JP2004535802A - 新規なインテイン及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は自己切断タンパク質又はインテインを提供する。そのインテインは、広範囲なクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から得ることができる。さらに提供されるものは、タンパク質の精製などインテインを使用する方法、及びインテイン機能を阻害するための薬剤の効能を試験する標的として提供される。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)にて同定された新たなインテインに関する。上記インテインが、微生物機能を阻害すべき薬剤を試験する分子標的として有益である。
【０００２】
インテインとは、前駆タンパク質配列内の枠内に包埋され、及びタンパク質の成熟中(1)切除される、可動なタンパク質スプライシング要素である。インテインは、種やタンパク質類にわたって散発的に分布している。これらは、生命分類として3種の界全てに形成しているが、比較的少ない種に見出されている。異なる生物からの相同タンパク質内の同じ位置に存在するインテインが、「対立」インテイン(2)と呼ばれる。21だけの対立インテインが、14タンパク質から記載されている。大部分のインテインは、古細菌及び細菌に見出されたが、真核生物にほとんど見出せず、そしてヒトなど高級真核生物において見出されなかった。
【０００３】
大部分のインテインは、エンドヌクレアーゼのドメインを有する。エンドヌクレアーゼのドメインを欠いているインテインも同定されている。これら「ミニ・インテイン」の占める割合は、全てのインテインのうち20%に満ず、さらにスプライスされ得るが、新たな部位に拡散することができない。
【０００４】
今日まで、4種の非対立インテインが、真核細胞の微生物に関し記載されている。ポルフィラ・パプレア(Porphyra purpurea(レッド藻類))及びグウラデア・テタ(クリプトモナド(Guillardia theta(cryptomonad藻類))色素体は、これらのNDA Bヘリカーゼ遺伝子における対立遺伝子のミニインテイン遺伝子を有する。緑色藻類クラミドモナス・エウガメトス(Chlamydomonas eugametos)は、クロロプラスト clp-A遺伝子内のDODエンドヌクレアーゼを含むインテイン遺伝子を有する。キロ・イリデセント(Chilo iridescent)ウイルスのリボヌクレオチド・リダクターゼ・クラス1遺伝子にインテインがある。対立遺伝子のインテインが、バチルス・スブチルスのプロファージ(スプベタ(Spbeta))と相同の遺伝子である。前記の核様真核細胞のインテイン遺伝子だけが、サッカロマイセス・セレビサ(Saccharomyces cerevisae(Sce VMA;3))及びカンジタ・トロピカリス(Candida tropicalis(Ctr VMa;4)の空胞性ATP(VMA)遺伝子に存在する。Sce VMA及びCtr VMAの対立遺伝子インテインが類似する長さ(それぞれ454と471のアミノ酸)で、37%相同である。共に、スプライシング・ドメインに加えてエンドヌクレアーゼドメインを有す。Sce VMAのエンドヌクレアーゼにより、減数分裂中のインテインのないVMA遺伝子に占有されていない標的部位が切断されることが示され、そして、前に占有されていない対立遺伝子にインテイン遺伝子を「ホーミング(homing)」することになる(5)。
【０００５】
インテインは、極めて有望な抗微生物標的(引用により本明細書に組み入れられている米国特許第5,795,731)として同定されてきた。標的として有益であるためには、インテインが、標的とされる微生物のほとんどの菌株、又は全ての菌株の存在し、そして有意な病原に関係する微生物に存在する必要がある。さらに真核生物のインテインが、これらの群がまだあまり特徴付けされていないことから、特に有益である。
【０００６】
したがって、本発明の目的では、少なくとも幾つかの方法でこれらの要件を満たすような、又は公共に対し少なくとも有益な選択を提供するインテインが提供される。
【０００７】
現段階で発明者は、予想外にも広い範囲のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)に存在する新規の真核性インテインを同定した。本発明が広く対象とするのは、このインテイン(Cne PRP8)に対してである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って第一の観点において、本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から得ることが出来るCne PRP8として同定されたインテイン、又はそれと機能的に同等の、又は機能的に変更されたその断片又は変異体を提供する。
【０００９】
好ましくは、インテインを、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド,米国アクセス番号ATCC 32045に寄託のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn35から単離することができる。
【００１０】
従来、インテインは、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8から得ることができる。
【００１１】
好ましい観点において、インテインは、配列番号：1,2,3,4,5,6,7及び8から成る群から選択されるアミノ酸を含む。
【００１２】
好ましくは、上記インテインは、配列番号：1記載のアミノ酸配列を有するか、又は機能的に同等の変異体又はその断片である。
【００１３】
さらに本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)以外の微生物から得ることができるインテイン、及び本発明のインテインに機能的に同等の又は機能的に変更された変異体又は断片を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、配列番号:1の配列と約35%より多く、好ましくは約50%より多くにて同一で、配列番号:1の配列と好ましくは約60%より多く、より好ましくは約70%より多く、より好ましくは約80%より多く、より好ましくは約90%より多く、及びさらに好ましくは約95%より多くにて同一である、アミノ酸配列を有する単離されたインテインが提供される。
【００１５】
さらなる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１６】
さらに本発明は、アクセス番号ATCC32045下、米国、メリーランドにおけるアメリカンタイプ・カルチャー・コレクションに寄託した、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn 3511のゲノムの1部であるインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
さらなる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする図1Bに記載されている塩基142から塩基657の約516の核酸を含む単離された核酸分子、又はその断片又は変異体を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、配列番号：9,10,11,12,13,14,15,16及び17から成る群から選択されるコード配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
核酸分子は、RNA又はcDNAで可能であるが、好ましくはDNA分子である。
【００２０】
さらに、本発明は、上に明示されたように本発明の核酸分子、あるいはその断片又はその変異体を含むベクター又は構造を提供する。
【００２１】
さらに本発明のベクターにより形質転換され、そして本発明のインテインを発現できるホストが提供される。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の核酸分子を含み且つ本発明のインテインを発現できる実質的に純粋な形状な生物を含む。
【００２３】
さらに別の観点において、本発明は、Cne PRP8インテイン又は医薬に使用するインテイン構造体を提供する。
【００２４】
好ましくはその使用は、抗微生物活性のため薬剤を試験する標的としてである。
【００２５】
さらに本発明は、本発明のインテインを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる観点における本発明は、本発明のインテインを含むタンパク質を提供する。
【００２７】
1つの例において、そのタンパク質は、N-及びC-末端のイクステインによりフランク(flank)された本発明のインテインを含む。
【００２８】
好ましくは、N-及びC-末端のイクステインは、両方がレポータ・タンパク質を形成する近接及び遠位のイクステインを含む。
【００２９】
別の例において、そのタンパク質は、タンパク質の結合部位、本発明のインテイン、及びレポータ・タンパク質部位を含む。
【００３０】
レポータ・タンパク質は、酵素アッセイのタンパク質、抗生物質に耐性を与えるタンパク質、比色定量アッセイに直接提供するタンパク質、又はin vivo活性によりアッセイ可能なタンパク質、から選択することができる。
【００３１】
好ましくは、レポータタンパク質は、チミジレートシンターゼ、β-ガラクトシターゼ、オロテック酸デカルボキシラーゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリ・ホスホターゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質から成る群から選択される。
【００３２】
さらなる観点において、本発明は、タンパク質を生成する方法を提供し、その方法は、本発明のインテインを含むタンパク質を切断状態になりやすいようにすることを含む。
【００３３】
1つの例において、そのタンパク質は、融合タンパク質である。
【００３４】
さらに本発明は、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、微生物に抗生物質活性のための薬剤をスクリーニングする方法を提供し、前記微生物が、その微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子において本発明のインテインを有し、前記方法が前記インテインの阻害を検出することを含む、
(a)(i)レポータ遺伝子内に静止した制限部位を含む変更されたレポータ遺伝子、及び(ii)前記インテインを含む誘発可能な発現ベクターの組み換えクローンを調製する工程；
(b)前記薬剤の存在下前記組み換えクローンにより前記インテインのエックステイン生成物の生成を検出する工程；
を含み、
ここで前記イクステイン生成物の生成が減少すると、前記インテインの阻害、および前記微生物に前記薬剤の抗生物質の活性が明示される。
【００３６】
さらなる観点において、本発明が、微生物に抗生物質活性に対し薬剤をスクリーニングする方法を提供し、前記微生物が、その微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に、本発明のインテインを有し、その方法がインテイン機能を監視することにより、前記インテインの阻害を検出することを含む、
(a)変更されたレポータ遺伝子となるレポータ遺伝子内に静止した制限部位を生成する工程；
(b)誘発可能な発現ベクターに前記変更されたレポータ遺伝子をクローニングする工程；
(c)組み換えクローンを生成するため、前記変更されたレポータ遺伝子を含む前記誘発可能な発現ベクターに前記変更されたレポータ遺伝子をクローニングする工程；そして
(d)前記薬剤の存在下、前記組み換えクローンにより、前記インテインのイクステイン産生物の生成を検出する工程；
を含む前記方法で、
ここで、前記イクステイン生成物の生成が減少すると、前記インテインの阻害、および前記微生物に対し前記薬剤の抗生物質の活性が明示される。
【００３７】
これらの方法において、さらにインテインが、システイン、セリン及びトレオニンから選択される付加的に保守される遠位のアミノ酸残基を含む。
【００３８】
微生物が、広範囲な微生物病原体、酵母及びバクテリアから選択することができる。好ましくは、微生物が、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌、及びサッカロミセス(Saccharomyces)種から成る群から選択される。
【００３９】
好ましくは、タンパク質はCnePRP8である。
【００４０】
好ましいレポータ遺伝子が、β-ガラクトシターゼAで、好ましい誘発可能な発現ベクターがpUC19である。
【００４１】
イクステイン生成物の検出は、従来より表現型特徴付けにて行われる。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
広く上記要約のように、本発明の一つの観点において、新規インテインが提供される。
【００４３】
Cne PRP8として同定されたインテインが、図2(塩基対48から219)、及び配列番号:1に記載のアミノ酸を含む。従来Cne PRP8は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から得る事ができる。基本的に同等の変異体も考えられる。現在まで、機能的に同等の変異体が、47クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans) 菌株より同定され、そのインテインが、広く複数の種にわたっていることを示している。従来本発明のインテインは、米国メリーランド州、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクションに寄託された、寄託番号ATCC32045のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から、得ることができる。
【００４４】
Cne PRP8は、担子菌網から誘導される第一のインテイン、及び同定された第二の(非対立遺伝子)真核性の核様インテインだけである。Cne PRP18は、「ミニ-インテイン」であると考える。
【００４５】
本発明のインテインは、全体のアミノ酸配列を含むことができるか又はこうした部分が活性断片を構成する配列の部分だけを含むことができる。さらにインテインに末端の保守残基を含む拡張されたインテインが、提供される。インテインに対し直ぐ後の保守された残基が、システイン、セリン及びトレオニンから成る群から選択することができる。
【００４６】
本発明に使用する1つの核酸されたインテインが、アミノ酸配列を有する：
上記のように、さらに本発明は、配列番号：1の機能的に同等の変異体の範囲内に含まれる。7種の機能的に同等の変異体が、図7において、及び(配列番号1乃至8)に示されている。これらが変異体だけの例であり、これらの配列を限定するものでない。源のインテインと少なくとも実質的に同じ機能を有する。
【００４７】
「機能的に同等の変異体」という語句は、実質的に同等の機能性を保持し、タンパク質のアミノ酸を変更できると認められる。たとえば同等のペプチドが、免疫的な交差反応であり、そして少なくとも源のインテインと実質的に同等の機能を有する場合、タンパク質が、特定機能に別のタンパク質と機能的に同等であると考えることができる。
【００４８】
さらに機能的に変更された変異体が考えられる。有意に保守された配列が、インテインとイクステインが結びついていると見られることが、当業者に理解されるであろう(InBase http://www.ineb.com/inteinsを参照)。セリン(S)、トレオニン(T)、又はシステイン(C)は、インテインのN-末端に、一方ヒスチジン(H)、及びアスパラギン(N)は、一方又は両方のインテインのC末端に生成する。これらアミノ酸残基の変異化又は欠失によりインテイン機能を変更させ、インテイン-イクステイン接合部に切断が形成され、又はスプライシング又は切断のできないインテインを得ることが、技術的に認識される(Chongら、(1998b)J.Biol.Chem.273:10567-10577and WO 01/12820を参照)。本明細書に使用される「機能的に変更される」という用語は、こうした全てのインテインを含む。
【００４９】
機能的に同等、又は変更されたタンパク質が、源と同じサイズである必要がない。たとえば、同等又は変更されたタンパク質が、たとえば、タンパク質の断片、別のタンパク質又は担体によるタンパク質との融合、付加的アミノ酸による断片を融合することができる、全長あるCne PRP8の1又は複数のアミノ酸残基の欠失による得ることができる。さらにアミノ酸の配列にて、従来の技術を用いて同等のアミノ酸と置換することが可能である。同等に成るようの保持されるアミノ酸の群は、
(a) Ala,Ser,Thr,Pro,Gly;
(b) Asn,Asp,Glu,Gln;
(c) His,Arg,Lys;
(d) Met,Leu,Ile,Val;及び
(e) Phe,Tyr,Trp.
