JP2016504417A - インテイン媒介によるタンパク質の精製 - Google Patents
インテイン媒介によるタンパク質の精製 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、米国空軍/空軍科学研究所提供のFA9550−12−1−0330及び全米科学財団提供の1150478によって米国政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
温度 半減期
4℃ 243分
16℃ 70分
22℃ 55分
37℃ 16分
構築物1
C−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号1)
翻訳されたC−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号2)
構築物2
CBD−N
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAAGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号3)
翻訳されたCBD−N:
MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQEACGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH(配列番号4)
構築物3
C*−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号5)
翻訳されたC*−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号6)
構築物4
CBD−NC1A
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAAGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCGCCTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号7)
翻訳されたCBD−NC1A:
MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQEACGGGGSGGGGSASALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH(配列番号8)
構築物5
ELP−N
ATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号9)
翻訳されたELP−N:
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH(配列番号10)
構築物6
C*−PTDH:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTCACCGAGTACACGAAGAGATCCTGCAACTGCTGGCGCCACATTGCGAGCTGATAACCAACCAGACCGACAGCACGCTGACGCGCGAGGAAATTCTGCGCCGCTGTCGCGATGCTCAGGCGATGATGGCGTTCATGCCCGATCGGGTCGATGCAGACTTTCTTCAAGCCTGCCCTGAGCTGCGTGTAATCGGCTGCGCGCTCAAGGGCTTCGACAATTTCGATGTGGACGCCTGTACTGCCCGCGGGGTCTGGCTGACCTTCGTGCCTGATCTGTTGACGGTCCCGACTGCCGAGCTGGCGATCGGACTGGCGGTGGGGCTGGGGCGGCATCTGCGGGCAGCAGATGCGTTCGTCCGCTCTGGCAAGTTCCGGGGCTGGCAACCACGGTTCTACGGCACGGGGCTGGATAACGCTACGGTCGGCTTCCTTGGCATGGGCGCCATCGGACTGGCCATGGCTGATCGCTTGCAGGGATGGGGCGCGACCCTGCAGTACCACGCGCGGAAGGCTCTGGATACACAAACCGAGCAACGGCTCGGCCTGCGCCAGGTGGCGTGCAGCGAACTCTTCGCCAGCTCGGACTTCATCCTGCTGGCGCTTCCCTTGAATGCCGATACCCTGCATCTGGTCAACGCCGAGCTGCTTGCCCTCGTACGGCCGGGCGCTCTGCTTGTAAACCCCTGTCGTGGCTCGGTAGTGGATGAAGCCGCCGTGCTCGCGGCGCTTGAGCGAGGCCAGCTCGGCGGGTATGCGGCGGATGTATTCGAAATGGAAGACTGGGCTCGCGCGGACCGGCCGCAGCAGATCGATCCTGCGCTGCTCGCGCATCCGAATACGCTGTTCACTCCGCACATAGGGTCGGCAGTGCGCGCGGTGCGCCTGGAGATTGAACGTTGTGCAGCGCAGAACATCCTCCAGGCATTGGCAGGTGAGCGCCCAATCAACGCTGTGAACCGTCTGCCCAAGGCCAATCCTGCCGCAGACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号11)
翻訳されたC*−PTDH:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMLPKLVITHRVHEEILQLLAPHCELITNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPDRVDADFLQACPELRVIGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGLGRHLRAADAFVRSGKFRGWQPRFYGTGLDNATVGFLGMGAIGLAMADRLQGWGATLQYHARKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTLHLVNAELLALVRPGALLVNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPQQIDPALLAHPNTLFTPHIGSAVRAVRLEIERCAAQNILQALAGERPINAVNRLPKANPAADLEHHHHHH(配列番号12)
構築物7
C*−DsRed
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTCCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号13)
翻訳されたC*−DsRed:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGSFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHHLFLLEHHHHHH(配列番号14)
構築物8
C*−β−Gal
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGACCATGATTACGGATTCACTCGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号15)
