地の pH 低下を招き、これによ
り菌の生育が阻害されることはよく知られている。発明
者が行った実験でもこのことは確認された（図１）。図
１には、大腸菌JM103株を0.4％ グルコース添加 L-brot
h、あるいはグルコース無添加 L-broth に培養したとき
の生育曲線、pH値の変化、及び培地中の酢酸の蓄積の様
子を示したが、培養後期に酢酸が蓄積し（図１右図）pH
値が低下していく様子（図１左図）が観察される。

【０００６】また、グルコースを添加したL-brothで培
養したときには、グルコースを添加していないL-broth
で培養したときに比べ生育が悪いことも観察されるが
（図１左図）、これがpHの低下に起因することは以下の
点より明かである。つまり、図１の培養条件においてリ
ン酸ナトリウム緩衝液を用いてpH値を7.0に保つことに
より、生育の阻害が見られなくなり、蓄積された酢酸が
資化されていくのである（data not shown）。

【０００７】そこで、L-broth培地に緩衝液を加え、 pH
を一定に保つ操作を行うと、図２に示す通り大腸菌JM1
03株はグルコース添加培地において二段階増殖を示す。
これは、ラクトースとグルコースが添加された培地中で
大腸菌が見せる二段階増殖とよく類似している。発明者
は、この現象はグルコースを消費し終わった大腸菌が、
培地中に分泌された酢酸を次の炭素源として再び生育を
開始することを反映していると考えた。つまり、大腸菌
にはグルコースの枯渇および酢酸の蓄積とともに発現誘
導を受ける酢酸資化関与の遺伝子（群）が存在すると考
えた。このように酢酸によって誘導を受ける遺伝子産物
については、本願発明者が1991年度日本農芸化学会大会
において報告したもののみが知られているにすぎない。
そこで発明者は、1991年度日本農芸化学会大会において
報告した遺伝子以外の遺伝子（群）の解析を行うことに
より、酢酸資化に係わる新たな遺伝子、さらには酢酸資
化機構についての新しい知見が得られると考え、これら
の遺伝子の単離及び構造決定を行った。

【０００８】これら遺伝子を単離する方法としては、プ
ラスミドベクターをベクターに用いて大腸菌染色体の遺
伝子ライブラリーを作成し、得られた組み換え体ＤＮＡ
混合物を大腸菌に導入した。この形質転換体を、グルコ
ース添加寒天Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養
を行ったところ、大きなコロニーを形成する形質転換
体、すなわち酢酸の蓄積による生育の阻害を受けないコ
ロニーを得ることができた。

【０００９】実際、この形質転換体（以下、3-11 株と
称する）は緩衝液によるpH調整をしていないグルコース
添加培養においても、酢酸の蓄積及びこれに起因する p
H の低下をもたらさなかった（図３右図）。また、同培
養条件における3ー11株の生育は、ベクタープラスミドＤ
ＮＡ（pUC19）のみで形質転換された株に比べ良好であ
った（data not shown）。更に3-11株の酢酸培地中での
生育は、ベクタープラスミドＤＮＡ（pUC19）のみで形
質転換された株に比べ有意に優勢であった（data not s
hown）。このため、この形質転換体の保持する組み換え
体ＤＮＡには、酢酸資化に関与する遺伝子（以下、ace
と称する。）が挿入されているものと結論した。以下同
遺伝子の単離及び構造決定の方法を詳述する。

【００１０】最初に、ace遺伝子を含有するＤＮＡの調
製について述べる。まず、野生型大腸菌例えば大腸菌 W
3110 株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養す
るには、通常の固体培養法で培養しても良いが、液体培
養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地とし
ては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スィープリカーあるいは大豆もしくは小麦の浸出液等の
１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第
２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化
マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マ
ンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応
じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した物が用いられ
る。なお、培地の初発 pH は、7〜8 に調製するのが適
当である。また培養は 30〜42℃、好ましくは 37 ℃前
後で 4〜24 時間、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置
培養等により行う。このようにして得られた培養物を、
例えば 3,000 r.p.m. 5 分間遠心分離して大腸菌 W3110
株の菌体を得る。

【００１１】この菌体より、例えば斉藤、三浦の方法
（Biochem. Biophys. Acta. 72:619,1963）、K. S. Kir
byの方法（Biochem. J. 64:405, 1956）等の方法により
染色体ＤＮＡを得ることができる。