たとえば、その同等物が、たとえば165から171のアミノ酸、置換、付加、又は欠失されたインテインの変異体、あるいはタンパク質の融合、又は他のアミノ酸による断片又は変異体を含む、インテインの断片でも可能である。
【００５０】
ポリペプチド配列が、配置され、そして特異的領域にて同定されるアミノ酸の割合は、公的に利用可能なコンピュータ・アルゴリスムを用いて他の配列に対し決定することができる。ポリペプチド配列の類似性が、BLASTPのアルゴリスムを用いて試験することができる。BLASTPソフトウエアは、NCBI anonymous FTP server(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)under /blast/exectablrs/にて利用できる。BLASTPを含むBLASTファミリーのアルゴリズムが、NCBIのウェブサイトの、URLのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlにて、そしてAltschul,Stephen Fら、(1997),「Gapped Blast and PSI-BLAST:a new generation of protein database seach programs」、Nucleic Acids Res.25:3389-34023か、記載されている。
【００５１】
したがってさらなる観点において、さらに本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から単離できるインテインを提供し、それは、図2に示されるアミノ酸配列内から1又は複数の活性ペプチドを含む。
【００５２】
同定された本発明の特異的小インテインは、以下のアミノ酸配列を有す：
CLQNGTRLLRADG
SEVLVEDVQEGDQLLGPDGT
SRTASKIVRGEERLYRIKTH
EGLEDLVCTHNHILSMYKER
SGSERAHSPSADLDLTDSHE
RVDVTVDDFVRLPQQEQQKY
QLFRSTASVRHERPSTSKLD
TTLLRINSIELEDEPTKWSG
FVVDKDSLYLRHDYLVLHN
(配列番号：１）
又は機能的に同等の変異体又はその断片。
【００５３】
さらに本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列を有するポリペプチドと本発明のインテインと約35%同一、好ましくは約50%同一、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有する相同性ポリペプチド、およびインテインに対し、好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
インテインの活性な断片と他の変異体と共に本発明のインテインは、合成又は組み換え手段により生成することができる。約100より有意に少ないアミノ酸を有し、そして一般的に50%より有意に少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドが、当業者に周知な技術により生成することができる。たとえば、こうしたペプチドが、メリーフイルド(Merryfirld)固相合成法などのいずれか商業的に利用できる固相技術を用いて、生成することができ、ここでアミノ酸は直線的に加えられて、アミノ酸鎖として増殖する(Merryfield,J.Am.Chem.Soc 85:2146-2149(1963)を参照)。ペプチドの自動合成のための装置は、Perkin Elmer/Applied Biosystems,Incなどの供給者から商業的に利用可能で、製造指示により操作することができる。
【００５５】
断片は、十分な長さのインテインの1又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより得ることができる。これは、インテインのN-又はC-末端から、又はインテインの内から順次欠失することにより可能である。
【００５６】
さらに本発明のインテイン、あるいはその断片又は変異体が、発現ベクターにそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド(通常DNA)配列を挿入し、そして適切な宿主内にそのタンパク質を発現することにより、組み換え的に生成することができる。当業者に知られた種々の発現ベクターのいずれかが用いられ、そしてプラスミド、プラスミドを用いるpUC及びpET、特にpUC19を含む。
【００５７】
発現は、組み換えタンパク質をコードするDNA分子を含む発現ベクターにより形質転換されていたか、又はトランスフェクトされていたという適切な宿主細胞にて行われる。適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、及び有意に高い真核細胞が含まれる。好ましくは、用いられる宿主細胞には、バキュロウイルス発現ベクターを用いて大腸菌、酵母又は、COS又はCHOなどの哺乳動物の細胞株、又は、SF9などの昆虫の細胞株がある。大腸菌、及びサッカロミセス種が、特に好ましい。クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)及び他のクリプトコッカス種も宿主細胞として使用することができる。この方法にて発現されるDNA配列は、天然のオカーリングインテイン(occurringintein)、天然のオカーリングインテイン(occurringintein)タンパク質の断片又はその変異体をコードすることができる。
【００５８】
さらにインテインの変異体は、オリゴヌクレオチド対象部位への特異的変異誘発など、標準的変異誘発技術を用いて、調製することができる。
【００５９】
さらなる観点において、さらに本発明は、本発明のインテインを発現できる核酸分子を含む、実質的に純粋な形状で生物を提供する。好ましい例における生物は、組み換え的に生成され、そして大腸菌、及びサッカロミセス種から選択することができる。
【００６０】
DNA配列をコードするインテイン又は断片は、タンパク質のアミノ酸の1部から誘導されるオリゴヌクレオチドを変性するためにハイブリダイズするDNA配列として適切なクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)cDNA又はゲノムDNAライブラリーをスクリニングすることにより得ることができる。適切な変性オリゴヌクレオチドが、標準技術により、設計、合成でき、そしてスクリーニングは、たとえば、Maniatisら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Cold Spring Harbour Laboratories,Cold Spring Harbour,NY(1989),Sambrookらの記載(12)のように行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用い、ゲノムDNA,cDNA又はゲノムDNAライブラリーから核酸プローブを単離することができる。次にこのライブラリースクリーンは、単離されたプローブを用い実現できる。
【００６１】
更なる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００６２】
本発明の特定核酸分子は、以下のヌクレオチド配列を含む、
（配列番号:9）
又は断片又はその変異体を含む。
【００６３】
さらに本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子の相同性又はその変異体をその範囲内に含む。特に考えられることは、対立遺伝子変異体であり、それがたとえ低いパーセンテージ(50%以下）の同一性であっても形成する。ポリヌクレオチド配列が構成され、そして特定領域における同一のヌクレオチドのパーセントが、公的に利用できるコンピュータ・アルゴリズムを用い、別の配列に対し決定することができる。
【００６４】
類似のポリヌクレオチド配列を直線的に構成し、およびそれを同定するための2種の典型的なアルゴリズムは、BLASTN及びFASTAアルゴリズムである。BLASTNソフトウエアは、NCBIアノニイマウス(anonymous)FTPサーバ(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)の/blast/executables/を利用することができる。BLASTNアルゴリズム版2.0.4[Feb-24-1998]により、文書に記載のデフォルトパラメータが設定され、そしてアルゴリズムにより分配され、本発明による変異体の決定に使用することが好ましい。BLASTNを含む、BLASTNファミリーのアルゴリズムを使用することを、NCBI's website,URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlに記載され、Altschul,Stephen F.ら(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database serch programs」、Nucleic Acids Res.25:3389-3402に公開されている。コンピュータ・アルゴリズムFASTAを、インターネットのftp ste ftp:ftp.virginia.edu.pub/fasta/で利用できる。版2.0u4,2月 1996により、文書に記載されるデフォルトとしてのパラメータに設定し、アルゴリズムにより分配される。FASTAアルゴリズムの使用が、W R Pearson and D.J.Lipmanの「Improved Tools for Biological Sequence Analysis,」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988) and W.R.Pearson、「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,」Methods in Enzymology 193:63-98(1990)に記載される。
【００６５】
全ての配列が、上記品質として同定され、その用語「変異体」が明細書に用いられる。
【００６６】
さらに本発明は、少なくとも約35%同一であるインテインをコードするポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60%同一である、好ましくは少なくとも約70%同一である、好ましくは少なくとも約85%同一である、より好ましくは少なくとも約90%同一であり、ならびに配列番号1のインテインヌクレオチド配列に少なくとも約95%,97%,98%又は99%同一の核酸配列を有するこれらのポリヌクレオチドを含む核酸分子又はポリヌクレオチドを含む。本発明のインテインの変異体であるインテインをコードするヌクレオチド配列が、表1に同定されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の47菌株において、最初出願者により配置された(下記参照)。例示的に変異体の配列が図6、及び配列番号：9乃至17に示されている。
【００６７】
本発明のインテイン、インテイン断片、又は核酸分子が、当業者周知の技術により、合成又は組み換え手段により生成することができる。変異体は、標準的な変異生成技術を用いて調製することができるか、又は生体から単離することもできる。
【００６８】
変異体のポリヌクレオチド配列は、一般的に厳密な条件下にてポリヌクレオチド配列にハイブリットすることになる。この用語は、当業者に認識され、そしてManiatisら及びSambrookら；(supra)にて記載されている。本明細書に用いられているように、「厳密な条件」は、6xSSC,0.2%SDSの溶液にて予備洗浄し；6xSSC,0.2%SDSの溶液、65℃にて1昼夜ハイブリダイズし；その後1xSSC,0.1%SDSの溶液、65℃にてそれぞれ30分2回の洗浄、及び0.2xSSC,0.1%SDSの溶液、65℃にてそれぞれ30分2回の洗浄を指している。こうしたハイブリダイズできる配列は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)以外の資源から(他のクリプトコッカス)同等のインテインにコードするものを含む。
【００６９】
合成又は組み換え方式を用いることができるが、しかしながら、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株ATCC32045によりクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子から単離することにより、Cne PRO8配列をクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を得ることは、実際的であり、そしてクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株ATCC32045よりクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8が現段階で好ましい。有意に保守されたmRNAスプライシングタンパク質をコードする宿主遺伝子、PRP8は、スプライゼオソームのコアとして見出された。
【００７０】
一旦得られると、そのインテインが、所望されれば容易に精製される。これは、親和性クロマトグラフィを含む。精製のための他の方法(たとえば、ゲル濾過、又は陰イオン交換クロマトグラフィ)も使用することができる。インテイン又は断片が、融合タンパク質の形状にて生成されると、融合タンパク質の担体部分が、これに関し有益であることがわかった。
【００７１】
さらに望ましいものとして見るならば、技術的に標準の方法を使用して、追加による精製工程を用いることができる。その方法は、インテインの有意に高い純度調製を誘導することができる。好ましくは、インテインの調製には、少なくとも約50重量%のタンパク質、このましくは、少なくとも約80重量%、好ましくは少なくとも約90重量%、及び有意に好ましくは少なくとも約95重量%のタンパク質を含む。
【００７２】
精製方法は、もちろん使用のため必要な純度の程度に依存することになり、その方法にて、インテイン、融合タンパク質又は断片を行う必要がある。
【００７３】
一度得られると、インテイン及び／又はその断片及び／又はその機能的に同等の変異体を、組成物内に形成することができる。たとえばその組成物が、家畜医療、薬理的、又は診断として適用するための治療組成物でよい。これらの目的のためインテインは、純粋か実質的に純粋な形状にて存在することが、一般的に好ましいことである。再度、標準的方法により、こうした組成物を生成が行われる(たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEdition,Mack Publishing(1990)を参照)。
【００７４】
従って本発明のインテイン及びタンパク質及び／又はプライマーは、さらにアッセイ・キットにも含むことができる。インテインに近接した適切なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応が、感染を診断するために使用することができる。さらにキットは、PCRプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、デオキシリボース・トリホスフェート、及び緩衝液を含む。そのアッセイが、実時間PCRによるか、又は適切なサイズの増幅されたDNA結合を検出するアガロース・ゲル電気泳動により行うことができる。PCR産生物が、特定の型又は株を同定するためにDNA配列決定を受けることができる。
【００７５】
さらなる観点において、本発明は、関心のあるタンパク質生成するため、特に関心のあるタンパク質及び本発明のインテインを含む融合タンパク質を産生するための方法を提供する。インテインが、たとえば、所望のタンパク質を精製するために親和性グループと結合して用いることができる。親和性融合に基づくタンパク質の精製が、たとえば、Chongら、(1997b)Gene 192:271-281;Chongら、(1998b)Nucl.Acids Res.26:5109-5115,and WO 01/12820において教示され、引用により明細書に全て組み入れる。インテインの自己切断が起こると、スプライシングよりむしろ所望のタンパク質が、プロテアーセを加える必要もなく放出され、精製を簡単にする。切断は、後期段階のインテインのスプライスをブロックすることによる標準技術方法を使用し、又はスプライシングを完了するに必須アミノ酸の1つにおけるインテイン変異体を使用することにより、行うことができる。たとえば、保守されるN-末端及びC-末端残基を欠失する変異体は、上に記載のとおりである。PRP8インテイン切断の好ましい状態は、VMAインテインなど他のものと異なると考えられ、これらの異なる点が、使用するに有益であろう。
【００７６】
この戦略は、以下のように有益であることを表している。
【００７７】
スプライシング NX-I-CX:ここで、NX及びCXがそれぞれ近接か、遠位のイクステイン、及びIが、本発明のインテインであり、NXCX+Iを形成するためにスプライスする。
【００７８】
切断 NX-I-CX 切断してNXI＋CX
N-及びC-末端フランキング・イクステインが、同じタンパク質からでもよく(cisスプライシング又は切断)、又は違ったタンパク質から(transスプライシング又は切断)でもよい。
【００７９】
1つの例におけるN-及びC-末端近接及び遠位のイクステインが、タンパク質クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8を含む。
【００８０】
別の例におけるN-及びC-末端近接及び遠位のイクステインが、リセプター・タンパク質を含む。
【００８１】
上に記載されておるようにタンパク質又は融合タンパク質が、化学的合成、組み換え又は他の周知の技術により生成することができる。好ましくはタンパク質が、タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸配列、及び/又はDNAを含むベクターを調製することにより、そのベクターにより宿主細胞を形質転換させ、そしてその宿主細胞に核酸/DNAを発現することにより組み替えて的に生成される。記載のようなベクター及び宿主を使用することができる。
【００８２】
作り出されたタンパク質が、標準的な作成技術を用いて上記のように精製することができる。
【００８３】
さらに本発明は、関心のあるタンパク質を精製するための方法を提供する。その方法は、結合タンパク質部分、本発明のインテイン、及びタンパク質の関心のある部分を含む融合ポリペプチドを生成する工程、前記融合ポリペプチドを結合成分に結合させる工程、インテイを切断しやすい状態にする工程、及び所望タンパク質を単離する工程を含む。結合には、融合ポリペプチドの親和性マトリックスへの結合(たとえば、ビーズ、膜、カラム、又はカラム中の材料)が含まれる。単離には、マトリックス(たとえばカラム内容)がpH又は温度移動など化学的又は物理的変化を受け、そして所望タンパク質と溶離することを含む。有益な切断条件は、たとえば引用として本明細書に組み入れられている、WO 01/12820において、技術的に知られている。
【００８４】
タンパク質が、関心のあるタンパク質、インテイン/結合成分融合として合成され、そして結合成分が、カラムにより認識されそしてカラム上にて保持される状況において、1工程による生成法が可能である。たとえば、関心のあるタンパク質が、遠位チキン結合領域によりインテインに融合される場合、トリパーテト・タンパク質が、亜鉛の存在下、キチンカラムに結合することができる。EDTAによりカラムを溶離することにより亜鉛をキレート化し、そしてインテインを関心のあるタンパク質から切断することができる。スプライシング反応を阻害するように、インテインが、修飾することができる。その結果は関心のあるタンパク質が、カラムより溶離されるがインテイン及びキチン結合領域が残っている。3つに分かれた融合及び精製方法を、上のWO 01/12820に記載されている。さらに切断は、上記のように行われる。