翻訳されたC*−β−Gal:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQKLEHHHHHH(配列番号16)
構築物9
C*−CAT
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号17)
翻訳されたC*−CAT:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFLKTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSSLWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANMDNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGALEHHHHHH(配列番号18)
構築物10
C*−MBP
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGGGACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号19)
翻訳されたC*−MBP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGLEHHHHHH(配列番号20)
構築物11
N−CBD:
ATGTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(配列番号21)
翻訳されたN−CBD:
MCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNKLGGGGSGGGGSASMKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQLEHHHHHH(配列番号22)
構築物12
NC1A−CBD:
ATGGCTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(配列番号23)
翻訳されたNC1A−CBD:
MALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNKLGGGGSGGGGSASMKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQLEHHHHHH(配列番号24)
構築物13
C−PTDH:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTCACCGAGTACACGAAGAGATCCTGCAACTGCTGGCGCCACATTGCGAGCTGATAACCAACCAGACCGACAGCACGCTGACGCGCGAGGAAATTCTGCGCCGCTGTCGCGATGCTCAGGCGATGATGGCGTTCATGCCCGATCGGGTCGATGCAGACTTTCTTCAAGCCTGCCCTGAGCTGCGTGTAATCGGCTGCGCGCTCAAGGGCTTCGACAATTTCGATGTGGACGCCTGTACTGCCCGCGGGGTCTGGCTGACCTTCGTGCCTGATCTGTTGACGGTCCCGACTGCCGAGCTGGCGATCGGACTGGCGGTGGGGCTGGGGCGGCATCTGCGGGCAGCAGATGCGTTCGTCCGCTCTGGCAAGTTCCGGGGCTGGCAACCACGGTTCTACGGCACGGGGCTGGATAACGCTACGGTCGGCTTCCTTGGCATGGGCGCCATCGGACTGGCCATGGCTGATCGCTTGCAGGGATGGGGCGCGACCCTGCAGTACCACGCGCGGAAGGCTCTGGATACACAAACCGAGCAACGGCTCGGCCTGCGCCAGGTGGCGTGCAGCGAACTCTTCGCCAGCTCGGACTTCATCCTGCTGGCGCTTCCCTTGAATGCCGATACCCTGCATCTGGTCAACGCCGAGCTGCTTGCCCTCGTACGGCCGGGCGCTCTGCTTGTAAACCCCTGTCGTGGCTCGGTAGTGGATGAAGCCGCCGTGCTCGCGGCGCTTGAGCGAGGCCAGCTCGGCGGGTATGCGGCGGATGTATTCGAAATGGAAGACTGGGCTCGCGCGGACCGGCCGCAGCAGATCGATCCTGCGCTGCTCGCGCATCCGAATACGCTGTTCACTCCGCACATAGGGTCGGCAGTGCGCGCGGTGCGCCTGGAGATTGAACGTTGTGCAGCGCAGAACATCCTCCAGGCATTGGCAGGTGAGCGCCCAATCAACGCTGTGAACCGTCTGCCCAAGGCCAATCCTGCCGCAGACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号25)
翻訳されたC−PTDH:
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMLPKLVITHRVHEEILQLLAPHCELITNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPDRVDADFLQACPELRVIGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGLGRHLRAADAFVRSGKFRGWQPRFYGTGLDNATVGFLGMGAIGLAMADRLQGWGATLQYHARKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTLHLVNAELLALVRPGALLVNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPQQIDPALLAHPNTLFTPHIGSAVRAVRLEIERCAAQNILQALAGERPINAVNRLPKANPAADLEHHHHHH(配列番号26)
構築物14
C*−A−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATGCGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号27)
翻訳されたC*−A−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNAFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号28)
構築物15
C*−D−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATGATTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号29)
翻訳されたC*−D−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNDFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHH
HHH(配列番号30)
構築物16
C*−L−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCTGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号31)