【００１２】ついで、この染色体ＤＮＡに、制限酵素、
例えば Sau3AＩを、温度 30 ℃以上、好ましくは 37
℃、酵素濃度 1〜10 ユニット／mlで様々な時間 1 分〜
2 時間作用させて消化し、部分分解して種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。一方、本発明において用いるこ
とのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラ
スミドベクターＤＮＡが好ましく、具体的には pUC19
等が挙げられる。上記ベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡ
の切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を
生じさせる制限酵素 BamHＩを、温度 30 ℃以上、酵素
濃度 10〜1,000 ユニット／mlで 1 時間以上、好ましく
は 1〜3 時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤ
ＮＡを得る。次いで、上記のようにして得た大腸菌 W31
10 株由来で、アセテートＰ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡを混
合し、これにＤＮＡリガーゼ、このましくは T4 ＤＮＡ
リガーゼを、温度 4〜16 ℃、酵素濃度 1〜100 ユニッ
トで 1 時間以上、好ましくは6〜24 時間作用させて組
み換え体ＤＮＡを得る。

【００１３】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
ods in Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、上記菌株より、ace遺伝子を含有するＤ
ＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組み換え体ＤＮＡを
保持する大腸菌を、段落番号０００８に記される方法に
より分離できる。またその大腸菌よりace遺伝子を含有
する組み換え体ＤＮＡを回収する方法は常法に従うこと
ができる。組み換え体ＤＮＡの回収方法には、 P. Guer
ry らの方法（J. Bacteriol.,116:1064, 1973）、D. B.
Clewell の方法（J. Bacteriol., 110:667, 1972）な
どが用いられる。

【００１４】回収した組み換え体ＤＮＡに挿入されてい
るパッセンジャーＤＮＡを 3'側、5'側両方向より種々
の程度にデリートさせ、短縮体ＤＮＡを作成する。この
ときの短縮体ＤＮＡの作成には Mung Bean Nuclease,E
xonucleaseIII等を利用した手法などがある。この短縮
体ＤＮＡをベクターにつないで再び大腸菌を形質転換
し、その形質転換体がグルコースを含むL-Broth 寒天培
地上で大きいコロニーを形成する能力を持つことを指標
にして、当該遺伝子の領域の限定化を行える。

【００１５】上記のようにしてクローン化したＤＮＡ、
あるいは遺伝子領域の限定化を行った短縮体ＤＮＡを含
有する組み換え体ＤＮＡを試料に用いて、塩基配列決定
の常法であるダイデオキシ法によって、ace遺伝子を含
むＤＮＡの全塩基配列の決定を行える。えられた塩基配
列の情報よりＤＮＡの構造解析を行い、ついでこの全塩
基配列からオーフ゜ン・リーテ゛ィンク゛・フレームを推定し、これによっ
て規定されるポリペプタイドのアミノ酸配列を推定した
（配列表の配列番号（１）に示す）。このようにして確
定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明のac
e遺伝子である。具体的には、配列表の配列番号（１）
の1138〜1140番目のACAから2350〜2352番目のAATの塩基
配列を有するものである。

【００１６】近年、エシェリヒア属に属する微生物を培
地に培養し、様々な物質を培地に蓄積生成させ、該目的
物質を採取する物質の製造法が報告されている。このと
き目的とする物質は、ヒト細胞が産生する生理活性蛋白
質（インターフェロン、インターロイキン、ティシュ特
異的プラスミノーゲンアクティベーター等）、動物細胞
が産生する生理活性蛋白質（ウシ成長ホルモン等）、酵
素、アミノ酸、有機酸、抗生物質等様々なものがある。
このときに問題となるのが酢酸の蓄積である。酢酸の蓄
積は微生物の生育を阻害するために目的物質の生産性を
低下させるからである。ace遺伝子あるいは Ace protei
n は、この問題を解決する目的に用いることができる。

【００１７】酢酸の蓄積を抑制するためには、ace遺伝
子のコピー数を増加させることが効果的であることは、
当該遺伝子の取得過程より明かである。しかしながら、
酢酸蓄積抑制の原理が Ace protein の細胞内濃度の上
昇によることが明かである以上、これに限定されること
はない。 Ace protein の細胞内濃度の上昇させること
ができれば、いずれの方法によっても酢酸の蓄積による
目的物質の生産性低下を防ぐことができるのである。