【００８５】
１つの例において、関心のあるタンパク質の部位が、レポータ・タンパク質部位である。インテインは、結合タンパク質部位とレポータタンパク質部位、又は関心のあるタンパク質部位を単離することができる。
【００８６】
たとえば、結合部位は、大腸菌又はHis-tagのマルトース結合タンパク質でよい。
【００８７】
したがって、さらなる観点において、さらに本発明は、本発明のインテインを含むタンパク質を提供する。好ましいタンパク質は、N-及びC-末端の近接及び遠位のイクステイン、及び結合タンパク質/インテイン/レポータタンパク質の上に記載されたような融合タンパク質を含む。幾つかの場合におけるタンパク質が、インテインをスプライシング又は切断する前に、生成ざれる前駆タンパク質であることも理解さよう。
【００８８】
さらに本発明は、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、上記の方法により生成することができる。
【００８９】
上に注記されているように、本発明も、微生物に対する抗生物質の活性のための薬剤をスクリーニングにおける適応を有する。この方法において、本発明のインテインは、微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に存在する。微生物は、Candida及びCryptococcusなどの広範囲な微生物病原体、サッカロミセス(Saccharomyces)などの酵母菌、及び大腸菌などのバクテリアから選択しても良い。好ましくは、微生物は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌及びサッカロミセス(Saccharomyces)種から成る群から選択される。大腸菌は、開始スクリーニングを容易にするために特に有益である。スクリーニングするには、静止制限部位を含み、そして本発明のインテインを含む変更されたレポータ遺伝子を含む誘発可能な発現ベクターを調製する必要がある。そのベクターが宿主にて発現される。インテインのうちイクステイン生成物の生成は、インテインの薬剤の存在下検出され、及び／又は測定される。
【００９０】
生成されるイクステインの量が減少すると、インテインが阻害され、そしてその薬剤がインテインに対し阻害活性を有することを示している。このことから、薬剤が、インテインを組み入れた微生物、特に天然の病原体の増殖を阻害できることを、論理的に示唆することができる。試験される薬剤が、種々の濃度で本発明のスクリーニング方法において、用いることができる。この方法において、さらに薬剤も最も有効な濃度を、決定することができる。
【００９１】
より具体的に、本発明は、大腸菌のβ-ガラクトシターゼのα-ペプチドにクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8インテイン(Cne PRP8)のクローニングよるインテン機能を監視するための遺伝子系に関する。これは、従来pUC19などの血漿中にある。β-ガラクトシターゼのアミノ断片をコードする、干渉されないα-ペプチドが、クローニングレポータ遺伝子として開発されてきた。干渉されないα-ペプチド遺伝子が、唯一の炭素資源(最少培地＋ラクトース)、としてラクトースを伴う培地にて(最少培地＋ラクトース）増殖し、Lac+表現型を与えるにめの、β-ガラクトシターゼに欠陥のある大腸菌細胞に相補でも可能である。対照的に配列が、α-ペプチド・コード配列内に挿入されると、これらは、ペプチドの翻訳又は活性に干渉することになる。Cne PRP8インテインの枠融合が、α-ペプチドのイクステインを生成することに成る。バクテリアが搬送すると、この構造が、Lac+であり、これは、α-ペプチド配列が活性であることを示し、この酵素活性が、タンパク質介在配列(インテイン)が、前駆タンパク質から切除されたことを明示する。
【００９２】
好ましくは、そのタンパク質は、CnePRP8である。そのタンパク質が、pUC19内にクローン化されたCnePRP8であるとき、その方法により、pCCne(活性インテイン)及びPRCne(不活性インテイン)のクローンが産生されることになる。
【００９３】
同様に広範囲なレポータ遺伝子/タンパク質が、タンパク質、タンパク質の調製、タンパク質の精製、及び本発明のスクリーニング方法にて用いることができる。好ましいレポータ遺伝子/タンパク質が、in vivo又はin vitroのいずれか、又は両方にて容易にアッセイが可能であり、そしてβ-ガラクトシターゼ、ガラクトキナーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスフェート(酵素アッセイに対して)、β-ラクタマーゼ(抗生物質耐性を与えるレポータ)、オロチック酸デカルボキシラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質を含むが限定されず、レポータが、直接比色分析アッセイに有益である。
【００９４】
使用するにはβ-ガラクトシターゼが、特に好ましい。イクステインの存在が、この酵素を用いて分光光度計アッセイにより容易に測定される。選択肢として、最少培地＋ラクターゼ(lactase)におけるバクテリアの液体増殖アッセイ(混濁度）によりin vivoにおいて、又はペトリプレート上にて(種々の合成ガラクトシドを用いて)、アッセイすることができる。
【００９５】
イクステイン産生物の検出が、、たとえば当業者の周知な、トリプシン消化性ペプチドのアミノ酸配列マッピング、及び質量分光学酵素アッセイ、及び比色法の全てにより、表現型の特徴付け、タンパク質の特徴付けなどの標準的な分析方法により行うことができる。
【００９６】
この方法を使用して理解できるように、前駆体タンパク質が、インテインにより干渉されるイクステインを含めて合成される。次にタンパク質がスプライシングすると、インテインが切除されることになり、そしてエクステインの結合が、インテイン含有タンパク質に干渉されないリーデング・フレームを復帰させる。有意に高く保守された配列が、インテインとエクステインとの結合で見受けられる。Ser(S),Thr(T)又はCys(C)は、N-の終端にて形成するが、His(H)とAsn(N)が、インテインのC-の終端にて形成される。加えてCys,Thr,又はSerのいずれかをインテインのC末端Asnに直ぐに近接する有意に高い保守されたイクステイン残基がある。
【００９７】
これら保守されたアミノ酸の存在が、ゲノム配列におけるインテインの欠失に用いられる。インテインが、遺伝子のコード配列への挿入期として存在し、インテインを欠失する遺伝子と相同に成るべきであり、そのインテインが、特徴となるN-末端及びC-末端のアミノ酸を表示し、そして他のインテインに対してある程度タンパク質配列に相同性になりえる。
【００９８】
本発明は、以下の実験の章において、現段階にて十分に記載され、それが表示目的のみに提供される。
【実施例１】
【００９９】
材料及び方法
宿主：Intstitute of Environmetal Science & Reserch Ltd,Porirua,New Zealandから得られるクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)株Cn 3511(ATCC 32045)。
【０１００】
ホストの培養：菌株 Cn 3511を、YPD培地(1% w/w Dyco 酵母抽出、2%w/v peptone,2%w/wグルコース、必要な場合1.5%w/vアガーにて固形)で２７℃にて増殖。
【０１０１】
DNAの単離：ゲノムDNAを、特にPhilipsonらの方法(7)を介し培養物を1昼夜50mlより単離した。
【０１０２】
インテイン配列及びフランキング・ヌクレオチド領域の増幅を、以下のプライマー(Genset,Singapore):FcnIn,5’gcggaattcCCACATGGTGAATCGACG及びCnInR,5’gctctagaTCATCTGGACTAACCAGCを用いて、最終濃度を1μMで、Expand High Fidelity PCR system(Roche)で行われた。100μlの反応当たり約100ngのゲノムDNAを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のアニール温度を、52℃(1分)、拡張して72℃(2分間)であった。得られた821bpのPCR生成物を、自動的に配列決定をする前にQiagen columnにて精製した。PCR生成物の両株を、ABI 377DNA Sequencerを用いて配列決定した。株Cn3511のためのコンセンサス・インテイン配列を、EditView 1.0.1(Perkin Elmer)を用いて生成した。配列分析には、BCBI(http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)で、the Stanford Cryptococcus neoformans genome sequencing project webstite(http://baggage.stanford.edu/cgimisc/cneoformans/cneo blast.xgi)を介し利用できるBLASTプログラムを用いて行った。複数の配列の位置付けをSeaview(9)で編集しClustal X(8)により作成され、MacBoxshade(http://www.isrec.isb-sib.ch/sib-isrec/boxshade/macBoxshade)にて陰影をつけた。
【０１０３】
インテインの同定
インテイン遺伝子を、クエリー(query)としてC.トロピカリス(tropicalis)インテイン(Ctr VMA)のアミノ酸配列を用いて、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)のアミノ酸配列を用いて、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列データベースのTBLASTN検索を行うことにより、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)において同定した。そのインテイン遺伝子を、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子にて存在した。
【０１０４】
インテイン：PRP8遺伝子及びフランキング配列におけるクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)インテイン配列が、GenBank Accession番号AF349436に割り当てられ、それがInBase records(http://www.neb.com.com/neb/inteins.html)に加えられた。
【０１０５】
結果
ミニ-小インテイン、Cne PRP8を、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子に配置した。図2及び図3を参照すると、Cne PRP8が、システイン残基により特異的に始まり、ヒスチジン-アスパラギン、その直後をセリン残基にて終了する。インテインが、認識可能なエンドヌクレアーゼ領域を含んでいないが、前に同定された酵母核様インテインN-末端及びC-末端の配列と類似している(図4 & 5)。
【０１０６】
516塩基対(図1A)を含むミニ-インテインが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列データベース(株JEC21から生成された)にて同定された。この生成物を用いPCRプライマーを作成し、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、Cn 3511の別の株からCne PRP8及びそのフランキング配列を増幅させた。760塩基対の配列データベースが、Cn 3511から得られ、そこに同じミニ-インテイン核酸分子を同定した(図1B)。
【０１０７】
2種のインテイン核酸配列(Cne PRP-JEC21及びCne PRP8-Cn3511)の概念的な翻訳から、タンパク質スプライシング要素が、あまりに短いため、エンドヌクレアーゼ領域を有する「全長」をコードすることができない。Cne PRP8-Cn3511配列が、クリプトコッカス(Cryptococcus)データベースから誘導されるCne PRP8-JEC21の対応する配列とほぼ正確に一致する。2種の株のDNA配列の間で,3つの基本的相違だけがあり、インテイン配列内の1つだけである。3種の相違の全ては、同定として予測されるPRP8アミノ酸配列に導く3番目の塩基コドン位置に配置される。クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の2種のインテイン配列、Cn3511とJEC21との間では、得られた結果により、DNA配列にて極めて高い同一性(99.8%)があることを示した。
【０１０８】
考察
Cn 3511ポリヌクレオチドによるクリプトコッカス(Cryptococcus) データベースにおけるBLASTNの検索により、1つだけが、contig 7530(クリプトコッカス(Cryptococcus) データベース,1月2001）にて提示の配列と有意に一致することが、示された。クリプトコッカス(Cryptococcus)ゲノム配列データが、まだ完成していないが、これは、JEC21というハプロイド・ゲノムに存在するインテインのおそらく単一複製だけであることを示唆している。これは、クリプトコッカス(Cryptococcus)ゲノムにおいて、おそらく非対立遺伝子版のインテインが何処にもないことを示している。
【０１０９】
クエリー(query)としてクリプトコッカス(Cryptococcus) データベースからコンテグ(contig)7530にて、GenBankデータベースのBLASTX検索により、Homo sapiens,Trypanosoma brucei,Arabidopsis thaliana and Schizosaccharomyces pombe(示されていない)を含む幾つかの種のPRP8に、有意的に極めて高く(E=0)一致していることが、見出された。しかしながら、これらの一致には、インテインを含む(図3) クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列の領域が含まれていない。3種の酵母種、Candida albicans,S.cerevisiae及びS.pombeには利用できるPRP8遺伝子配列のうち、これらPRP8の相同体(データが示されていない)にインテインを有することが、全く見受けられない。GenBankデータベースでは、PRP8の相同性を記載した(たとえば、Trichomonas,Giardia,Guillardia,Plasmodium,Mus及び図3に一覧記載の関係微生物)他の真核種から広範囲にわたる有意に高い類似配列を伝達する。これらのPRP8相同体では、インテインを含むことが全く見られない。Cne PRP8インテインのコード配列が、PRP8遺伝子産生物に存在し、スプライシング(10)に関与するという事実が、核内に配置されていることを示唆する。このように、Cne PRP8が、同定されるべき、第二の、非対立性で、真核性の核様インテイン遺伝子である。Cne PRP8が、PRP8遺伝子のいずれかにて検出される最初のインテインである。さらにCne PRP8が、Basidiomyceteにおいて見出される第一のインテインでもある。そのインテインが、さらなる機能としてすなわちタンパク質のスプライシングができるという機能が、ほぼ確かめられている。それが、自動触媒的に取り除くことが出来ないならば、得られた欠陥のあるPRP8遺伝子産生物は、不活性であることがほぼ確かめることができ、その結果クリプトコッカス(Cryptococcus)においては、前-mRNA(致死の状態)を処理できなくなっている。
【０１１０】
クエリー(query)としてCne PRP8インテイン・タンパク質配列を用いるIｎBase(http://vent.neb.com)でのBLAST検索により、E-値が0.1より少ないところにて、７つ一致することを見出した。GenBankによる検索の場合、最も有意なE-値は、C.tropicalis及びS.cerevisiaeの対立遺伝子VMAインテインによるものである。3種の古細菌(archaeans),Thermococcus aggregans,T.fumicolans及びPyrococcus kodakaraenisisのDNAポリメラーゼ(アルファ・ファミリー)遺伝子のインテインが、最初Cne PRP8の約50アミノ酸に一致(それぞれがE=0.0008,E=0.016,E=0.067)し、加えて内部にある50アミノ酸配列に対し有意に一致することが少ないことを示した。3種の古細菌すべては、エンドヌクレアーゼ領域を含み、そして相同性のあるアルファ・ファミリーのDNAポリメラーゼにミニ-インテインがないのが明らかである(Pietrokovski,S.,http://bioinfor.weizmann.ac.il/〜pietro/inteins/)。
【０１１１】
クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)インテイン(図2)のアミノ酸配列によるGenBankでのBLAST検索により、Ctr VMA及びSce VMAの最初の50残基に有意に一致することを表す(それぞれE=1e-04,E=2e-04)。さらに実験により、おそらくCne PRP8の保守された自己スプライシング機能(図4及び5）を反映して、Cne PRP8,Ctr VMA及びSce VMAインテインは、両端が類似する領域を共有することが、示された。Cne PRP8が、172のアミノ酸だけであり、それは、S.cerevisiae及びC.tropicalis VMAインテインより実質的に短い。これは、Cne PRP8が、他の酵母菌の核様インテインに見出されるエンドヌクレアーゼ領域を欠失しているからである。
【０１１２】
エンドヌクレアーゼ領域をコードする全長のインテイン(示されていない)をクリプトコッカス(Cryptococcus)に存在することには、いまだ明確ではない。さらに多くの細菌、古細菌、及びプラスミドも、明らかにエンドヌクレアーゼを欠失している。全てのインテインのうち約18%を占めているこれらのミニ-インテインが、有意に大きいインテインの欠陥性にある版を表すことができる。誘導体としてのミニ-インテインが、さらにスプライスすることができるが、もはや新たな部位を拡張することができない。選択肢として、ミニ-インテインが、エンドヌクレアーゼにより侵食される前にインテインの前駆形状を表すことができる(Pietrokovski,http://bioinfo.Weizmann.ac.il/〜pietro/inreins/)。
【実施例２】
【０１１３】
菌株
薬剤の標的としてインテインを使用する戦略は、インテインが大部分に存在するが全菌株に存在しない場合のみ有効となろう。インテインをフランキングするPRP8の配列が、有意に保守され、そのためプライマーの設計及びPCRの増幅のため、保守される鋳型が表される(Butler MI,Goodwin TJ,Pooulter RT,(2001)A nuclear-encoded intein in the fungal pathogen Cryptococcus neoformans.Yeast.18(15):1365-70)。
【０１１４】