翻訳されたC*−L−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNLFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号32)
構築物17
C*−P−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCCGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号33)
翻訳されたC*−P−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNPFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号34)
構築物18
C*−R−GFP:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号35)
翻訳されたC*−R−GFP:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNRFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH(配列番号36)
翻訳されたC*−:
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASN(配列番号37)
ELPのアミノ酸配列:
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEF(配列番号38)
インテインN断片のアミノ酸配列:
ALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN(配列番号39)
C*−DNA:
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAAT
(配列番号40)
ELP−インテインN断片:
ATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC(配列番号41)。
翻訳されたELP−インテインN断片:
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH(配列番号42)
本研究で使用したプライマー:
NPUC_F_NDEI 104:
TTAGAAGGCATATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGG(配列番号43)。
OXP-NC-G-REV:
CCTCGCCCTTGCTCACATTGAAACAATTAGAAGCTATGAAGCCAT(配列番号44)。
OXP-GFP-NC-FWD:
ATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGG(配列番号45)。
XHOI_GFP_R:
TAAAATCTCGAGTAACTCGTCCATGCCGAGAG(配列番号46)。
NPUCD17G-F:
GGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTT(配列番号47)。
NPUCD17G-R:
GTCGCGCTCAACTCCAATGCCATAGACATT(配列番号48)。
HINDIII-LINK-NPU F:
CCTGGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGAC(配列番号49)。
NPUN_R_XHOI:
ATATAGCTCGAGATTCGGCAAATTATCAACCCG(配列番号50)。
NDEI-CBD-F:
TAATTTAACATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCT(配列番号51)。
HINDIII-CBD-R:
AAGATTAAAGCTTCTTGAAGCTGCCACAAGGCA(配列番号52)。
NHEI-C1A-F:
AATTAAGCTAGCGCCTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACA(配列番号53)。
ECORI-LINKER-NPUN F:
AATATGGGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGG(配列番号54)。
HINDIII-6H-NUPN- R:
GTACATTAAGCTTAGCAGCCGGATCTCAGT(配列番号55)。
NHEI-NPUC CFN-R:
ATTCGCGCTAGCATTGAAACAATTAGAAGCTATGAAGCC(配列番号56)。
XHOI_DSRED_R:
TAAAATCTCGAGCAGGAACAGGTGGTGGC(配列番号57)。
HINDII-L-DSRED-FWD:
TTCAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCGCCTCCTCCGAGGACG(配列番号58)。
NHEI-PTDH-F:
ATTTAACGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC(配列番号59)。
XHOI-PTDH12X-R:
AGTTTAGCTCGAGGTCTGCGGCAGGATTGG(配列番号60)。
NHEI-LACZ-F:
ATTTCAATGCTAGCATGACCATGATTACGGATTCACT(配列番号61)。
XHOI-LACZ-R:
TGATAATCTCGAGTTTTTGACACCAGACCAACTG(配列番号62)。
NHEI-CAT-F:
GTTTCAATGCTAGCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATAT(配列番号63)。
XHOI-CAT-R:
TAATAATTAACTCGAGCGCCCCGCCCTGCCAC(配列番号64)。
NHEI-MBP-F:
GTTTCAATGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCT(配列番号65)。
XHOI-MBP-R:
AAGTTATACTCGAGTCCCCTTCCCTCGATCC(配列番号66)。
Claims (58)
- 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
インテインC断片のC末端に融合したPOIを含む第1の融合タンパク質と、インテインN断片及び精製タグを含む第2の融合タンパク質とを接触させて、前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質との複合体を形成するステップと、
前記インテインC断片から前記POIを切断するステップであって、前記タンパク質を前記複合体から遊離させるステップと、
前記POIを単離するステップと
を含む、前記方法。 - インテインがスプリットインテインである、請求項1に記載の方法。
- インテインが、ノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)の天然にスプリットしたインテインDnaEである、請求項1に記載の方法。