【００１８】例えば、Ace protein の細胞内濃度を上昇
させる手段が、当該蛋白質をコードする遺伝子の発現量
を上昇させるものであってもよい。これは、遺伝子のプ
ロモーターを強化することにより実現される。また、オ
ペレーターを除去することによっても同遺伝子の構成的
発現が実現されるため、結果としてAce protein の細胞
内濃度が上昇する。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する

【００２０】（実施例１ 大腸菌 W3110 株の染色体Ｄ
ＮＡの調製）大腸菌 W3110 株を T-Y 培地［1％ Bacto-
trypton(Difco),0.5％ Bacto-yeastextract(Difco), 0.
5％ NaCl :(pH7.2)］100 ml に接種し、温度 37 ℃で 8
時間培養し、培養物を得た。この培養物を 3,000 r.p.
m.で 15 分間、常法により遠心分離処理し湿潤菌体 0.5
g を得た後、該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. B
iophys. Acta., 72:619, 1963）により染色体ＤＮＡを
得た。次いで、この染色体ＤＮＡ 60μg 及び制限酵素
Sau3AＩ、3ユニットを 10 mM トリス−塩酸緩衝液（50m
M NaCl、10mM MgSO₄ 及び 1mM ヂチオスレイトール含
有：pH 7.4）におのおの混合し、温度 37 ℃で 30 分間
反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈澱処理して Sau3AＩで消化された
大腸菌W3110株の染色体ＤＮＡ断片 50μg を得た。

【００２１】（実施例２ プラスミドベクターＤＮＡを
利用した大腸菌 W3110 株の遺伝子ライブラリーの作
製）プラスミドベクターＤＮＡ（pUC19）20μg 及び制
限酵素 BamHＩ200 ユニットを 50mM トリス−塩酸緩衝
液（100mM NaCl及び 10mM 硫酸マグネシウム含有：pH7.
4）に混合し、温度 37 ℃で 2 時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ
フラグメントが再結合することを防止するため、Molecu
lar Cloningp133 の方法で Bacterial Alkaline Phosph
atase 処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理を行った。

【００２２】このBamHＩで消化された pUC 19 を１μ
g、上記項目（１）で得られた Sau3AＩで消化された大
腸菌 W3110 株の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び 2 ユ
ニットの T4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を、66mM 塩化
マグネシウム、10mM ヂチオスレイトール及び 10mM Ａ
ＴＰを含有する 66mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)に
添加し、温度 16 ℃で 16 時間反応し、ＤＮＡを連結さ
せた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法により大腸菌 JM1
03 株を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にまき、約 5,000 個のコロニーを
得、遺伝子ライブラリーとした。

【００２３】（実施例３ 遺伝子ライブラリー組み換え
体ＤＮＡの回収）上記で述べた約 5,000 個のコロニー
より、組み換え体ＤＮＡの回収を行なった。5,000 個の
コロニーを 100 コロニーずつに分け、50 のバッチとし
た後、ＤＮＡを採取した。回収の方法は上記に示した
P. Guerryらの方法に従った。

【００２４】（実施例４ 大腸菌 JM103 株の形質転
換）50 のバッチに分けた組み換え体ＤＮＡ混合物を上
記に示した形質転換の常法に従い、JM103 株に導入し
た。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上にプレー
トし、37 ℃で静置培養を行なった。この中で他より大
きいコロニーを形成するもの１株を選び、3-11 株と命
名した。この株は、グルコース添加Ｌ液体培地で pH 低
下による生育阻害を受けなかった（図３）。

【００２５】（実施例５ ace遺伝子を多コピーで保持
する株の酢酸資化能の検定）本発明で取得したace遺伝
子が酢酸資化に関与するタンパク質をコードしているこ
とを確かめるため、ＬＢ＋グルコース培地上で、3-11株
（ace遺伝子を多コピーで保持する株）と、JM103/pUC19
株（pUC19を保持する株）のグルコース消費及び酢酸の
蓄積を調べた。JM103/pUC19株は図１に示すJM109株と同
様にグルコースの消費にともない酢酸を蓄積した（data
not shown）が、3-11株はグルコースが枯渇した後に炭
素源として酢酸を消費した（図３右図）。この結果よ
り、aceを多コピーで保持させることが大腸菌の酢酸資
化能を高めることが確認された。

