CN113735941B - 一种蛋白纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明设计了一种新型的内含肽，该内含肽含有两个部分，分别为连接聚集标签的N端(IN)和连接目的蛋白的C端(IC)，当两者混合之后，在适当的条件下发生切割反应，获得目的蛋白，而内含肽与聚集标签发生聚集反应，留在沉淀中，可通过离心去除。本发明的新型内含肽具有较高的切割效率，而且能够通过调节pH值控制切割率，实现在3个小时就可完成切割，并且当pH6.0时最高切割率达到98％；本发明将新型内含肽与聚集标签相结合，对目的蛋白具有更高的纯化效率，达到52～56％。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
目前已有许多研究中尝试运用重组技术在工程菌中生产重组蛋白，然而，重组蛋白的纯化难度往往是实现其在临床及商业应用中的一大阻碍。在实验室范围内，许多亲和标签如His-tag，几丁质结合蛋白(CBD)，麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽转移酶(GST)等，由于它们的高特异性而得到了广泛的利用，发展成为成熟的亲和层析方法。虽然这些方法已被证实可以获得高浓度的重组蛋白，但树脂昂贵的价格使其在大规模纯化中的应用受到了阻碍。与此同时，亲和标签的存在可能会干扰目的蛋白的整体生化特性，因此我们有必要在下游流程中应用额外的步骤，以去除亲和标签，获得无氨基酸残留的天然蛋白。在这种复杂的情况下，基于内含肽的自裂解性质设计而成的非色谱纯化方法具备极大的应用潜力。
内含肽是一类具备自剪接特性的蛋白元件，它能够将自身从前体蛋白中移除并连接其侧翼序列(即外显肽)。在实际纯化应用中，通过突变关键残基，内含肽也可以在不剪接的情况下仅进行N端或C端切割反应。基于此，内含肽可以被遗传编码到重组蛋白序列中，根据需要提供标签的定点自切割。New England Biolabs Inc.(NEB)开发了第一批用于生物分离的内含肽，他们改造了来自酿酒酵母液泡ATP酶亚基的Sce VMA内含肽，将其插入亲和标签CBD与目的蛋白之间，使用硫醇试剂诱导完成N端切割反应(Brenzel,S.,Kurpiers,T.,and Mootz,H.D.(2006).Engineering artificially split inteins for applicationsin protein chemistry:Biochemical characterization of the split Ssp DnaBintein and comparison to the split Sce VMA intein.Biochemistry 45,1571-1578.)，室温反应16h后切割效率超过95％，由此发展为商业化的IMPACTTM系统，之后又在此基础上加入了Mxe GyrA 内含肽和Ssp DnaB内含肽，扩展为IMPACT KITTM(Lahiry,A.,Fan,Y.M.,Stimple,S.D.,Raith,M.,and Wood,D.W.(2018).Inteins as tools for taglessand traceless protein purification.J.Chem.Technol.Biotechnol.93,1827-1835)。在之后的发展中，Xia等人(Xia,H.F.,Zhou,T.J.,Du,Y.X.,Wang,Y.J.,Shi,C.H.,and Wood,D.W.(2020).Improved protein purification system based on C-terminal cleavageof Npu DnaE split intein.Bioprocess.Biosyst.Eng.,11.)将Npu DnaE内含肽与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联，添加50mmol·L-1DTT诱导内含肽断裂，4h后反应基本完成，GFP回收率为37％。然而，在此类内含肽的应用中发现，内含肽在纯化过程中大多需要添加硫醇试剂，且回收率较低，造成了产物的部分损失；并且现有的纯化方法存在纯化周期长等缺点。
发明内容
为了解决现有内含肽纯化技术当中存在的纯化周期长，回收率低，且大多需要添加硫醇试剂等缺点，本发明设计了一种新型的内含肽，该内含肽含有两个部分，分别为连接聚集标签的N端(IN)和连接目的蛋白的C端(IC)，当两者混合之后，在适当的条件下发生切割反应，获得目的蛋白，而内含肽与聚集标签发生聚集反应，留在沉淀中，可通过离心去除。
本发明提供了一种断裂内含肽，所述断裂内含肽包含N端内含肽IN和C端内含肽IC，所述N端内含肽IN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述C端内含肽IC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述N端内含肽IN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述C端内含肽IC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种亲和配基，所述亲和配基为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN-ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种蛋白纯化工具，所述纯化工具包括亲和配基、亲和标签；所述亲和配基为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN-ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；
所述亲和标签为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的C端内含肽作为亲和标签，将目的蛋白的N端与亲和标签连接。
本发明还提供了上述断裂内含肽在目的蛋白纯化中的应用。
本发明还提供了一种蛋白纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将N端内含肽与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN-ELP；将C端内含肽作为亲和标签，与目的蛋白融合，制备得到N端融合了C端内含肽的IC-目的蛋白；
(2)将IC-目的蛋白，与亲和配基IN-ELP混合，使IN-ELP结合IC-目的蛋白，得到混合液；向混合液中添加氯化钠溶液进行孵育后离心取沉淀，将沉淀用pH 8.0-10.0的结合缓冲液重悬后离心取上清液；将上清液与氯化钠溶液进行二次孵育后离心，收集沉淀；
(3)将步骤(2)得到的沉淀采用切割缓冲液重悬后，在25-37℃，并将切割缓冲液的pH调节至6.0～7.0的条件下进行反应后，添加氯化钠溶液进行孵育，孵育结束后离心，得到含有纯化后的目的蛋白的上清液；所述切割缓冲液为磷酸缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，是将纯化后的亲和配基IN-ELP与IC-目的蛋白进行混合，具体的纯化方法：
1)取含有IN-ELP的上清液样品，在50mL离心管中加入相应体积4M氯化钠溶液至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中孵育10min使IN-ELP发生相变反应；孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，10000rpm、37℃离心10min,离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之；保留沉淀。