- インテインが、シネコシスティス種のSsp、アファノティーキ・ハロフィチカのAha、アファニゾメノン・オバリスポラムのAov、アナバエナ種のAsp、アナバエナ・バリアビリスのAva、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイのCra(CS505)、シアノセイス(CyanotiIece)種のCsp(CCYOllO)、シアノセイス種のCsp(PCC8801)、クロコスファエラ・ワトソニイのCwa、ミクロシスチス・エルギノサのMaer(NIES843)、ミクロコレス・クソノプラステスのMcht(PCC7420)−2、オシラトリア・リムネティカのOli、シネココッカス・エロンガタスのSel(PC7942)、シネココッカス種のSsp(PCC7002)、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thernlosynechococcus elongates)のTel、トリコデスミウム・エリスラエウムのTer−3、及びサーモシネココッカス・ウルカヌス(Thernlosynechococcus vulcanus)のTvuからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- インテインC断片が、変異していないインテインC断片と比較してN末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、C末端切断速度及び効率を増加させる変異を有する、請求項1に記載の方法。
- インテインが、天然にスプリットしたインテインDnaEであり、C−インテイン断片が前記C−インテイン断片内にAsp118Gly変異を有する、請求項1に記載の方法。
- インテインC断片が、配列番号37のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが、インテインN断片のC末端にあるインテインスプリット接合部に位置する、請求項1に記載の方法。
- インテインN断片がN末端切断活性を消失させる変異を有する、請求項1に記載の方法。
- インテインN断片が、配列番号39のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが、キチン結合ドメイン(CBD)、6×ヒスチジン、マルトース結合ドメイン(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性タグである、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが、配列番号38からなる群から選択される親和性タグである、請求項1に記載の方法。
- 第2の融合タンパク質が、配列番号4、10、24及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 精製タグがエラスチン様ペプチド(ELP)である、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが、配列番号38のアミノ酸配列を含む沈降タグである、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが沈降タグであり、かつ
方法が
複合体を沈降させるステップと、
前記複合体を洗浄するステップと、
前記複合体を可溶化するステップと、
インテイン切断を誘導するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 複合体の沈降又は前記複合体の洗浄が、前記複合体と、1又は2以上の切断阻害剤とを接触させることを含む、請求項16に記載の方法。
- 精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が
複合体を前記親和性タグに結合することができる親和性樹脂に結合させるステップと、
切断ステップの前に前記複合体を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
インテイン切断を誘導するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 複合体の結合又は前記複合体の洗浄が、前記複合体と、1又は2以上の切断阻害剤とを接触させることを含む、請求項18に記載の方法。
- インテイン切断の誘導が、複合体と、1又は2以上の還元剤又はキレート剤とを接触させることを含む、請求項18に記載の方法。
- インテイン切断の誘導が、複合体と、エチレングリコールアミノエチルエステル四酢酸(EGTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ジピコリン酸(DPA)、ニトリロ三酢酸(NTA)からなる群から選択される1又は2以上のキレート剤とを接触させることを含む、請求項18に記載の方法。
- 切断を誘導する前に複合体を第1の洗浄緩衝液でインキュベートするステップをさらに含み、前記洗浄緩衝液が切断を阻害し、及び/又はZn2+、Cu2、Mg2+、Co2+、Mn2+及びFe2+からなる群から選択される切断阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 切断を誘導する前に複合体を第1の洗浄緩衝液で洗浄するステップをさらに含み、前記洗浄緩衝液がC末端切断反応を阻害する切断阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- C末端タンパク質切断の誘導が、硫黄誘導性C末端切断の誘導を含む、請求項1に記載の方法。
- C末端タンパク質切断の誘導が、DTT、Zn2+キレート剤、トリアルキルホスフィン(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、2−メルカプトエタノール、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される切断誘導剤の存在下で硫黄誘導性C末端切断の誘導を含む、請求項1に記載の方法。
- C末端タンパク質切断の誘導が、キレート剤を使用した切断阻害剤をキレートすることによるインテイン切断の誘導を含む、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が、複合体を親和性樹脂に結合させるステップをさらに含み、前記複合体からのPOIの分離が、前記複合体が結合した前記親和性樹脂からPOIを分離することを含む、請求項1に記載の方法。 - 精製タグが沈降タグであり、かつ
方法が
複合体を沈降させるステップであって、沈降した複合体を形成し、
前記複合体からのPOIの分離が前記沈降した複合体の可溶化を含み、可溶化した複合体を形成するステップと、
前記可溶化した複合体から前記POIを分離するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 第2の融合タンパク質からインテインC断片を解離することによって前記第2の融合タンパク質を再生するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- POIが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、DNA結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、構造タンパク質、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が