【００２６】（実施例６ ＤＮＡの調製）上記で得られ
た組み換え体ＤＮＡを含有する大腸菌JM103株（3ー11
株）を、トリプトン 1％、酵母エキス 0.5 ％ 及び NaC
l 0.5 ％ からなる培地 20 ml に温度 37 ℃で 24 時間
前培養し、得られた培養液 20 ml を上記と同じ組成の
培地1l に接種し、温度 37 ℃で 3 時間培養したのち、
0.2g のクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度
で 20 時間培養を行い、培養液を得た。次いで、この培
養液を、常法により 3,000 r.p.m.で 10 分間遠心処理
して湿潤菌体各 2 g を得、これを 20 ml の 25 ％ シ
ョ糖を含有する 350 mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に
懸濁したのち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）10
mg、0.25 M EDTA溶液(pH8.0) 8 ml 及び 20 ％ ドデシ
ル硫酸ナトリウム溶液 8 ml を各々添加し、温度 60℃
で 30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。この溶菌液
に、5M NaCl 溶液 13ml を添加し、温度 4 ℃で 16 時
間処理した物を常法により、 15,000r.p.m.で 30 分間遠
心分離した。上清液を、常法によりフェノール抽出処理
及びエタノール沈澱処理を行いＤＮＡを沈澱させた。

【００２７】この沈澱物の減圧乾燥処理したものを、1m
M EDTA を含有する 10 mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
6 ml に溶解し、さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びエ
チジウムブロマイド（19 mg/ml）0.2 ml を添加した物
を、常法により 39,000 r.p.m.で 42 時間超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、ＤＮＡを単
離し、又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブ
ロマイドを除去した後、1 mM EDTA を含有する 10 mM
トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）に対して透析を行い純化
された組み換え体ＤＮＡp3-11を約 500μg を得た。

【００２８】（実施例７ ace遺伝子を含有するＤＮＡ
の塩基配列の解析）実施例６で得られた組み換え体ＤＮ
Ａをアルカリ変性させ一本鎖ＤＮＡを調製した。

【００２９】得られた一本鎖ＤＮＡによるシークエンシ
ングは、M-13 シークエンスキット（宝酒造製）を用い
Sanger の方法にしたがって行った。得られたace遺伝子
を含むＤＮＡの塩基配列は配列表に示す通りである。オー
フ゜ン・リーテ゛ィンク゛・フレームを推定し、その塩基配列より推定さ
れる産物のアミノ酸配列も配列表に示した。この蛋白質
をAce protein とした。蛋白質のＮ末端にあるメチオニ
ン残基は翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されるこ
とがよく知られている。これは、Ｎ末端のメチオニンは
翻訳開始コドンであるATGに由来するため、蛋白質本来
の機能とは無関係であることが多いためである。本願発
明のAce protein の場合にもメチオニン残基の除去が生
じている可能性がある。

【００３０】塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて
既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベー
スはSwiss-protである。その結果、配列表配列番号
（１）に示される蛋白質は、すでに報告済みの蛋白質で
あった。当該蛋白質は Mol. Microbiol. vol. 3 (1989)
505-515; Biochemistry & Cell Biology vol. 68 (199
0)123-137; Mol. Gen. Genet. vol. 219 (1989) 97-105
において、NagC 蛋白質あるいは NagR 蛋白質として記
載されている。しかしながら、これらの文献のいずれに
も当該蛋白質が酢酸資化能に関与することを示唆する記
載はない。また、図８に示すように、p3-11にクローン
化されたＤＮＡ断片は、nag R (nag C, ace)以外にも n
ag A 遺伝子の一部と nag D 遺伝子の一部をも含有する
ことが判明した。

【００３１】（実施例７ 短縮体ＤＮＡの作製）3-11
株より組み換え体ＤＮＡを回収し、遺伝子領域の限定化
を行った。すなわち実施例７で推定したオーフ゜ン・リーテ゛ィンク゛
・フレーム及びそこコードされる蛋白質（Aceprotein, Nag R
protein）が酢酸資化に関与しているという推定が本当
に正しいかどうかを確認するため短縮体ＤＮＡの作製を
行った。p3-11に挿入されている配列番号（１）のＤＮ
Ａ断片のうち EcoRV-EcoRV 700bp 断片（図５及び図６
の網掛け部分）を除去したプラスミドを作成した。この
短縮体ＤＮＡで再び大腸菌JM103株を形質転換し、その
形質転換体がグルコースを含むＬ培地中で酢酸資化能を
発揮することができるかどうか検討した。その結果この
プラスミドを保持する形質転換体は酢酸資化能を発揮せ
ず、本願発明者が行ったオーフ゜ン・リーテ゛ィンク゛・フレーム及びそこ
コードされる蛋白質の推定が正しかったことが立証され
た。