試験された47の株からクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を増幅し(see Table 1below PHLS stands for Public Health Laboratory Service.IUM stand for Istituto di Igiene e Medicina Preventiva,Universita degli Studi,IRCCS Milan)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)株全てが、インテインを運ぶことを示唆している。これらの配列は、クリプトコッカス(Cryptococcus)のPRP8遺伝子の保守された配列に挿入されるように検出された。有機物の他、この遺伝子(PRP8)にインテインをコードするする配列を含むことは、記載されていない。増幅された配列が、アガロース・ゲル上にて評価されるような特徴的サイズ(〜820bp)から構成される。
【０１１５】
イタリアにおいて元から単離された血清型Aの10株、及び血清型Dの10株からインテインを増幅した。加えて、タイ、ウガンダ及び英国からの12を臨床的に単離し全て生成されたインテイン配列を有し；全てが、血清型に最もよく似にそれは、AIDS患者に極めて顕著な株による。さらに4種のC.neoformans var.neoformans strainsが、オーストラリアにて単離したばかりか、Weiland Meyer博士(Westmead Hospital in Sydney)からクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans) var.gattii(又は株全てがクリプトコッカス・バシリスポラス(Cryptococcus・bacillisporus))の単離したものが、最近受けられた。これらのC.n.var.gattiiga、血清型B及びC株であり、それは免疫応答宿主の疾患の要因となる。C.n.var.gattiiの8株全てが、PRP8遺伝子におけるインテインコード配列を有することが、示された。C.n.var.gattiiのインテイン・コード配列を十分に配列されたものとなった。
【０１１６】
配列の分析によりPRP8にこれらインテインをコードする挿入物とするサブセット(15)が、さらに特徴付けられた。公共のデータベース:株JEC21/血清型 D:http://www-http://cneo.genetics.duke.edu/、の利用できる配列データによるこれらのデータが組み入れられた。
【０１１７】
血清型A(AIDS患者の顕著な型)と血清型株との間のインテイン・コードDNA配列の持続する違い、及びこれらと十分に配列された1種のC.var.gattii株とのさらなる相違があった。この変異が、他の配列において、特にイントロンにおけるより配列の幾つかの領域でより明らかである。
【０１１８】
増幅されたPCR産生物からの配列の概念的な翻訳(conceptual translation)により、これらが、~52塩基対のイントロンによりPRP8遺伝子の領域を表し、加えて挿入が他のPRP8遺伝子に見出されないことが、確認された。この特徴的挿入は、インテインコード配列である。オープン・リーデング・フレーム(PRP8遺伝子と同じフレームにおいて)、及びインテインの特徴である保守された残基が含まれる(図１a,1b及び2)。
【０１１９】
当方が、DNAとタンパク質配列の両方の代表的例を構成した(図6及び7)。多様な株からの概念的翻訳は、いくつかの変異体が明らかであるが、保守された配列のインテインを示している。その変異化が、幾つかの株においてより自明性がある。その変異化が、幾つかの領域において、特に内部領域においてもより自明性がある。しかしながら、タンパク質の全てが、予測的に活性なインテインをコードすると見られる。DNAレベルでの変異化が提示されることにより、インテインとPRP8内の両方の3番目のコドン位置で変化することが、ほとんど制限される。PRP8遺伝子のイントロンに付加的な多くの相違がある。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【実施例３】
【０１２２】
CnePRP8インテインのフレーム融合において、切断及び結合による発現プラスミドpＵＣ19(AmpR)により搬送される「αペプチド・イクステイン」にて行われた。インテインDNAが、ポリメラーゼ連鎖反応により生成され、pUC DNAが、New England Biolabs,USAから商業的に得られた。これらの構造が、アンピシリン選択性培地上、大腸菌(DH5 Lac-)内にて形質転換された。形質転換された細胞は、これらがアンピシルン耐性を必要とするため、この培地上にて増殖することができた。プラスミドをこれらの培養物から単離し、そして配列決定した。これらが、プラスミドpCCNeを搬送し、プラスミドpCCNeのインテイン配列が、予測されるフレーム内の配置におけるUC19の意図された部位に挿入されることが、確認された。PCCneコロニーが、X-galの存在下青色であり、そしてラクトースが唯一の炭素源であると、増殖することができた。
【０１２３】
Sambrookら、(Sambrook,J.,MacCallum,P.,David R.(2000)Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Thid edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press)によれば、CnePRP8のこのサイズを挿入することにより、β-ガラクトシターゼ活性のαペプチド相補性を阻害することになろう。pCCneを含む細菌内の本酵素活性により、タンパク質配列(上記インテイン)を介在することが、機能的α-ペプチドを残している前駆タンパク質から削除されていたことが示された。これは、インテインが、このバクテリア宿主、及びαペプチド・コード配列の本部位で活性であることを明示した。インテイン機能がブロックされた場合、その培養物が、X-gal上に白色にて増殖し、そして最少培地＋ラクトース上にて増殖することが出来ない。
【０１２４】
同様に修飾されたpRCne CnePRP8 インテインのフレーム内の融合が、切断及び結合による発現プラスミドpUC19(AmpR)により搬送される「α-ペプチド・イクステイン」にて行われた。インテインDNAを、1つのプライマーが変更されるポリメラーゼ連鎖反応により生成された。得られた配列は、インテインのN-末端にて必須のシステインの換わりにアルギニンをコードした。その構造は、アンピシリン選択培地上、大腸菌DH5 Lac-)内に切断及び結合ならびに形質転換により生成された。形質転換された細胞は、これらがアンピシリン耐性を必要とすることから、本培地にて増殖することができた。プラスミドをこれらの培養物から単離し、そして配列決定した。これらが、変異体インテイン配列が、予測されるフレーム内の構成の意図された部位において、pUC19内に挿入されていたプラスミドpRCNeを搬送した。ｐRCneコロニーが、X-galの存在下で白色で、そしてラクトースが唯一炭素源である時、増殖することができなかった。
【０１２５】
ｐRCneを含むバクテイアにこの酵素活性が欠失すると、前駆タンパク質から削除することができず、その結果非機能的α-ペプチドとなる。pPRneの形質転換された株の動きは、インテインが薬剤によりブロック/阻害された株内に生ずるであろう動きを刺激する。
【実施例４】
【０１２６】
インテイン・ペプチドレポータ構造を、薬剤の在る場合とない場合にて、薬剤(通常試験されるべき薬剤)の濃度を1種か種々変えて増殖させることができ、そしてこれらの現象型が、異なる薬剤の濃度で得点される。薬剤は、たとえば亜鉛の塩であろう。Mill及びPaulus(2001,Reversible inhibition of protein splicing by zinc ion.J.Biol Chem.276(14):10832-8)が、Vitro系において最近開発された利点を取っており、そこにタンパク質スプライシングが、トランスに(trans)(異なるタンパク質からN-及びC-イクステイン)発生し、タンパク質・スプライシング阻害剤として評価し、低濃度の亜鉛(Zn(2+))が、Mycobacterium tuberculosisからRecAインテインにより、とSynechocystis sp.から天然のsplit DnaE インテインにより介在されるスプライシングを阻害することを発見した。PCC6803では、90%の阻害が、0.2mMの亜鉛(6部/ミリオン)という比較的低濃度でおこなわれた。Vivoにおいて亜鉛の塩により処理したインテインの阻害化は、一連のブロス内にpCCneを搬送するDH5aを、そして別の一連のブロス内にpCCneを搬送するコントロールDH5aを接種することにより、試験することができよう。亜鉛の塩を、種々の濃度にて(0/0.2/2/20mM)ブロスに付加することができる。DH5a/pCCne培養物の増殖が、DH5a/pUC19培養物を阻害することの出来ない亜鉛濃度にて阻害されるなら、インテインの阻害化は、類推されるであろう。
【０１２７】
工業的適用
インテインが、利用できる配列データが極めて大きな量であるにもかかわらず、いずれの哺乳動物の遺伝子からも知られていない。したがって、同定されるインテインが、重篤な微生物の感染の治療に関して強力な分子標的である。インテインの機能に影響を与える標的薬剤を投与することにより(すなわち、インテイン・スプライシング阻害剤又はアンタゴニスト)、患者に有害な副活性を生ずることなく、微生物の病原体の増殖を停止させることになろう(6)。インテインタンパク質の阻害化の概念が、多くの点で、HIV/AIDS患者に投与される薬剤形態としての、アスパラギン・プロテアーゼ阻害剤と類似している。
【０１２８】
クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)が、ヒトの主用な酵母業病原体の1つである。治療できず、早い致死性、感染を起こすことができ、そして全域的なAIDS/ヒト免疫不全ウイルス感染と関係する顕著な2次病原体として、とくに重要になってきている。最も共通的な臨床的状況としては、慢性的髄膜炎であり、それが皮膚や肺を冒すことを伴ってくる。
【０１２９】
Cne PRP8は、同定されるべき唯一の二次(非対立遺伝子)真核生物核様インテインである。この酵母核様インテインが、初期真核生物の部生物から古細菌組成物のゲノムに存在するインテインから誘導することができる。さらにそれが、Ascomycete酵母からVMAインテインなど他のインテインに対し非常に遠位であり、そのため、薬剤及びアンタゴニストを阻害するための明確な感受性を有する。
【０１３０】
PRP8遺伝子産生物が、スプライセソーム(spliceosome)のコアを含む、周知の極めて有意に保守されたタンパク質の1つである(11)。PRP8遺伝子産生物が、スプライセソーム(spliceosome)の必須の組成物であり、したがって細胞の変動に必須である。PRP8遺伝子機能を失うと、全てのmRNA転写物からイントロンを処理できなくなる結果となろう。PRP8遺伝子が、迅速な増殖中極めて大量に必要となる。あらゆるメッセージにおけるあらゆるイントロンを、mRNAが活性化できる前に除去しなければならない。対照的に定常相において、新しいmRNAのために最少の必要性があり、したがって新しいPRP8には最少の必要性がある。そのため、PRP8産生物が、必須の制御点を表している。したがって、インテインCne PRP8が、医薬分野において多くの用途を有する。特に本インテインが、治療的に干渉するための分子標的としての価値を有す。
【０１３１】
たとえば、本発明のインテイン又は断片を、部生物の感染、特にAIDSを有するか又はHIVに感染した患者のクリプトコッカル(Cryptococcal)の感染を治療するために有益である抗インテイン薬剤(阻害剤又はアンタゴニスト)を選択するための薬剤スクリーニング・プログラマーにて使用することができる。インテイン阻害活性を有する薬剤をスクイーニングするための適切な方法は、上記そして米国特許5,795,731に教示されている(6)。エンドヌクレアーゼ領域を欠いているが、保守された配列を有するCne PRP8-Cn3511など最少タンパク質スプライシング要素が、各終端部をブロックし、及び／又はCne PRP8から誘導されるポリペプチドも、医薬剤の調製において、及び／又は治療薬剤の開発において、有益でもある。たとえば、その薬剤が、前駆タンパク質からインテインのタンパク質分解による切断及び／又はスプライシングを阻害するならば、活性なPRP8遺伝子産生物が全く形成されないであろう。インテインの構造が、酵母インテインSceVMAの構造を含めて十分に特徴付けられる。さらにインテインの活性モードが、分子レベルで十分に理解される。従ってこの系が、適切な阻害アンタゴニスト又は阻害剤を開発するためには適切である。
【０１３２】
当業者が、上の記載により、図示による方法だけが提供され、そして本発明がそれに限定されないことが、理解されよう。
【０１３３】
文献
1. Perler,F.B.Davis,E.O.,Dean,G.E.,Gimble,F.S.,Jack,W.E.,Neff,N.,Noren,C.J.Thorner,J.,and Belfort,M.(1994)Protein solicing elements:inteins and exteins-a definition of terms and recommended nomenclature.Nucleic Acids Res.,22,1125-1127.
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10. Beggs,J.D.,Tiegelkamp,S.and Newman,A.J.(1995)The role of PRP8 protein in nuclear pre-mRNA splicing in yeast.J.Cell Sci.Suppl.,19,101-5.
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12. Sambrook,J.,MacCallum,P.,David R.(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Third edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press All references in this listing are in the text are incorporated herein by reference.
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
本発明は、上に広く明記されているが、さらにそれは、以下記載記載による例を提供する実施例を含む。特に本発明の十分な理解が、以下の添付する図面を引用することにより得られると考える。
【０１３５】
図1は、Cne PRP8として本明細書にて同定されたインテインをコードするポリヌクレオチドである。配列が、イクステインをコードする配列に相当する一部の配列により近接されている。下線にて示されるインテイン・コード領域領域が、塩基142で始まり、そして包括的に657,516塩基対にて終了する。
【図１Ａ】図1Aは、株JEC21から同定された配列である。
【図１Ｂ】図1Bは、CN3511から同定される配列である。上記配列が、塩基対84、129及び147(太線)の３つの位置で異なる。
【図２】図2は、PRP8タンパク質前駆体(3511から)の配列の一部である。アミノ酸は配列は、図1B記載のDNA配列を翻訳したものである。上記インテイン配列は、下線が引かれている。インテインの広い範囲における有意に変換される残基が、＊の記号にて注記されている。さらにインテイン直後の残基(C末端イクステインにおいて)が、有意に保守され、そして#にて表示される。そのインテインが、残基48(C)ではじまり、残基219(N)で終了する全体として172のアミノ酸である。
【図３】図3は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)のPRP8のは配列とクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列(インテインに対応)における枠内への挿入を示す他の関連生物のPRP8配列との間の1部同一する比較である。これは、Cで始まりNで終了し、そしてアミノ酸の長さが172である。PRP8配列としてGenBank accession数は、以下のようである。A.thaliana,AAD55467;C.elegans,AAA27977;D.melanogaster,AAF58573;H.sapiens,AAC61776;S.cerevisiae,AAB68011;S.pombe,CAB11062である。挿入が、他の生物に、特にヒトに見出されない。
【図４】図４は、C.tropicalis及びS.cerevisaeのVMAインテインのN-末端と共にCne PRP8のN-末端の配置である。完全に保守された残基(最も暗く陰影されている)は、触媒として必須のN-末端のシステイン(C)を含む。
【図５】図5は、C.tropicalis及びS.cerevisaeのVMAインテインのC-末端と共にCne PRP8のN-末端の配置である。完全に保守された残基(最も暗く陰影されている)は、触媒として必須のC-末端のHNモチフを含む。
【図６】図6は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)種からCne PRP8のインテインをコードする配列を複数のDNA配列に位置付けする。
【図７】図7は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)種からCne PRP8のインテインをコードする配列の複数アミノ酸を位置付けする。
【０００１】
本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)にて同定された新たなインテインに関する。上記インテインが、微生物機能を阻害すべき薬剤を試験する分子標的として有益である。
【０００２】
インテインとは、前駆タンパク質配列内の枠内に包埋され、及びタンパク質の成熟中(1)切除される、可動なタンパク質スプライシング要素である。インテインは、種やタンパク質類にわたって散発的に分布している。これらは、生命分類として3種の界全てに形成しているが、比較的少ない種に見出されている。異なる生物からの相同タンパク質内の同じ位置に存在するインテインが、「対立」インテイン(2)と呼ばれる。21だけの対立インテインが、14タンパク質から記載されている。大部分のインテインは、古細菌及び細菌に見出されたが、真核生物にほとんど見出せず、そしてヒトなど高級真核生物において見出されなかった。
【０００３】
大部分のインテインは、エンドヌクレアーゼのドメインを有する。エンドヌクレアーゼのドメインを欠いているインテインも同定されている。これら「ミニ・インテイン」の占める割合は、全てのインテインのうち20%に満ず、さらにスプライスされ得るが、新たな部位に拡散することができない。
【０００４】
今日まで、4種の非対立インテインが、真核細胞の微生物に関し記載されている。ポルフィラ・パプレア(Porphyra purpurea(レッド藻類))及びグウラデア・テタ(クリプトモナド(Guillardia theta(cryptomonad藻類))色素体は、これらのNDA Bヘリカーゼ遺伝子における対立遺伝子のミニインテイン遺伝子を有する。緑色藻類クラミドモナス・エウガメトス(Chlamydomonas eugametos)は、クロロプラスト clp-A遺伝子内のDODエンドヌクレアーゼを含むインテイン遺伝子を有する。キロ・イリデセント(Chilo iridescent)ウイルスのリボヌクレオチド・リダクターゼ・クラス1遺伝子にインテインがある。対立遺伝子のインテインが、バチルス・スブチルスのプロファージ(スプベタ(Spbeta))と相同の遺伝子である。前記の核様真核細胞のインテイン遺伝子だけが、サッカロマイセス・セレビサ(Saccharomyces cerevisae(Sce VMA;3))及びカンジタ・トロピカリス(Candida tropicalis(Ctr VMa;4)の空胞性ATP(VMA)遺伝子に存在する。Sce VMA及びCtr VMAの対立遺伝子インテインが類似する長さ(それぞれ454と471のアミノ酸)で、37%相同である。共に、スプライシング・ドメインに加えてエンドヌクレアーゼドメインを有す。Sce VMAのエンドヌクレアーゼにより、減数分裂中のインテインのないVMA遺伝子に占有されていない標的部位が切断されることが示され、そして、前に占有されていない対立遺伝子にインテイン遺伝子を「ホーミング(homing)」することになる(5)。