C末端タンパク質切断を誘導する前に複合体を親和性樹脂に結合させるステップと、
第2の融合タンパク質からインテインC断片を解離することによって前記親和性樹脂を再生するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 第2の融合タンパク質からインテインC断片を解離することによって前記第2の融合タンパク質を再生するステップと、前記再生した第2の融合タンパク質と第1の融合タンパク質とを再度接触させるステップとをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが親和性タグであり、かつ第2の融合タンパク質が、キチンビーズ、ニッケル樹脂、アミロース樹脂、グルタチオン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性樹脂に結合される、請求項1に記載の方法。
- 精製タグが、第2の融合タンパク質の沈降を媒介する沈降タグであり、かつ複合体が沈降される、請求項1に記載の方法。
- 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
前記POI及びインテインC断片を含む第1の融合タンパク質を提供するステップであって、前記POIが前記インテインC断片のC末端に融合し、前記インテインが天然にスプリットしたインテインDnaEであり、前記インテインC断片が前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有するステップと、
インテインN断片及び精製タグを含む第2の融合タンパク質を提供するステップであって、前記精製タグを前記インテインN断片のC末端にあるインテインスプリット接合部に挿入し、前記インテインN断片がN末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第2の融合タンパク質が前記精製タグに結合する樹脂に付着し、前記精製タグが精製樹脂に特異的に結合することができ、前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記POIと前記インテインC断片との間の前記第1の融合タンパク質のC末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記POIと前記インテインC断片との間の前記第1の融合タンパク質のC末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記POIを遊離させるステップと、
前記第1の融合タンパク質及び前記インテインC断片のC末端から前記POIを分離するステップと
を含む、前記方法。 - 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
POI及びインテインC断片を含む第1の融合タンパク質を提供するステップであって、前記POIが前記インテインC断片のC末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインDnaEであり、前記インテインC断片が前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有するステップと、
インテインN断片及び沈降タグを含む第2の融合タンパク質を提供するステップであって、前記沈降タグをインテインN断片のC末端であるインテインスプリット接合部に挿入し、前記インテインN断片がN末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記POIと前記インテインC断片との間の第1の融合タンパク質のC末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記第1融合タンパク質と、前記第2融合タンパク質との複合体を沈降させるステップと、
低塩緩衝液中で前記複合体を可溶化するステップと、
前記POIと前記インテインC断片との間の前記第1融合タンパク質のC末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記POIを遊離させるステップと、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質の前記複合体から2回目の沈降によって前記POIを分離するステップと
を含む、前記方法。 - 所望のタンパク質(POI)及びインテインC断片を含む融合タンパク質であって、前記POIが、前記インテインC断片のC末端に融合し、前記インテインが、天然にスプリットしたインテインDnaEであり、前記インテインC断片が、前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有する、前記融合タンパク質。
- 配列番号39を含む、請求項37に記載の融合タンパク質。
- POIが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、DNA結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項37に記載の融合タンパク質。
- インテインN断片及び精製タグを含む融合タンパク質であって、前記精製タグが、前記インテインN断片のC末端であるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインN断片が、N末端切断活性を消失させる変異を有する、前記融合タンパク質。
- 配列番号39を含む、請求項40に記載の融合タンパク質。
- 配列番号4、10、24又はそれらの組み合わせを含む、請求項40に記載の融合タンパク質。
- プロモーターに作動可能に結合したインテインC断片のC末端をコードする第1のDNAエレメントを含むベクターであって、
前記インテインC断片が、変異していないインテインC断片と比較してN末端切断を抑制し、C末端切断を増加させる変異を有し、所望のタンパク質(POI)をコードする第2のDNAエレメントの前記インテインC断片の前記C末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する前記ベクター。 - インテインが、ノストック・パンクチフォルメの天然にスプリットしたインテインDnaEであり、C−インテイン断片が前記C−インテイン断片内にAsp118Gly変異を有する、請求項43に記載のベクター。
- 第1のDNAエレメントが配列番号37のアミノ酸配列をコードする、請求項43に記載のベクター。
- 第1のDNAエレメントが配列番号40を含む、請求項43に記載のベクター。
- POIが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、DNA結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項43に記載のベクター。
- プロモーターに作動可能に結合したインテインN断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードするDNAエレメントを含むベクターであって、