【００３２】

【発明の効果】以上のように本発明は、大腸菌の酢酸資
化性遺伝子（ace遺伝子）に関するものである。この遺
伝子を多コピーで大腸菌に導入することにより、その大
腸菌は酢酸資化能の上昇が観察される。これにより、本
発明は、大腸菌を用いて物質生産を行う際問題となる、
pH の低下による菌の生育の阻害を解決するものであ
る。

【００３３】

【配列表】

配列番号（１） 配列の長さ：2556bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：1135-2352 GATCTTTACC GGCCACGAAT TTCTTGATGA CCACGCGGTT GTTATCGCTG ATGGCCTGAT 60 TAAAAGCGTC TGTCCGGTAG CGGAACTGCC GCCAGAGATC GAACAACGTT CACTGAACGG 120 GGCCATTCTC TCCCCCGGTT TTATCGATGT GCAGTTAAAC GGCTGCGGCG GCGTACAGTT 180 TAACGACACC GCTGAAGCGG TCAGCGTGGA AACGCTGGAA ATCATGCAGA AAGCCAATGA 240 GAAATCAGGC TGTACTAACT ATCTGCCGAC GCTTATCACC ACCAGCGATG AGCTGATGAA 300 ACAGGGCGTG CGCGTTATGC GCGAGTACCT GGCAAAACAT CCGAATCAGG CGTTAGGTCT 360 GCATCTGGAA GGTCCGTGGC TGAATCTGGT AAAAAAAGGC ACCCATAATC CGAATTTTGT 420 GCGTAAGCCT GATGCCGCGC TGGTCGATTT CCTGTGTGAA AACGCCGACG TCATTACCAA 480 AGTGACCCTG GCACCGGAAA TGGTTCCTGC GGAAGTCATC AGCAAACTGG CAAATGCCGG 540 GATTGTGGTT TCTGCCGGTC ACTCCAACGC GACGTTGAAA GAAGCAAAAG CCGGTTTCCG 600 CGCGGGGATT ACCTTTGCCA CCCATCTGTA CAACGCGATG CCGTATATTA CCGGTCGTGA 660 ACCTGGCCTG GCGGGCGCGA TCCTCGACGA AGCTGACATT TATTGCGGTA TTATTGCTGA 720 TGGCCTGCAT GTTGATTACG CCAACATTCG CAACGCTAAA CGTCTGAAAG GCGACAAACT 780 GTGTCTGGTT ACTGACGCCA CCGCGCCAGC AGGTGCCAAC ATTGAACAGT TCATTTTTGC 840 GGGTAAAACA ATATACTACC GTAACGGACT TTGTGTGGAT GAGAACGGTA CGTTAAGCGG 900 TTCATCCTTA ACCATGATTG AAGGCGTGCG TAATCTGGTC GAACATTGCG GTATCGCACT 960 GGATGAAGTG CTACGTATGG CGACGCTCTA TCCGGCGCGT GCGATTGGCG TTGAGAAACG 1020 TCTCGGCACA CTCGCCGCAG GTAAAGTAGC CAACCTGACT GCATTCACAC CTGATTTTAA 1080 AATCACCAAG ACCATCGTTA ACGGTAACGA GGTCGTAACT CAATAAGAGA AAGT ATG 1137 Met 1 ACA CCA GGC GGA CAA GCT CAG ATA GGT AAT GTT GAT CTC GTA AAA CAG 1185 Thr Pro Gly Gly Gln Ala Gln Ile Gly Asn Val Asp Leu Val Lys Gln 5 10 15 CTT AAC AGC GCG GCG GTT TAT CGC CTG ATT GAC CAG TAC GGG CCA ATC 1233 Leu Asn Ser Ala Ala Val Tyr Arg Leu Ile Asp Gln Tyr Gly Pro Ile 20 25 30 TCG CGG ATT CAG ATT GCC GAG CAA AGC CAG CTT GCC CCC GCC AGC GTA 1281 Ser Arg Ile Gln Ile Ala Glu Gln Ser Gln Leu Ala Pro Ala Ser Val 35 40 45 ACC AAA ATT ACG CGT CAG CTT ATC GAA CGC GGG CTG ATC AAA GAA GTT 1329 Thr Lys Ile Thr Arg Gln Leu Ile Glu Arg Gly Leu Ile Lys Glu Val 50 55 60 65 GAT CAG CAG GCC TCC ACC GGG GGC CGC CGC GCT ATC TCC ATC GTC ACC 1377 Asp Gln Gln Ala Ser Thr Gly Gly Arg Arg Ala Ile Ser Ile Val Thr 70 75 80 GAA ACC CGC AAT TTC CAC GCA ATC GGC GTA CGG CTT GGT CGT CAT GAC 1425 Glu Thr Arg Asn Phe His Ala Ile Gly Val Arg Leu Gly Arg His Asp 85 90 95 GCC ACC ATC ACT CTG TTT GAT CTC AGC AGC AAA GTG CTG GCA GAA GAA 1473 Ala Thr Ile Thr Leu Phe Asp Leu Ser Ser Lys Val Leu Ala Glu Glu 100 105 110 CAT TAC CCG CTG CCG GAA CGT ACC CAG CAA ACG CTG GAA CAT GCC CTG 1521 His Tyr Pro Leu Pro Glu Arg Thr Gln Gln Thr Leu Glu His Ala Leu 115 120 125 TTG AAT GCC ATT GCT CAG TTT ATT