【０００５】
インテインは、極めて有望な抗微生物標的(引用により本明細書に組み入れられている米国特許第5,795,731)として同定されてきた。標的として有益であるためには、インテインが、標的とされる微生物のほとんどの菌株、又は全ての菌株の存在し、そして有意な病原に関係する微生物に存在する必要がある。さらに真核生物のインテインが、これらの群がまだあまり特徴付けされていないことから、特に有益である。
【０００６】
したがって、本発明の目的では、少なくとも幾つかの方法でこれらの要件を満たすような、又は公共に対し少なくとも有益な選択を提供するインテインが提供される。
【０００７】
現段階で発明者は、予想外にも広い範囲のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)に存在する新規の真核性インテインを同定した。本発明が広く対象とするのは、このインテイン(Cne PRP8)に対してである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って第一の観点において、本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から得ることが出来るCne PRP8として同定されたインテイン、又はそれと機能的に同等の、又は機能的に変更されたその断片又は変異体を提供する。
【０００９】
好ましくは、インテインを、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド,米国アクセス番号ATCC 32045に寄託のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn35から単離することができる。
【００１０】
従来、インテインは、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8から得ることができる。
【００１１】
好ましい観点において、インテインは、配列番号：1,2,3,4,5,6,7及び8から成る群から選択されるアミノ酸を含む。
【００１２】
好ましくは、上記インテインは、配列番号：1記載のアミノ酸配列を有するか、又は機能的に同等の変異体又はその断片である。
【００１３】
さらに本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)以外の微生物から得ることができるインテイン、及び本発明のインテインに機能的に同等の又は機能的に変更された変異体又は断片を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、配列番号:1の配列と約35%より多く、好ましくは約50%より多くにて同一で、配列番号:1の配列と好ましくは約60%より多く、より好ましくは約70%より多く、より好ましくは約80%より多く、より好ましくは約90%より多く、及びさらに好ましくは約95%より多くにて同一である、アミノ酸配列を有する単離されたインテインが提供される。
【００１５】
さらなる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１６】
さらに本発明は、アクセス番号ATCC32045下、米国、メリーランドにおけるアメリカンタイプ・カルチャー・コレクションに寄託した、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn 3511のゲノムの1部であるインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
さらなる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする図1Bに記載されている塩基142から塩基657の約516の核酸を含む単離された核酸分子、又はその断片又は変異体を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、配列番号：9,10,11,12,13,14,15,16及び17から成る群から選択されるコード配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
核酸分子は、RNA又はcDNAで可能であるが、好ましくはDNA分子である。
【００２０】
さらに、本発明は、上に明示されたように本発明の核酸分子、あるいはその断片又はその変異体を含むベクター又は構造を提供する。
【００２１】
さらに本発明のベクターにより形質転換され、そして本発明のインテインを発現できるホストが提供される。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の核酸分子を含み且つ本発明のインテインを発現できる実質的に純粋な形状な生物を含む。
【００２３】
さらに別の観点において、本発明は、Cne PRP8インテイン又は医薬に使用するインテイン構造体を提供する。
【００２４】
好ましくはその使用は、抗微生物活性のため薬剤を試験する標的としてである。
【００２５】
さらに本発明は、本発明のインテインを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる観点における本発明は、本発明のインテインを含むタンパク質を提供する。
【００２７】
1つの例において、そのタンパク質は、N-及びC-末端のイクステインによりフランク(flank)された本発明のインテインを含む。
【００２８】
好ましくは、N-及びC-末端のイクステインは、両方がレポータ・タンパク質を形成する近接及び遠位のイクステインを含む。
【００２９】
別の例において、そのタンパク質は、タンパク質の結合部位、本発明のインテイン、及びレポータ・タンパク質部位を含む。
【００３０】
レポータ・タンパク質は、酵素アッセイのタンパク質、抗生物質に耐性を与えるタンパク質、比色定量アッセイに直接提供するタンパク質、又はin vivo活性によりアッセイ可能なタンパク質、から選択することができる。
【００３１】
好ましくは、レポータタンパク質は、チミジレートシンターゼ、β-ガラクトシターゼ、オロテック酸デカルボキシラーゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリ・ホスホターゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質から成る群から選択される。
【００３２】
さらなる観点において、本発明は、タンパク質を生成する方法を提供し、その方法は、本発明のインテインを含むタンパク質を切断状態になりやすいようにすることを含む。
【００３３】
1つの例において、そのタンパク質は、融合タンパク質である。
【００３４】
さらに本発明は、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、微生物に抗生物質活性のための薬剤をスクリーニングする方法を提供し、前記微生物が、その微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子において本発明のインテインを有し、前記方法が前記インテインの阻害を検出することを含む、
(a)(i)レポータ遺伝子内に静止した制限部位を含む変更されたレポータ遺伝子、及び(ii)前記インテインを含む誘発可能な発現ベクターの組み換えクローンを調製する工程；
(b)前記薬剤の存在下前記組み換えクローンにより前記インテインのエックステイン生成物の生成を検出する工程；
を含み、
ここで前記イクステイン生成物の生成が減少すると、前記インテインの阻害、および前記微生物に前記薬剤の抗生物質の活性が明示される。
【００３６】
さらなる観点において、本発明が、微生物に抗生物質活性に対し薬剤をスクリーニングする方法を提供し、前記微生物が、その微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に、本発明のインテインを有し、その方法がインテイン機能を監視することにより、前記インテインの阻害を検出することを含む、
(a)変更されたレポータ遺伝子となるレポータ遺伝子内に静止した制限部位を生成する工程；
(b)誘発可能な発現ベクターに前記変更されたレポータ遺伝子をクローニングする工程；
(c)組み換えクローンを生成するため、前記変更されたレポータ遺伝子を含む前記誘発可能な発現ベクターに前記変更されたレポータ遺伝子をクローニングする工程；そして
(d)前記薬剤の存在下、前記組み換えクローンにより、前記インテインのイクステイン産生物の生成を検出する工程；
を含む前記方法で、
ここで、前記イクステイン生成物の生成が減少すると、前記インテインの阻害、および前記微生物に対し前記薬剤の抗生物質の活性が明示される。
【００３７】
これらの方法において、さらにインテインが、システイン、セリン及びトレオニンから選択される付加的に保守される遠位のアミノ酸残基を含む。
【００３８】
微生物が、広範囲な微生物病原体、酵母及びバクテリアから選択することができる。好ましくは、微生物が、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌、及びサッカロミセス(Saccharomyces)種から成る群から選択される。
【００３９】
好ましくは、タンパク質はCnePRP8である。
【００４０】
好ましいレポータ遺伝子が、β-ガラクトシターゼAで、好ましい誘発可能な発現ベクターがpUC19である。
【００４１】
イクステイン生成物の検出は、従来より表現型特徴付けにて行われる。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
広く上記要約のように、本発明の一つの観点において、新規インテインが提供される。
【００４３】
Cne PRP8として同定されたインテインが、図2(塩基対48から219)、及び配列番号:1に記載のアミノ酸を含む。従来Cne PRP8は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から得る事ができる。基本的に同等の変異体も考えられる。現在まで、機能的に同等の変異体が、47クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans) 菌株より同定され、そのインテインが、広く複数の種にわたっていることを示している。従来本発明のインテインは、米国メリーランド州、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクションに寄託された、寄託番号ATCC32045のクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から、得ることができる。
【００４４】
Cne PRP8は、担子菌網から誘導される第一のインテイン、及び同定された第二の(非対立遺伝子)真核性の核様インテインだけである。Cne PRP18は、「ミニ-インテイン」であると考える。
【００４５】
本発明のインテインは、全体のアミノ酸配列を含むことができるか又はこうした部分が活性断片を構成する配列の部分だけを含むことができる。さらにインテインに末端の保守残基を含む拡張されたインテインが、提供される。インテインに対し直ぐ後の保守された残基が、システイン、セリン及びトレオニンから成る群から選択することができる。
【００４６】
本発明に使用する1つの核酸されたインテインが、アミノ酸配列を有する：
【００４７】
「機能的に同等の変異体」という語句は、実質的に同等の機能性を保持し、タンパク質のアミノ酸を変更できると認められる。たとえば同等のペプチドが、免疫的な交差反応であり、そして少なくとも源のインテインと実質的に同等の機能を有する場合、タンパク質が、特定機能に別のタンパク質と機能的に同等であると考えることができる。
【００４８】
さらに機能的に変更された変異体が考えられる。有意に保守された配列が、インテインとイクステインが結びついていると見られることが、当業者に理解されるであろう(InBase http://www.ineb.com/inteinsを参照)。セリン(S)、トレオニン(T)、又はシステイン(C)は、インテインのN-末端に、一方ヒスチジン(H)、及びアスパラギン(N)は、一方又は両方のインテインのC末端に生成する。これらアミノ酸残基の変異化又は欠失によりインテイン機能を変更させ、インテイン-イクステイン接合部に切断が形成され、又はスプライシング又は切断のできないインテインを得ることが、技術的に認識される(Chongら、(1998b)J.Biol.Chem.273:10567-10577and WO 01/12820を参照)。本明細書に使用される「機能的に変更される」という用語は、こうした全てのインテインを含む。
【００４９】
機能的に同等、又は変更されたタンパク質が、源と同じサイズである必要がない。たとえば、同等又は変更されたタンパク質が、たとえば、タンパク質の断片、別のタンパク質又は担体によるタンパク質との融合、付加的アミノ酸による断片を融合することができる、全長あるCne PRP8の1又は複数のアミノ酸残基の欠失による得ることができる。さらにアミノ酸の配列にて、従来の技術を用いて同等のアミノ酸と置換することが可能である。同等に成るようの保持されるアミノ酸の群は、
(a) Ala,Ser,Thr,Pro,Gly;
(b) Asn,Asp,Glu,Gln;
(c) His,Arg,Lys;
(d) Met,Leu,Ile,Val;及び
(e) Phe,Tyr,Trp.
たとえば、その同等物が、たとえば165から171のアミノ酸、置換、付加、又は欠失されたインテインの変異体、あるいはタンパク質の融合、又は他のアミノ酸による断片又は変異体を含む、インテインの断片でも可能である。
【００５０】
ポリペプチド配列が、配置され、そして特異的領域にて同定されるアミノ酸の割合は、公的に利用可能なコンピュータ・アルゴリスムを用いて他の配列に対し決定することができる。ポリペプチド配列の類似性が、BLASTPのアルゴリスムを用いて試験することができる。BLASTPソフトウエアは、NCBI anonymous FTP server(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)under /blast/exectablrs/にて利用できる。BLASTPを含むBLASTファミリーのアルゴリズムが、NCBIのウェブサイトの、URLのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlにて、そしてAltschul,Stephen Fら、(1997),「Gapped Blast and PSI-BLAST:a new generation of protein database seach programs」、Nucleic Acids Res.25:3389-34023か、記載されている。
【００５１】
したがってさらなる観点において、さらに本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)から単離できるインテインを提供し、それは、図2に示されるアミノ酸配列内から1又は複数の活性ペプチドを含む。
【００５２】
同定された本発明の特異的小インテインは、以下のアミノ酸配列を有す：
CLQNGTRLLRADG
SEVLVEDVQEGDQLLGPDGT
SRTASKIVRGEERLYRIKTH
EGLEDLVCTHNHILSMYKER
SGSERAHSPSADLDLTDSHE
RVDVTVDDFVRLPQQEQQKY
QLFRSTASVRHERPSTSKLD
TTLLRINSIELEDEPTKWSG
FVVDKDSLYLRHDYLVLHN
(配列番号：１）
又は機能的に同等の変異体又はその断片。
【００５３】
さらに本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列を有するポリペプチドと本発明のインテインと約35%同一、好ましくは約50%同一、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有する相同性ポリペプチド、およびインテインに対し、好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
インテインの活性な断片と他の変異体と共に本発明のインテインは、合成又は組み換え手段により生成することができる。約100より有意に少ないアミノ酸を有し、そして一般的に50%より有意に少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドが、当業者に周知な技術により生成することができる。たとえば、こうしたペプチドが、メリーフイルド(Merryfirld)固相合成法などのいずれか商業的に利用できる固相技術を用いて、生成することができ、ここでアミノ酸は直線的に加えられて、アミノ酸鎖として増殖する(Merryfield,J.Am.Chem.Soc 85:2146-2149(1963)を参照)。ペプチドの自動合成のための装置は、Perkin Elmer/Applied Biosystems,Incなどの供給者から商業的に利用可能で、製造指示により操作することができる。
【００５５】
断片は、十分な長さのインテインの1又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより得ることができる。これは、インテインのN-又はC-末端から、又はインテインの内から順次欠失することにより可能である。
【００５６】
さらに本発明のインテイン、あるいはその断片又は変異体が、発現ベクターにそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド(通常DNA)配列を挿入し、そして適切な宿主内にそのタンパク質を発現することにより、組み換え的に生成することができる。当業者に知られた種々の発現ベクターのいずれかが用いられ、そしてプラスミド、プラスミドを用いるpUC及びpET、特にpUC19を含む。
【００５７】
発現は、組み換えタンパク質をコードするDNA分子を含む発現ベクターにより形質転換されていたか、又はトランスフェクトされていたという適切な宿主細胞にて行われる。適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、及び有意に高い真核細胞が含まれる。好ましくは、用いられる宿主細胞には、バキュロウイルス発現ベクターを用いて大腸菌、酵母又は、COS又はCHOなどの哺乳動物の細胞株、又は、SF9などの昆虫の細胞株がある。大腸菌、及びサッカロミセス種が、特に好ましい。クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)及び他のクリプトコッカス種も宿主細胞として使用することができる。この方法にて発現されるDNA配列は、天然のオカーリングインテイン(occurringintein)、天然のオカーリングインテイン(occurringintein)タンパク質の断片又はその変異体をコードすることができる。
【００５８】
さらにインテインの変異体は、オリゴヌクレオチド対象部位への特異的変異誘発など、標準的変異誘発技術を用いて、調製することができる。
【００５９】
さらなる観点において、さらに本発明は、本発明のインテインを発現できる核酸分子を含む、実質的に純粋な形状で生物を提供する。好ましい例における生物は、組み換え的に生成され、そして大腸菌、及びサッカロミセス種から選択することができる。
【００６０】