前記精製タグが、前記インテインN断片のC末端であるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインN断片が、N末端切断活性を消失させる変異を有する、前記ベクター。 - 精製タグが親和性タグである、請求項48に記載のベクター。
- 精製タグが沈降タグである、請求項48に記載のベクター。
- DNAエレメントが配列番号23又は配列番号41を含む、請求項48に記載のベクター。
- 所望のタンパク質(POI)を単離するためのキットであって、
プロモーターに作動可能に結合したインテインC断片のC末端をコードする第1のDNAエレメントを含む第1のベクターであって、前記インテインC断片が変異していないインテインC断片と比較してN末端切断を抑制し、C末端切断を増加させる変異を有し、前記第1のベクターがPOIをコードする第2のDNAエレメントの前記インテインC断片のC末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第1のベクターと、
プロモーターに作動可能に結合したインテインN断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第2のDNAエレメントを含む第2のベクターであって、前記精製タグが、前記インテインN断片のC末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインN断片がN末端切断活性を消失させる変異を有する第2のベクター;又はインテインN断片及び前記インテインN断片のC末端にあるインテインスプリット接合部に位置する精製タグを含む融合タンパク質であって、前記インテインN断片が、N末端切断活性を消失させる変異を有する融合タンパク質と、
前記POIをコードするDNAエレメントを前記第1のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、
前記POIを単離するための指示書と
を含む、前記キット。 - 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
インテインC断片のC末端に融合した前記POIを含む第1の融合タンパク質と、インテインN断片及び精製タグを含む第2の融合タンパク質とを接触させて前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質との複合体を形成するステップであって、前記インテインC断片が変異していないインテインC断片と比較してN末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、C末端切断速度及び効率を増加させる変異を有するステップと、
前記インテインC断片から前記POIを切断するステップであって、前記タンパク質を複合体から遊離させるステップと、
前記POIを単離するステップと
を含む、前記方法。 - インテインが、天然にスプリットしたインテインDnaEであり、C−インテイン断片が前記C−インテイン断片内にAsp118Gly変異を有する、請求項1に記載の方法。
- 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
前記POI及びインテインC断片を含む第1の融合タンパク質を提供するステップであって、前記POIが、前記インテインC断片のC末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインDnaEであり、前記インテインC断片は前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有するステップと、
インテインN断片及び精製タグを含む第2の融合タンパク質を提供するステップであって、前記インテインN断片が、N末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第2の融合タンパク質が精製タグに結合する樹脂に付着し、前記精製タグが、精製樹脂に特異的に結合することができ、前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記POIと前記インテインC断片との間の前記第1の融合タンパク質のC末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記POIと前記インテインC断片との間の前記第1の融合タンパク質のC末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記POIを遊離させるステップと、
前記第1の融合タンパク質及び前記インテインC断片のC末端から前記POIを分離するステップと
を含む、前記方法。 - 所望のタンパク質(POI)及びインテインC断片を含む融合タンパク質であって、前記POIが前記インテインC断片のC末端に融合し、前記インテインが天然にスプリットしたインテインDnaEであり、前記インテインC断片が前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有する融合タンパク質。
- 所望のタンパク質(POI)を単離するためのキットであって、
プロモーターに作動可能に結合したインテインC断片のC末端をコードする第1のDNAエレメントを含む第1のベクターであって、前記インテインC断片が前記インテインC断片内にAsp118Gly変異を有し、前記第1のベクターがPOIをコードする第2のDNAエレメントの前記インテインC断片のC末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第1のベクターと、
プロモーターに作動可能に結合したインテインN断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第2のDNAエレメントを含む第2のベクター;又はインテインN断片及び精製タグを含む融合タンパク質と、
前記POIをコードするDNAエレメントを前記第1のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、
前記POIを単離するための指示書と
を含む、前記キット。 - 所望のタンパク質(POI)の精製方法であって、
インテインC断片のC末端に融合した前記POIを含む第1の融合タンパク質と、インテインN断片及び精製タグを含む第2の融合タンパク質とを接触させて、前記第1の融合タンパク質と、前記第2の融合タンパク質との複合体を形成するステップであって、前記精製タグが、前記インテインN断片のC末端であるインテインスプリット接合部に位置するステップと、
前記インテインC断片から前記POIを切断するステップであって、前記タンパク質を前記複合体から遊離させるステップと、
前記POIを単離するステップと
を含む、前記方法。
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KR20160118184A (ko) * | 2016-09-29 | 2016-10-11 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 |
KR101690186B1 (ko) | 2016-09-29 | 2016-12-28 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 |
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