GAT AGC TAC CAG CGC AAA CTG CGC 1569 Leu Asn Ala Ile Ala Gln Phe Ile Asp Ser Tyr Gln Arg Lys Leu Arg 130 135 140 145 GAG CTG ATC GCG ATT TCG GTG ATC CTG CCA GGG CTT GTT GAC CCG GAC 1617 Glu Leu Ile Ala Ile Ser Val Ile Leu Pro Gly Leu Val Asp Pro Asp 150 155 160 AGC GGC AAA ATT CAT TAC ATG CCG CAT ATT CAG GTA GAA AAC TGG GGG 1665 Ser Gly Lys Ile His Tyr Met Pro His Ile Gln Val Glu Asn Trp Gly 165 170 175 CTG GTA GAA GCT CTG GAA GAA CGT TTT AAA GTG ACC TGT TTC GTT GGT 1713 Leu Val Glu Ala Leu Glu Glu Arg Phe Lys Val Thr Cys Phe Val Gly 180 185 190 CAC GAT ATC CGT AGT CTG GCG CTG GCG GAC GAC TAC TTC GGT GCA AGT 1761 His Asp Ile Arg Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Gly Ala Ser 195 200 205 CAG GAT TGC GAA GAC TCC ATT CTG GTG CGT GTC CAT CGC GGA ACC GGG 1809 Gln Asp Cys Glu Asp Ser Ile Leu Val Arg Val His Arg Gly Thr Gly 210 215 220 225 GCC GGG ATT ATC TCT AAC GGG CGC ATT TTT ATT GGC CGC AAC GGC AAC 1857 Ala Gly Ile Ile Ser Asn Gly Arg Ile Phe Ile Gly Arg Asn Gly Asn 230 235 240 GTC GGT GAA ATT GGC CAT ATT CAG GTC GAA CCG CTG GGT GAA CGC TGC 1905 Val Gly Glu Ile Gly His Ile Gln Val Glu Pro Leu Gly Glu Arg Cys 245 250 255 CAC TGC GGC AAC TTT GGC TGC CTG GAA ACT ATC GCT GCC AAC GCT GCC 1953 His Cys Gly Asn Phe Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ala Asn Ala Ala 260 265 270 ATT GAA CAA CGG GTG TTG AAT CTG TTA AAG CAG GGC TAC CAG AGC CGC 2001 Ile Glu Gln Arg Val Leu Asn Leu Leu Lys Gln Gly Tyr Gln Ser Arg 275 280 285 GTG CCG CTG GAC GAC TGC ACC ATC AAA ACT ATC TGC AAA GCC GCG AAC 2049 Val Pro Leu Asp Asp Cys Thr Ile Lys Thr Ile Cys Lys Ala Ala Asn 290 295 300 305 AAA GGC GAT AGT CTG GCG TCG GAA GTA ATT GAG TAT GTC GGT CGT CAT 2097 Lys Gly Asp Ser Leu Ala Ser Glu Val Ile Glu Tyr Val Gly Arg His 310 315 320 CTG GGT AAA ACC ATC GCC ATT GCT ATC AAC TTA TTT AAT CCG CAA AAA 2145 Leu Gly Lys Thr Ile Ala Ile Ala Ile Asn Leu Phe Asn Pro Gln Lys 325 330 335 ATT GTT ATT GCC GGT GAA ATC ACC GAA GCC GAT AAA GTG CTG CTC CCT 2193 Ile Val Ile Ala Gly Glu Ile Thr Glu Ala Asp Lys Val Leu Leu Pro 340 345 350 GCT ATT GAA AGC TGC ATT AAT ACC CAG GCG CTG AAG GCG TTT CGC ACT 2241 Ala Ile Glu Ser Cys Ile Asn Thr Gln Ala Leu Lys Ala Phe Arg Thr 355 360 365 AAT CTG CCG GTG GTA CGT TCT GAG CTG GAT CAC CGC TCG GCA ATC GGC 2289 Asn Leu Pro Val Val Arg Ser Glu Leu Asp His Arg Ser Ala Ile Gly 370 375 380 385 GCT TTT GCG CTG GTA AAA CGC GCC ATG CTC AAC GGT ATT TTG CTC CAG 2337 Ala Phe Ala Leu Val Lys Arg Ala Met Leu Asn Gly Ile Leu Leu Gln 390 395 400 CAT TTG CTG GAA AAT TAATGTGCTT TTATAGTGGC GCTTATTGTT GTCAATATTC 2392 His Leu Leu Glu Asn 405 TGGGTAGTCC ATGACCATTA AAAATGTAAT TTGCGATATC GACGGCGTGC TGATGCACGA 2452 TAACGTCGCC GTACCGGGTG CAGCGGAATT TTTGCACGGG ATTATGGATA AAGGCCTGCC 2512 GCTGGTGTTG CTGACCAACT ATCCTTCGCA GACTGGGCAA GATC 2556