DNA配列をコードするインテイン又は断片は、タンパク質のアミノ酸の1部から誘導されるオリゴヌクレオチドを変性するためにハイブリダイズするDNA配列として適切なクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)cDNA又はゲノムDNAライブラリーをスクリニングすることにより得ることができる。適切な変性オリゴヌクレオチドが、標準技術により、設計、合成でき、そしてスクリーニングは、たとえば、Maniatisら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Cold Spring Harbour Laboratories,Cold Spring Harbour,NY(1989),Sambrookらの記載(12)のように行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用い、ゲノムDNA,cDNA又はゲノムDNAライブラリーから核酸プローブを単離することができる。次にこのライブラリースクリーンは、単離されたプローブを用い実現できる。
【００６１】
更なる観点において、本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００６２】
本発明の特定核酸分子は、以下のヌクレオチド配列を含む、
又は断片又はその変異体を含む。
【００６３】
さらに本発明は、本発明のインテインをコードする単離された核酸分子の相同性又はその変異体をその範囲内に含む。特に考えられることは、対立遺伝子変異体であり、それがたとえ低いパーセンテージ(50%以下）の同一性であっても形成する。ポリヌクレオチド配列が構成され、そして特定領域における同一のヌクレオチドのパーセントが、公的に利用できるコンピュータ・アルゴリズムを用い、別の配列に対し決定することができる。
【００６４】
類似のポリヌクレオチド配列を直線的に構成し、およびそれを同定するための2種の典型的なアルゴリズムは、BLASTN及びFASTAアルゴリズムである。BLASTNソフトウエアは、NCBIアノニイマウス(anonymous)FTPサーバ(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)の/blast/executables/を利用することができる。BLASTNアルゴリズム版2.0.4[Feb-24-1998]により、文書に記載のデフォルトパラメータが設定され、そしてアルゴリズムにより分配され、本発明による変異体の決定に使用することが好ましい。BLASTNを含む、BLASTNファミリーのアルゴリズムを使用することを、NCBI's website,URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlに記載され、Altschul,Stephen F.ら(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database serch programs」、Nucleic Acids Res.25:3389-3402に公開されている。コンピュータ・アルゴリズムFASTAを、インターネットのftp ste ftp:ftp.virginia.edu.pub/fasta/で利用できる。版2.0u4,2月 1996により、文書に記載されるデフォルトとしてのパラメータに設定し、アルゴリズムにより分配される。FASTAアルゴリズムの使用が、W R Pearson and D.J.Lipmanの「Improved Tools for Biological Sequence Analysis,」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988) and W.R.Pearson、「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,」Methods in Enzymology 193:63-98(1990)に記載される。
【００６５】
全ての配列が、上記品質として同定され、その用語「変異体」が明細書に用いられる。
【００６６】
さらに本発明は、少なくとも約35%同一であるインテインをコードするポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60%同一である、好ましくは少なくとも約70%同一である、好ましくは少なくとも約85%同一である、より好ましくは少なくとも約90%同一であり、ならびに配列番号1のインテインヌクレオチド配列に少なくとも約95%,97%,98%又は99%同一の核酸配列を有するこれらのポリヌクレオチドを含む核酸分子又はポリヌクレオチドを含む。本発明のインテインの変異体であるインテインをコードするヌクレオチド配列が、表1に同定されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の47菌株において、最初出願者により配置された(下記参照)。例示的に変異体の配列が図6、及び配列番号：9乃至17に示されている。
【００６７】
本発明のインテイン、インテイン断片、又は核酸分子が、当業者周知の技術により、合成又は組み換え手段により生成することができる。変異体は、標準的な変異生成技術を用いて調製することができるか、又は生体から単離することもできる。
【００６８】
変異体のポリヌクレオチド配列は、一般的に厳密な条件下にてポリヌクレオチド配列にハイブリットすることになる。この用語は、当業者に認識され、そしてManiatisら及びSambrookら；(supra)にて記載されている。本明細書に用いられているように、「厳密な条件」は、6xSSC,0.2%SDSの溶液にて予備洗浄し；6xSSC,0.2%SDSの溶液、65℃にて1昼夜ハイブリダイズし；その後1xSSC,0.1%SDSの溶液、65℃にてそれぞれ30分2回の洗浄、及び0.2xSSC,0.1%SDSの溶液、65℃にてそれぞれ30分2回の洗浄を指している。こうしたハイブリダイズできる配列は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)以外の資源から(他のクリプトコッカス)同等のインテインにコードするものを含む。
【００６９】
合成又は組み換え方式を用いることができるが、しかしながら、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株ATCC32045によりクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子から単離することにより、Cne PRO8配列をクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を得ることは、実際的であり、そしてクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株ATCC32045よりクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8が現段階で好ましい。有意に保守されたmRNAスプライシングタンパク質をコードする宿主遺伝子、PRP8は、スプライゼオソームのコアとして見出された。
【００７０】
一旦得られると、そのインテインが、所望されれば容易に精製される。これは、親和性クロマトグラフィを含む。精製のための他の方法(たとえば、ゲル濾過、又は陰イオン交換クロマトグラフィ)も使用することができる。インテイン又は断片が、融合タンパク質の形状にて生成されると、融合タンパク質の担体部分が、これに関し有益であることがわかった。
【００７１】
さらに望ましいものとして見るならば、技術的に標準の方法を使用して、追加による精製工程を用いることができる。その方法は、インテインの有意に高い純度調製を誘導することができる。好ましくは、インテインの調製には、少なくとも約50重量%のタンパク質、このましくは、少なくとも約80重量%、好ましくは少なくとも約90重量%、及び有意に好ましくは少なくとも約95重量%のタンパク質を含む。
【００７２】
精製方法は、もちろん使用のため必要な純度の程度に依存することになり、その方法にて、インテイン、融合タンパク質又は断片を行う必要がある。
【００７３】
一度得られると、インテイン及び／又はその断片及び／又はその機能的に同等の変異体を、組成物内に形成することができる。たとえばその組成物が、家畜医療、薬理的、又は診断として適用するための治療組成物でよい。これらの目的のためインテインは、純粋か実質的に純粋な形状にて存在することが、一般的に好ましいことである。再度、標準的方法により、こうした組成物を生成が行われる(たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEdition,Mack Publishing(1990)を参照)。
【００７４】
従って本発明のインテイン及びタンパク質及び／又はプライマーは、さらにアッセイ・キットにも含むことができる。インテインに近接した適切なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応が、感染を診断するために使用することができる。さらにキットは、PCRプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、デオキシリボース・トリホスフェート、及び緩衝液を含む。そのアッセイが、実時間PCRによるか、又は適切なサイズの増幅されたDNA結合を検出するアガロース・ゲル電気泳動により行うことができる。PCR産生物が、特定の型又は株を同定するためにDNA配列決定を受けることができる。
【００７５】
さらなる観点において、本発明は、関心のあるタンパク質生成するため、特に関心のあるタンパク質及び本発明のインテインを含む融合タンパク質を産生するための方法を提供する。インテインが、たとえば、所望のタンパク質を精製するために親和性グループと結合して用いることができる。親和性融合に基づくタンパク質の精製が、たとえば、Chongら、(1997b)Gene 192:271-281;Chongら、(1998b)Nucl.Acids Res.26:5109-5115,and WO 01/12820において教示され、引用により明細書に全て組み入れる。インテインの自己切断が起こると、スプライシングよりむしろ所望のタンパク質が、プロテアーセを加える必要もなく放出され、精製を簡単にする。切断は、後期段階のインテインのスプライスをブロックすることによる標準技術方法を使用し、又はスプライシングを完了するに必須アミノ酸の1つにおけるインテイン変異体を使用することにより、行うことができる。たとえば、保守されるN-末端及びC-末端残基を欠失する変異体は、上に記載のとおりである。PRP8インテイン切断の好ましい状態は、VMAインテインなど他のものと異なると考えられ、これらの異なる点が、使用するに有益であろう。
【００７６】
この戦略は、以下のように有益であることを表している。
【００７７】
スプライシング NX-I-CX:ここで、NX及びCXがそれぞれ近接か、遠位のイクステイン、及びIが、本発明のインテインであり、NXCX+Iを形成するためにスプライスする。
【００７８】
切断 NX-I-CX 切断してNXI＋CX
N-及びC-末端フランキング・イクステインが、同じタンパク質からでもよく(cisスプライシング又は切断)、又は違ったタンパク質から(transスプライシング又は切断)でもよい。
【００７９】
1つの例におけるN-及びC-末端近接及び遠位のイクステインが、タンパク質クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8を含む。
【００８０】
別の例におけるN-及びC-末端近接及び遠位のイクステインが、リセプター・タンパク質を含む。
【００８１】
上に記載されておるようにタンパク質又は融合タンパク質が、化学的合成、組み換え又は他の周知の技術により生成することができる。好ましくはタンパク質が、タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸配列、及び/又はDNAを含むベクターを調製することにより、そのベクターにより宿主細胞を形質転換させ、そしてその宿主細胞に核酸/DNAを発現することにより組み替えて的に生成される。記載のようなベクター及び宿主を使用することができる。
【００８２】
作り出されたタンパク質が、標準的な作成技術を用いて上記のように精製することができる。
【００８３】
さらに本発明は、関心のあるタンパク質を精製するための方法を提供する。その方法は、結合タンパク質部分、本発明のインテイン、及びタンパク質の関心のある部分を含む融合ポリペプチドを生成する工程、前記融合ポリペプチドを結合成分に結合させる工程、インテイを切断しやすい状態にする工程、及び所望タンパク質を単離する工程を含む。結合には、融合ポリペプチドの親和性マトリックスへの結合(たとえば、ビーズ、膜、カラム、又はカラム中の材料)が含まれる。単離には、マトリックス(たとえばカラム内容)がpH又は温度移動など化学的又は物理的変化を受け、そして所望タンパク質と溶離することを含む。有益な切断条件は、たとえば引用として本明細書に組み入れられている、WO 01/12820において、技術的に知られている。
【００８４】
タンパク質が、関心のあるタンパク質、インテイン/結合成分融合として合成され、そして結合成分が、カラムにより認識されそしてカラム上にて保持される状況において、1工程による生成法が可能である。たとえば、関心のあるタンパク質が、遠位チキン結合領域によりインテインに融合される場合、トリパーテト・タンパク質が、亜鉛の存在下、キチンカラムに結合することができる。EDTAによりカラムを溶離することにより亜鉛をキレート化し、そしてインテインを関心のあるタンパク質から切断することができる。スプライシング反応を阻害するように、インテインが、修飾することができる。その結果は関心のあるタンパク質が、カラムより溶離されるがインテイン及びキチン結合領域が残っている。3つに分かれた融合及び精製方法を、上のWO 01/12820に記載されている。さらに切断は、上記のように行われる。
【００８５】
１つの例において、関心のあるタンパク質の部位が、レポータ・タンパク質部位である。インテインは、結合タンパク質部位とレポータタンパク質部位、又は関心のあるタンパク質部位を単離することができる。
【００８６】
たとえば、結合部位は、大腸菌又はHis-tagのマルトース結合タンパク質でよい。
【００８７】
したがって、さらなる観点において、さらに本発明は、本発明のインテインを含むタンパク質を提供する。好ましいタンパク質は、N-及びC-末端の近接及び遠位のイクステイン、及び結合タンパク質/インテイン/レポータタンパク質の上に記載されたような融合タンパク質を含む。幾つかの場合におけるタンパク質が、インテインをスプライシング又は切断する前に、生成ざれる前駆タンパク質であることも理解さよう。
【００８８】
さらに本発明は、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、上記の方法により生成することができる。
【００８９】
上に注記されているように、本発明も、微生物に対する抗生物質の活性のための薬剤をスクリーニングにおける適応を有する。この方法において、本発明のインテインは、微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に存在する。微生物は、Candida及びCryptococcusなどの広範囲な微生物病原体、サッカロミセス(Saccharomyces)などの酵母菌、及び大腸菌などのバクテリアから選択しても良い。好ましくは、微生物は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌及びサッカロミセス(Saccharomyces)種から成る群から選択される。大腸菌は、開始スクリーニングを容易にするために特に有益である。スクリーニングするには、静止制限部位を含み、そして本発明のインテインを含む変更されたレポータ遺伝子を含む誘発可能な発現ベクターを調製する必要がある。そのベクターが宿主にて発現される。インテインのうちイクステイン生成物の生成は、インテインの薬剤の存在下検出され、及び／又は測定される。
【００９０】
生成されるイクステインの量が減少すると、インテインが阻害され、そしてその薬剤がインテインに対し阻害活性を有することを示している。このことから、薬剤が、インテインを組み入れた微生物、特に天然の病原体の増殖を阻害できることを、論理的に示唆することができる。試験される薬剤が、種々の濃度で本発明のスクリーニング方法において、用いることができる。この方法において、さらに薬剤も最も有効な濃度を、決定することができる。
【００９１】
より具体的に、本発明は、大腸菌のβ-ガラクトシターゼのα-ペプチドにクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8インテイン(Cne PRP8)のクローニングよるインテン機能を監視するための遺伝子系に関する。これは、従来pUC19などの血漿中にある。β-ガラクトシターゼのアミノ断片をコードする、干渉されないα-ペプチドが、クローニングレポータ遺伝子として開発されてきた。干渉されないα-ペプチド遺伝子が、唯一の炭素資源(最少培地＋ラクトース)、としてラクトースを伴う培地にて(最少培地＋ラクトース）増殖し、Lac+表現型を与えるにめの、β-ガラクトシターゼに欠陥のある大腸菌細胞に相補でも可能である。対照的に配列が、α-ペプチド・コード配列内に挿入されると、これらは、ペプチドの翻訳又は活性に干渉することになる。Cne PRP8インテインの枠融合が、α-ペプチドのイクステインを生成することに成る。バクテリアが搬送すると、この構造が、Lac+であり、これは、α-ペプチド配列が活性であることを示し、この酵素活性が、タンパク質介在配列(インテイン)が、前駆タンパク質から切除されたことを明示する。
【００９２】
好ましくは、そのタンパク質は、CnePRP8である。そのタンパク質が、pUC19内にクローン化されたCnePRP8であるとき、その方法により、pCCne(活性インテイン)及びPRCne(不活性インテイン)のクローンが産生されることになる。
【００９３】
同様に広範囲なレポータ遺伝子/タンパク質が、タンパク質、タンパク質の調製、タンパク質の精製、及び本発明のスクリーニング方法にて用いることができる。好ましいレポータ遺伝子/タンパク質が、in vivo又はin vitroのいずれか、又は両方にて容易にアッセイが可能であり、そしてβ-ガラクトシターゼ、ガラクトキナーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスフェート(酵素アッセイに対して)、β-ラクタマーゼ(抗生物質耐性を与えるレポータ)、オロチック酸デカルボキシラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質を含むが限定されず、レポータが、直接比色分析アッセイに有益である。
【００９４】
使用するにはβ-ガラクトシターゼが、特に好ましい。イクステインの存在が、この酵素を用いて分光光度計アッセイにより容易に測定される。選択肢として、最少培地＋ラクターゼ(lactase)におけるバクテリアの液体増殖アッセイ(混濁度）によりin vivoにおいて、又はペトリプレート上にて(種々の合成ガラクトシドを用いて)、アッセイすることができる。
【００９５】
イクステイン産生物の検出が、、たとえば当業者の周知な、トリプシン消化性ペプチドのアミノ酸配列マッピング、及び質量分光学酵素アッセイ、及び比色法の全てにより、表現型の特徴付け、タンパク質の特徴付けなどの標準的な分析方法により行うことができる。
【００９６】
この方法を使用して理解できるように、前駆体タンパク質が、インテインにより干渉されるイクステインを含めて合成される。次にタンパク質がスプライシングすると、インテインが切除されることになり、そしてエクステインの結合が、インテイン含有タンパク質に干渉されないリーデング・フレームを復帰させる。有意に高く保守された配列が、インテインとエクステインとの結合で見受けられる。Ser(S),Thr(T)又はCys(C)は、N-の終端にて形成するが、His(H)とAsn(N)が、インテインのC-の終端にて形成される。加えてCys,Thr,又はSerのいずれかをインテインのC末端Asnに直ぐに近接する有意に高い保守されたイクステイン残基がある。
【００９７】
これら保守されたアミノ酸の存在が、ゲノム配列におけるインテインの欠失に用いられる。インテインが、遺伝子のコード配列への挿入期として存在し、インテインを欠失する遺伝子と相同に成るべきであり、そのインテインが、特徴となるN-末端及びC-末端のアミノ酸を表示し、そして他のインテインに対してある程度タンパク質配列に相同性になりえる。
【００９８】
本発明は、以下の実験の章において、現段階にて十分に記載され、それが表示目的のみに提供される。
【実施例１】
【００９９】
材料及び方法
宿主：Intstitute of Environmetal Science & Reserch Ltd,Porirua,New Zealandから得られるクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)株Cn 3511(ATCC 32045)。
【０１００】
ホストの培養：菌株 Cn 3511を、YPD培地(1% w/w Dyco 酵母抽出、2%w/v peptone,2%w/wグルコース、必要な場合1.5%w/vアガーにて固形)で２７℃にて増殖。
【０１０１】
DNAの単離：ゲノムDNAを、特にPhilipsonらの方法(7)を介し培養物を1昼夜50mlより単離した。
【０１０２】
インテイン配列及びフランキング・ヌクレオチド領域の増幅を、以下のプライマー(Genset,Singapore):FcnIn,5’gcggaattcCCACATGGTGAATCGACG及びCnInR,5’gctctagaTCATCTGGACTAACCAGCを用いて、最終濃度を1μMで、Expand High Fidelity PCR system(Roche)で行われた。100μlの反応当たり約100ngのゲノムDNAを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のアニール温度を、52℃(1分)、拡張して72℃(2分間)であった。得られた821bpのPCR生成物を、自動的に配列決定をする前にQiagen columnにて精製した。PCR生成物の両株を、ABI 377DNA Sequencerを用いて配列決定した。株Cn3511のためのコンセンサス・インテイン配列を、EditView 1.0.1(Perkin Elmer)を用いて生成した。配列分析には、BCBI(http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)で、the Stanford Cryptococcus neoformans genome sequencing project webstite(http://baggage.stanford.edu/cgimisc/cneoformans/cneo blast.xgi)を介し利用できるBLASTプログラムを用いて行った。複数の配列の位置付けをSeaview(9)で編集しClustal X(8)により作成され、MacBoxshade(http://www.isrec.isb-sib.ch/sib-isrec/boxshade/macBoxshade)にて陰影をつけた。
【０１０３】
インテインの同定
インテイン遺伝子を、クエリー(query)としてC.トロピカリス(tropicalis)インテイン(Ctr VMA)のアミノ酸配列を用いて、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)のアミノ酸配列を用いて、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列データベースのTBLASTN検索を行うことにより、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)において同定した。そのインテイン遺伝子を、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子にて存在した。
【０１０４】
インテイン：PRP8遺伝子及びフランキング配列におけるクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)インテイン配列が、GenBank Accession番号AF349436に割り当てられ、それがInBase records(http://www.neb.com.com/neb/inteins.html)に加えられた。
【０１０５】
結果
ミニ-小インテイン、Cne PRP8を、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子に配置した。図2及び図3を参照すると、Cne PRP8が、システイン残基により特異的に始まり、ヒスチジン-アスパラギン、その直後をセリン残基にて終了する。インテインが、認識可能なエンドヌクレアーゼ領域を含んでいないが、前に同定された酵母核様インテインN-末端及びC-末端の配列と類似している(図4 & 5)。
【０１０６】
516塩基対(図1A)を含むミニ-インテインが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列データベース(株JEC21から生成された)にて同定された。この生成物を用いPCRプライマーを作成し、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、Cn 3511の別の株からCne PRP8及びそのフランキング配列を増幅させた。760塩基対の配列データベースが、Cn 3511から得られ、そこに同じミニ-インテイン核酸分子を同定した(図1B)。
【０１０７】
2種のインテイン核酸配列(Cne PRP-JEC21及びCne PRP8-Cn3511)の概念的な翻訳から、タンパク質スプライシング要素が、あまりに短いため、エンドヌクレアーゼ領域を有する「全長」をコードすることができない。Cne PRP8-Cn3511配列が、クリプトコッカス(Cryptococcus)データベースから誘導されるCne PRP8-JEC21の対応する配列とほぼ正確に一致する。2種の株のDNA配列の間で,3つの基本的相違だけがあり、インテイン配列内の1つだけである。3種の相違の全ては、同定として予測されるPRP8アミノ酸配列に導く3番目の塩基コドン位置に配置される。クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の2種のインテイン配列、Cn3511とJEC21との間では、得られた結果により、DNA配列にて極めて高い同一性(99.8%)があることを示した。
【０１０８】
考察
Cn 3511ポリヌクレオチドによるクリプトコッカス(Cryptococcus) データベースにおけるBLASTNの検索により、1つだけが、contig 7530(クリプトコッカス(Cryptococcus) データベース,1月2001）にて提示の配列と有意に一致することが、示された。クリプトコッカス(Cryptococcus)ゲノム配列データが、まだ完成していないが、これは、JEC21というハプロイド・ゲノムに存在するインテインのおそらく単一複製だけであることを示唆している。これは、クリプトコッカス(Cryptococcus)ゲノムにおいて、おそらく非対立遺伝子版のインテインが何処にもないことを示している。
【０１０９】
クエリー(query)としてクリプトコッカス(Cryptococcus) データベースからコンテグ(contig)7530にて、GenBankデータベースのBLASTX検索により、Homo sapiens,Trypanosoma brucei,Arabidopsis thaliana and Schizosaccharomyces pombe(示されていない)を含む幾つかの種のPRP8に、有意的に極めて高く(E=0)一致していることが、見出された。しかしながら、これらの一致には、インテインを含む(図3) クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列の領域が含まれていない。3種の酵母種、Candida albicans,S.cerevisiae及びS.pombeには利用できるPRP8遺伝子配列のうち、これらPRP8の相同体(データが示されていない)にインテインを有することが、全く見受けられない。GenBankデータベースでは、PRP8の相同性を記載した(たとえば、Trichomonas,Giardia,Guillardia,Plasmodium,Mus及び図3に一覧記載の関係微生物)他の真核種から広範囲にわたる有意に高い類似配列を伝達する。これらのPRP8相同体では、インテインを含むことが全く見られない。Cne PRP8インテインのコード配列が、PRP8遺伝子産生物に存在し、スプライシング(10)に関与するという事実が、核内に配置されていることを示唆する。このように、Cne PRP8が、同定されるべき、第二の、非対立性で、真核性の核様インテイン遺伝子である。Cne PRP8が、PRP8遺伝子のいずれかにて検出される最初のインテインである。さらにCne PRP8が、Basidiomyceteにおいて見出される第一のインテインでもある。そのインテインが、さらなる機能としてすなわちタンパク質のスプライシングができるという機能が、ほぼ確かめられている。それが、自動触媒的に取り除くことが出来ないならば、得られた欠陥のあるPRP8遺伝子産生物は、不活性であることがほぼ確かめることができ、その結果クリプトコッカス(Cryptococcus)においては、前-mRNA(致死の状態)を処理できなくなっている。
【０１１０】
クエリー(query)としてCne PRP8インテイン・タンパク質配列を用いるIｎBase(http://vent.neb.com)でのBLAST検索により、E-値が0.1より少ないところにて、７つ一致することを見出した。GenBankによる検索の場合、最も有意なE-値は、C.tropicalis及びS.cerevisiaeの対立遺伝子VMAインテインによるものである。3種の古細菌(archaeans),Thermococcus aggregans,T.fumicolans及びPyrococcus kodakaraenisisのDNAポリメラーゼ(アルファ・ファミリー)遺伝子のインテインが、最初Cne PRP8の約50アミノ酸に一致(それぞれがE=0.0008,E=0.016,E=0.067)し、加えて内部にある50アミノ酸配列に対し有意に一致することが少ないことを示した。3種の古細菌すべては、エンドヌクレアーゼ領域を含み、そして相同性のあるアルファ・ファミリーのDNAポリメラーゼにミニ-インテインがないのが明らかである(Pietrokovski,S.,http://bioinfor.weizmann.ac.il/〜pietro/inteins/)。
【０１１１】
クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)インテイン(図2)のアミノ酸配列によるGenBankでのBLAST検索により、Ctr VMA及びSce VMAの最初の50残基に有意に一致することを表す(それぞれE=1e-04,E=2e-04)。さらに実験により、おそらくCne PRP8の保守された自己スプライシング機能(図4及び5）を反映して、Cne PRP8,Ctr VMA及びSce VMAインテインは、両端が類似する領域を共有することが、示された。Cne PRP8が、172のアミノ酸だけであり、それは、S.cerevisiae及びC.tropicalis VMAインテインより実質的に短い。これは、Cne PRP8が、他の酵母菌の核様インテインに見出されるエンドヌクレアーゼ領域を欠失しているからである。
【０１１２】
エンドヌクレアーゼ領域をコードする全長のインテイン(示されていない)をクリプトコッカス(Cryptococcus)に存在することには、いまだ明確ではない。さらに多くの細菌、古細菌、及びプラスミドも、明らかにエンドヌクレアーゼを欠失している。全てのインテインのうち約18%を占めているこれらのミニ-インテインが、有意に大きいインテインの欠陥性にある版を表すことができる。誘導体としてのミニ-インテインが、さらにスプライスすることができるが、もはや新たな部位を拡張することができない。選択肢として、ミニ-インテインが、エンドヌクレアーゼにより侵食される前にインテインの前駆形状を表すことができる(Pietrokovski,http://bioinfo.Weizmann.ac.il/〜pietro/inreins/)。
【実施例２】
【０１１３】
菌株
薬剤の標的としてインテインを使用する戦略は、インテインが大部分に存在するが全菌株に存在しない場合のみ有効となろう。インテインをフランキングするPRP8の配列が、有意に保守され、そのためプライマーの設計及びPCRの増幅のため、保守される鋳型が表される(Butler MI,Goodwin TJ,Pooulter RT,(2001)A nuclear-encoded intein in the fungal pathogen Cryptococcus neoformans.Yeast.18(15):1365-70)。
【０１１４】
試験された47の株からクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を増幅し(see Table 1below PHLS stands for Public Health Laboratory Service.IUM stand for Istituto di Igiene e Medicina Preventiva,Universita degli Studi,IRCCS Milan)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)株全てが、インテインを運ぶことを示唆している。これらの配列は、クリプトコッカス(Cryptococcus)のPRP8遺伝子の保守された配列に挿入されるように検出された。有機物の他、この遺伝子(PRP8)にインテインをコードするする配列を含むことは、記載されていない。増幅された配列が、アガロース・ゲル上にて評価されるような特徴的サイズ(〜820bp)から構成される。
【０１１５】
イタリアにおいて元から単離された血清型Aの10株、及び血清型Dの10株からインテインを増幅した。加えて、タイ、ウガンダ及び英国からの12を臨床的に単離し全て生成されたインテイン配列を有し；全てが、血清型に最もよく似にそれは、AIDS患者に極めて顕著な株による。さらに4種のC.neoformans var.neoformans strainsが、オーストラリアにて単離したばかりか、Weiland Meyer博士(Westmead Hospital in Sydney)からクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans) var.gattii(又は株全てがクリプトコッカス・バシリスポラス(Cryptococcus・bacillisporus))の単離したものが、最近受けられた。これらのC.n.var.gattiiga、血清型B及びC株であり、それは免疫応答宿主の疾患の要因となる。C.n.var.gattiiの8株全てが、PRP8遺伝子におけるインテインコード配列を有することが、示された。C.n.var.gattiiのインテイン・コード配列を十分に配列されたものとなった。
【０１１６】
配列の分析によりPRP8にこれらインテインをコードする挿入物とするサブセット(15)が、さらに特徴付けられた。公共のデータベース:株JEC21/血清型 D:http://www-http://cneo.genetics.duke.edu/、の利用できる配列データによるこれらのデータが組み入れられた。
【０１１７】
血清型A(AIDS患者の顕著な型)と血清型株との間のインテイン・コードDNA配列の持続する違い、及びこれらと十分に配列された1種のC.var.gattii株とのさらなる相違があった。この変異が、他の配列において、特にイントロンにおけるより配列の幾つかの領域でより明らかである。
【０１１８】
増幅されたPCR産生物からの配列の概念的な翻訳(conceptual translation)により、これらが、~52塩基対のイントロンによりPRP8遺伝子の領域を表し、加えて挿入が他のPRP8遺伝子に見出されないことが、確認された。この特徴的挿入は、インテインコード配列である。オープン・リーデング・フレーム(PRP8遺伝子と同じフレームにおいて)、及びインテインの特徴である保守された残基が含まれる(図１a,1b及び2)。
【０１１９】
当方が、DNAとタンパク質配列の両方の代表的例を構成した(図6及び7)。多様な株からの概念的翻訳は、いくつかの変異体が明らかであるが、保守された配列のインテインを示している。その変異化が、幾つかの株においてより自明性がある。その変異化が、幾つかの領域において、特に内部領域においてもより自明性がある。しかしながら、タンパク質の全てが、予測的に活性なインテインをコードすると見られる。DNAレベルでの変異化が提示されることにより、インテインとPRP8内の両方の3番目のコドン位置で変化することが、ほとんど制限される。PRP8遺伝子のイントロンに付加的な多くの相違がある。
【０１２０】
【表１】
【表２】
【０１２２】
CnePRP8インテインのフレーム融合において、切断及び結合による発現プラスミドpＵＣ19(AmpR)により搬送される「αペプチド・イクステイン」にて行われた。インテインDNAが、ポリメラーゼ連鎖反応により生成され、pUC DNAが、New England Biolabs,USAから商業的に得られた。これらの構造が、アンピシリン選択性培地上、大腸菌(DH5 Lac-)内にて形質転換された。形質転換された細胞は、これらがアンピシルン耐性を必要とするため、この培地上にて増殖することができた。プラスミドをこれらの培養物から単離し、そして配列決定した。これらが、プラスミドpCCNeを搬送し、プラスミドpCCNeのインテイン配列が、予測されるフレーム内の配置におけるUC19の意図された部位に挿入されることが、確認された。PCCneコロニーが、X-galの存在下青色であり、そしてラクトースが唯一の炭素源であると、増殖することができた。
【０１２３】
Sambrookら、(Sambrook,J.,MacCallum,P.,David R.(2000)Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Thid edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press)によれば、CnePRP8のこのサイズを挿入することにより、β-ガラクトシターゼ活性のαペプチド相補性を阻害することになろう。pCCneを含む細菌内の本酵素活性により、タンパク質配列(上記インテイン)を介在することが、機能的α-ペプチドを残している前駆タンパク質から削除されていたことが示された。これは、インテインが、このバクテリア宿主、及びαペプチド・コード配列の本部位で活性であることを明示した。インテイン機能がブロックされた場合、その培養物が、X-gal上に白色にて増殖し、そして最少培地＋ラクトース上にて増殖することが出来ない。
【０１２４】
同様に修飾されたpRCne CnePRP8 インテインのフレーム内の融合が、切断及び結合による発現プラスミドpUC19(AmpR)により搬送される「α-ペプチド・イクステイン」にて行われた。インテインDNAを、1つのプライマーが変更されるポリメラーゼ連鎖反応により生成された。得られた配列は、インテインのN-末端にて必須のシステインの換わりにアルギニンをコードした。その構造は、アンピシリン選択培地上、大腸菌DH5 Lac-)内に切断及び結合ならびに形質転換により生成された。形質転換された細胞は、これらがアンピシリン耐性を必要とすることから、本培地にて増殖することができた。プラスミドをこれらの培養物から単離し、そして配列決定した。これらが、変異体インテイン配列が、予測されるフレーム内の構成の意図された部位において、pUC19内に挿入されていたプラスミドpRCNeを搬送した。ｐRCneコロニーが、X-galの存在下で白色で、そしてラクトースが唯一炭素源である時、増殖することができなかった。