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１左図は、JM103株の生育を示したもので
ある。培地には各々グルコース添加Ｌ培地と、グルコー
ス無添加Ｌ培地とを用いた。又、グラフには生育曲線と
同時に、培地の pH の変化も経時的に示した。図１右図
は、JM103株をグルコース添加Ｌ培地に培養したとき
の、培地中グルコース濃度と酢酸濃度を示したものであ
る。

【図２】 図２は、大腸菌 JM103 株をグルコース添加
Ｌ培地で培養したときの生育曲線を示したものである。
なお培地は、リン酸ナトリウム緩衝液により pH7.2 に
保たれている。グルコースを添加した培地においての
み、二段階増殖が観察される。

【図３】 図３は、ショットガンクローニングで得た 3
-11 株の酢酸資化能を、ベクターのみを保持する JM103
/pUC19 株のものと比較したものである。培地には各々
グルコース添加Ｌ培地を用いた。 JM103/pUC19株の培養
の際にはリン酸ナトリウム緩衝液を培地に添加し、pH値
を7.0に保った。 3-11株、 JM103/pUC19株おのおのにつ
いて、培地中のグルコースの濃度と酢酸の濃度を経時的
に測定し、結果をグラフに示した。

【図４】 配列表配列番号（１）に示されるＤＮＡ断片
の構造と制限酵素切断位置を示す。

【図５】 配列表配列番号（１）に示されるＤＮＡ断片
の構造と制限酵素切断位置を示す。

【図６】 配列表配列番号（１）に示されるＤＮＡ断片
の構造と制限酵素切断位置を示す。

【図７】 配列表配列番号（１）に示されるＤＮＡ断片
の構造と制限酵素切断位置を示す。

【図８】 プラスミドp3-11に挿入されたＤＮＡ断片上
に含まれる遺伝子群を示す。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属する微生物を培地に
   培養し、目的物質を培地に蓄積生成させ、該目的物質を
   採取する物質の製造法において、配列表の配列番号
   （１）に示されているアミノ酸配列を有する蛋白質の細
   胞内濃度を上昇させることを特徴とする当該目的物質の
   製造法。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号（１）に示されている
   アミノ酸配列を有する蛋白質の細胞内濃度を上昇させる
   手段が、当該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を上昇
   させるものである請求項１記載の目的物質の製造法。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号（１）に示されている
   アミノ酸配列を有する蛋白質の細胞内濃度を上昇させる
   手段が、当該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数を増
   加させるものである請求項２記載の目的物質の製造法。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号（１）に示されている
   アミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が、配
   列表の配列番号（１）の1138〜1140番目のACAから2350
   〜2352番目のAATの塩基配列を有するものである請求項
   ３記載の目的物質の製造法。