【０１２５】
ｐRCneを含むバクテイアにこの酵素活性が欠失すると、前駆タンパク質から削除することができず、その結果非機能的α-ペプチドとなる。pPRneの形質転換された株の動きは、インテインが薬剤によりブロック/阻害された株内に生ずるであろう動きを刺激する。
【実施例４】
【０１２６】
インテイン・ペプチドレポータ構造を、薬剤の在る場合とない場合にて、薬剤(通常試験されるべき薬剤)の濃度を1種か種々変えて増殖させることができ、そしてこれらの現象型が、異なる薬剤の濃度で得点される。薬剤は、たとえば亜鉛の塩であろう。Mill及びPaulus(2001,Reversible inhibition of protein splicing by zinc ion.J.Biol Chem.276(14):10832-8)が、Vitro系において最近開発された利点を取っており、そこにタンパク質スプライシングが、トランスに(trans)(異なるタンパク質からN-及びC-イクステイン)発生し、タンパク質・スプライシング阻害剤として評価し、低濃度の亜鉛(Zn(2+))が、Mycobacterium tuberculosisからRecAインテインにより、とSynechocystis sp.から天然のsplit DnaE インテインにより介在されるスプライシングを阻害することを発見した。PCC6803では、90%の阻害が、0.2mMの亜鉛(6部/ミリオン)という比較的低濃度でおこなわれた。Vivoにおいて亜鉛の塩により処理したインテインの阻害化は、一連のブロス内にpCCneを搬送するDH5aを、そして別の一連のブロス内にpCCneを搬送するコントロールDH5aを接種することにより、試験することができよう。亜鉛の塩を、種々の濃度にて(0/0.2/2/20mM)ブロスに付加することができる。DH5a/pCCne培養物の増殖が、DH5a/pUC19培養物を阻害することの出来ない亜鉛濃度にて阻害されるなら、インテインの阻害化は、類推されるであろう。
【０１２７】
工業的適用
インテインが、利用できる配列データが極めて大きな量であるにもかかわらず、いずれの哺乳動物の遺伝子からも知られていない。したがって、同定されるインテインが、重篤な微生物の感染の治療に関して強力な分子標的である。インテインの機能に影響を与える標的薬剤を投与することにより(すなわち、インテイン・スプライシング阻害剤又はアンタゴニスト)、患者に有害な副活性を生ずることなく、微生物の病原体の増殖を停止させることになろう(6)。インテインタンパク質の阻害化の概念が、多くの点で、HIV/AIDS患者に投与される薬剤形態としての、アスパラギン・プロテアーゼ阻害剤と類似している。
【０１２８】
クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)が、ヒトの主用な酵母業病原体の1つである。治療できず、早い致死性、感染を起こすことができ、そして全域的なAIDS/ヒト免疫不全ウイルス感染と関係する顕著な2次病原体として、とくに重要になってきている。最も共通的な臨床的状況としては、慢性的髄膜炎であり、それが皮膚や肺を冒すことを伴ってくる。
【０１２９】
Cne PRP8は、同定されるべき唯一の二次(非対立遺伝子)真核生物核様インテインである。この酵母核様インテインが、初期真核生物の部生物から古細菌組成物のゲノムに存在するインテインから誘導することができる。さらにそれが、Ascomycete酵母からVMAインテインなど他のインテインに対し非常に遠位であり、そのため、薬剤及びアンタゴニストを阻害するための明確な感受性を有する。
【０１３０】
PRP8遺伝子産生物が、スプライセソーム(spliceosome)のコアを含む、周知の極めて有意に保守されたタンパク質の1つである(11)。PRP8遺伝子産生物が、スプライセソーム(spliceosome)の必須の組成物であり、したがって細胞の変動に必須である。PRP8遺伝子機能を失うと、全てのmRNA転写物からイントロンを処理できなくなる結果となろう。PRP8遺伝子が、迅速な増殖中極めて大量に必要となる。あらゆるメッセージにおけるあらゆるイントロンを、mRNAが活性化できる前に除去しなければならない。対照的に定常相において、新しいmRNAのために最少の必要性があり、したがって新しいPRP8には最少の必要性がある。そのため、PRP8産生物が、必須の制御点を表している。したがって、インテインCne PRP8が、医薬分野において多くの用途を有する。特に本インテインが、治療的に干渉するための分子標的としての価値を有す。
【０１３１】
たとえば、本発明のインテイン又は断片を、部生物の感染、特にAIDSを有するか又はHIVに感染した患者のクリプトコッカル(Cryptococcal)の感染を治療するために有益である抗インテイン薬剤(阻害剤又はアンタゴニスト)を選択するための薬剤スクリーニング・プログラマーにて使用することができる。インテイン阻害活性を有する薬剤をスクイーニングするための適切な方法は、上記そして米国特許5,795,731に教示されている(6)。エンドヌクレアーゼ領域を欠いているが、保守された配列を有するCne PRP8-Cn3511など最少タンパク質スプライシング要素が、各終端部をブロックし、及び／又はCne PRP8から誘導されるポリペプチドも、医薬剤の調製において、及び／又は治療薬剤の開発において、有益でもある。たとえば、その薬剤が、前駆タンパク質からインテインのタンパク質分解による切断及び／又はスプライシングを阻害するならば、活性なPRP8遺伝子産生物が全く形成されないであろう。インテインの構造が、酵母インテインSceVMAの構造を含めて十分に特徴付けられる。さらにインテインの活性モードが、分子レベルで十分に理解される。従ってこの系が、適切な阻害アンタゴニスト又は阻害剤を開発するためには適切である。
【０１３２】
当業者が、上の記載により、図示による方法だけが提供され、そして本発明がそれに限定されないことが、理解されよう。
【０１３３】
文献
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12. Sambrook,J.,MacCallum,P.,David R.(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Third edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press All references in this listing are in the text are incorporated herein by reference.
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
本発明は、上に広く明記されているが、さらにそれは、以下記載記載による例を提供する実施例を含む。特に本発明の十分な理解が、以下の添付する図面を引用することにより得られると考える。
【０１３５】
図1は、Cne PRP8として本明細書にて同定されたインテインをコードするポリヌクレオチドである。配列が、イクステインをコードする配列に相当する一部の配列により近接されている。下線にて示されるインテイン・コード領域領域が、塩基142で始まり、そして包括的に657,516塩基対にて終了する。
【図１Ａ】図1Aは、株JEC21から同定された配列である。
【図１Ｂ】図1Bは、CN3511から同定される配列である。上記配列が、塩基対84、129及び147(太線)の３つの位置で異なる。
【図２】図2は、PRP8タンパク質前駆体(3511から)の配列の一部である。アミノ酸は配列は、図1B記載のDNA配列を翻訳したものである。上記インテイン配列は、下線が引かれている。インテインの広い範囲における有意に変換される残基が、＊の記号にて注記されている。さらにインテイン直後の残基(C末端イクステインにおいて)が、有意に保守され、そして#にて表示される。そのインテインが、残基48(C)ではじまり、残基219(N)で終了する全体として172のアミノ酸である。
【図３】図3は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)のPRP8のは配列とクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)配列(インテインに対応)における枠内への挿入を示す他の関連生物のPRP8配列との間の1部同一する比較である。これは、Cで始まりNで終了し、そしてアミノ酸の長さが172である。PRP8配列としてGenBank accession数は、以下のようである。A.thaliana,AAD55467;C.elegans,AAA27977;D.melanogaster,AAF58573;H.sapiens,AAC61776;S.cerevisiae,AAB68011;S.pombe,CAB11062である。挿入が、他の生物に、特にヒトに見出されない。
【図４】図４は、C.tropicalis及びS.cerevisaeのVMAインテインのN-末端と共にCne PRP8のN-末端の配置である。完全に保守された残基(最も暗く陰影されている)は、触媒として必須のN-末端のシステイン(C)を含む。
【図５】図5は、C.tropicalis及びS.cerevisaeのVMAインテインのC-末端と共にCne PRP8のN-末端の配置である。完全に保守された残基(最も暗く陰影されている)は、触媒として必須のC-末端のHNモチフを含む。
【図６】図6は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)種からCne PRP8のインテインをコードする配列を複数のDNA配列に位置付けする。
【図７】図7は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)種からCne PRP8のインテインをコードする配列の複数アミノ酸を位置付けする。
Claims (47)
- クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans) から得ることのできる単離されたインテイン又は機能的に同等か又は機能的に変更されたその断片又は変異体。
- 米国メリーランド、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、アクセス番号ATCC32045にて寄託の、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn3511より単離できる請求項１記載のインテイン。
- クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8から得ることができる請求項1又は請求項2のいずれか1項にて記載のインテイン。
- インテインが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、及び配列番号:8から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項1乃至3のいずれか1項記載の前記インテイン。
- 配列番号:1のアミノ酸配列を有するインテイン。
- 請求項1乃至5のいずれか1項記載のインテインと機能的に同等の変異体又はその断片であるインテイン。
- クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)以外の生物から得ることができ、そして請求項1乃至6のいずれか1項記載のインテインと機能的に同等で、又は機能的に変更された、変異体又は断片であるインテイン。
- 配列番号:1の配列と約35%以上同一であるアミノ酸配列を有す単離されたインテイン。
- 配列番号:1の配列と50%以上同一である請求項8記載のインテイン。
- 配列番号:1の配列と約70%以上同一である請求項8又は9の1項記載のインテイン。
- 配列番号:1の配列と約80%以上同一である請求項8乃至10のいずれか1項記載のインテイン。
- 配列番号:1の配列と90%以上同一である請求項8乃至11のいずれか1項記載のインテイン。
- 配列番号:1の配列と95%以上同一である請求項8乃至12のいずれか1項記載のインテイン。
- 請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテインをコードする単離された核酸分子。
- 米国メリーランド、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、アクセス番号ATCC32045にて寄託の、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)菌株Cn3511のゲノムの1部であるインテインをコードする単離された核酸分子。
- クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8遺伝子から得ることができる請求項15記載の核酸分子。
- インテインが、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17から成る群から選択される核酸配列を含む請求項14乃至16のいずれか1項記載の核酸分子。
- 配列番号:9の核酸配列を有する請求項17記載の核酸分子。
- 請求項14乃至18のいずれか1項記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14乃至18のいずれか1項記載の核酸分子を発現できる宿主細胞。
- 請求項19記載のベクターにより形質転換される宿主細胞。
- 請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテインを含む組成物。
- 請求項14乃至18のいずれか1項記載の核酸分子を含み、そして請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテインを発現できる、実質的に純粋な形状の生物。
- 医薬に使用するため、請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテイン。
- その使用が、抗生物質活性に対し薬剤を試験するための標的としてである請求項24記載のインテイン。
- 請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテインを含むタンパク質。
- タンパク質が、N-及びC-末端イクステインにより請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテインを含む請求項26記載のタンパク質。
- N-及びC-末端のイクステインが、タンパク質クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)PRP8を含む請求項27記載のタンパク質。
- N-及びC-末端イクステインが、レポータ・タンパク質を含む請求項27記載のタンパク質。
- 結合タンパク質部分、請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテイン、及びレポータ・タンパク質部分を含むタンパク質。
- インテインが、結合タンパク質部分とレポータ・タンパク質部分とを分離する請求項30記載のたんぱく質。
- レポータ・タンパク質は、酵素アッセイタンパク質、抗生物質耐性を与えるタンパク質、直接比色性アッセイを提供するタンパク質、又in vivo活性によるアッセイ可能なタンパク質から選択される請求項29乃至31のいずれか1項記載のタンパク質。
- レポータ・タンパク質が、チミジレート・シンターゼ、β-ガラクトシターゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリ・ホスホターゼ、β-ラクタマーゼ、オロテック酸デカルボキシラーゼ、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質から成る群から選択される請求項32記載のタンパク質。
- 融合タンパク質である請求項26乃至33のいずれか1項記載のタンパク質。
- 請求項26乃至33のいずれか1項記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項26乃至33のいずれか1項記載のタンパク質を切断状態になることを含む、タンパク質を生成するための方法。
- 微生物に対し抗生物質活性に対する薬剤のスクリーニングする方法において、その微生物が、微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に本発明のインテインを有し、前記インテインの阻害の検出を含む方法において、それが：
[(a)（i）レポータ遺伝子内に静止の制限部位を含む変更されたレポータ遺伝子、及び(ii)前記インテインを含む誘導可能な発現ベクターの組み換えクローンを調製する工程；
(b)前記薬剤の存在下、前記組み換えクローンにより前記インテインから生成するイクステイン生成物を検出する工程]
を含み、
前記イクステイン生成物の産生が減少すると、前記インテイン及び前記微生物に対し抗生物質活性の阻害することを明示することを含む前記方法。 - 微生物に抗生物質活性に対する薬剤をスクーリングするための方法において、前記微生物が、前記微生物の増殖を容易にするタンパク質をコードする遺伝子に本発明のインテインを有し、それが：
[(a) 変更されたレポータ遺伝子となるレポータ遺伝子内に静止制限部位を作成する工程；
(b) 誘発可能な発現ベクターに前記変更されたレポータ遺伝子をクローニングする工程；
(c) 組み換えクローンを生成するため、前記変更されたレポータ遺伝子を含む前記誘発可能な発現ベクターに前記インテインをクローニングする工程；
(d) 前記薬剤の存在下、前記組み換えクローンにより前記インテインのイクステイン生成の生成物を検出する工程]
を含み、ここで前記イクステイン生成物の産生が減少することにより、前記インテイン、及び前記微生物に対する前記薬剤の抗生物質の活性を阻害することが示される、ことを含むインテイン機能を監視することにより前記インテインの阻害することを明示する、ことを含む前記方法。 - 前記タンパク質が、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococｙcus neoformans)PRP8である請求項37又は38にて記載された方法。
- さらにインテインが、システイン、セリン及びトレオニンから成る群から選択される付加する遠位のアミノ酸残基を含む請求項37乃至39のいずれか1項記載の方法。
- レポータ遺伝子が、β-ガラクトシターゼである請求項37乃至40のいずれか1項記載の方法。
- 微生物が、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌及びサッカロミセス(Saccharomyces)から成る群から選択される請求項37乃至41いずれか1項記載の方法。
- 誘発可能な発現ベクターが、PUC19である請求項37乃至42いずれか1項記載の方法。
- イクステイン産生を検出することが、表現型特徴、タンパク質の特徴付け、トリプテック・ペプチド・マッピング及び質量スペクトロメータから成る群から選択される方法により、行われる請求項32乃至43のいずれか1項記載の方法。
- イクステインの産生を検出することが、表現型特徴により行われる請求項44記載の方法。
- 請求項1乃至13のいずれか1項記載のインテイン、又は請求項26乃至34のいずれか1項記載のタンパク質あるいはそのためのプライマーを含む診断キット。
- PCRアッセイキットである請求項46記載のキット。
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