2)将1)所得沉淀用预冷的结合缓冲液(pH 9.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使IN-ELP发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；4℃、12000rpm离心10min，离心结束后得到含有较纯IN-ELP的上清液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)具体包括以下步骤：
1)使用含有IC-目的蛋白的上清液样品，与预纯化步骤得到的上清液混合，使IN-ELP结合IC-目的蛋白。
2)在1)所得混合液中加入相应体积4M氯化钠溶液至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中孵育15min使融合蛋白发生相变反应；孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，10000rpm、37℃离心10min，离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之。
3)将2)所得沉淀用预冷的结合缓冲液(pH 9.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；4℃、12000rpm离心10min，离心结束后得到含有较纯融合蛋白的上清液。
4)向离心管中加入相应体积4M氯化钠溶液至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中孵育10min使融合蛋白发生相变反应；孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，12000rpm、37℃离心10min，离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之；收集沉淀。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)具体包括以下步骤：
含有融合蛋白的沉淀用预冷的切割缓冲液(pH 6.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；置于30℃恒温水浴锅中孵育3h，使融合蛋白发生断裂反应。反应结束后取样进行蛋白凝胶电泳分析。向孵育液中加入相应体积4M氯化钠溶液，至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中孵育10min；孵育完毕，将离心管放入预热好的离心机中12000rpm、37℃离心10min，最终收集含有纯化目的蛋白的上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为：增强型绿色荧光蛋白或华根霉脂肪酶。
在本发明的一种实施方式中，亲和配基IN-ELP的制备方法为：
(1)分别在N端内含肽、ELP蛋白两端添加EcoRI、NdeI和SacI酶切位点后插入到载体pET28a的EcoRI和SacI位点中，制备得到在ELP的N端融合IN的重组质粒；
(2)将重组质粒转入宿主细胞中，得到表达融合蛋白的重组菌株，将重组菌株发酵制备得到亲和配基IN-ELP。
在本发明的一种实施方式中，所述IC-目的蛋白的制备方法为：
(1)化学合成目的蛋白的碱基序列；
(2)分别使用引物将IC序列与目的蛋白片段插入到载体pET28a中，制备得到含有N端融合了C端内含肽的目的蛋白的重组质粒；
(3)将重组质粒转入宿主细胞中，得到表达N端融合了C端内含肽的目的蛋白的重组菌株，将重组菌株发酵制备得到N端融合了C端内含肽的目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述结合缓冲液是采用Tris-HCl缓冲液进行配制。
本发明还提供了上述断裂内含肽，或上述亲和配基，或上述蛋白纯化工具，或上述方法在目的蛋白纯化中的应用。
有益效果
(1)本发明的新型内含肽具有较高的切割效率，而且能够通过调节pH值控制切割率，在不添加硫醇试剂的前提下，实现在3个小时就可完成切割，并且，当pH 6.0时最高切割率达到98％；相比亲和纯化方法，无需价格昂贵的亲和纯化柱，具有成本低的突出优势。
(2)本发明将新型内含肽与聚集标签相结合，对目的蛋白具有更高的纯化效率，达到52～56％，对比Xia等人(Xia,H.F.,Zhou,T.J.,Du,Y.X.,Wang,Y.J.,Shi,C.H.,andWood,D.W.(2020).Improved protein purification system based on C-terminalcleavage of Npu DnaE split intein.Bioprocess.Biosyst.Eng.,11.)文章中所公开的对绿色荧光蛋白的纯化率，本发明的纯化率提高了51.35％。
附图说明
图1：本发明的新型内含肽在不同pH条件下的切割效率比较图。
图2：含有IN-ELP的细胞破碎液的SDS-PAGE电泳图；其中，WL为：E.coli BL21(DE3)/pETIN-ELP的细胞破碎液，CL为：该细胞破碎液离心后的上清液，PL为：该细胞破碎液离心后的沉淀，M为：Marker。
图3：含有IC-EGFP的细胞破碎液的SDS-PAGE电泳图；其中，WL为：E.coli BL21(DE3)/pETIC-EGFP的细胞破碎液，CL为：该细胞破碎液离心后的上清液，PL为：该细胞破碎液离心后的沉淀，M为：Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的限定。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
TB液体培养基：酵母提取物24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4mL/L，磷酸二氢钾2.31g/L，三水合磷酸氢二钾16.42g/L。
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
下述实施例中所涉及的溶液的配制方法如下：
结合缓冲液配制：称取2.42g Tris和8.766g氯化钠置于烧杯中，加入约900mL去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节溶液pH值至9.0，定容至1L后备用。
切割缓冲液配制：称取0.231g磷酸氢二钠和1.594g磷酸二氢钾，加入去离子水定容至100mL，充分搅拌溶解后检测pH(按需配置)保存备用。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
内含肽切割效率的检测方法：
内含肽切割效率的计算公式如下：内含肽切割效率＝断裂后的目的蛋白对应条带的含量/(断裂后的目的蛋白对应条带的含量+未断裂的前体蛋白对应条带的含量)×100％。
目的蛋白回收率的检测方法：
目的蛋白回收率的计算公式如下：回收率＝最终回收得到的上清液中蛋白浓度/最初混合液中IC-目的蛋白的浓度×100％。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1引物列表
实施例1：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的纯化
本发明中结合使用温度依赖型聚集标签ELP和pH敏感型断裂标签内含肽，构建内含肽介导的类弹性多肽纯化系统，从而获得无多余氨基酸残基的目的蛋白；具体将N端内含肽(IN)与ELP进行融合后视作亲和介质，C端内含肽(IC)则可以作为亲和标签，融合待纯化目的蛋白。
具体步骤如下：
1.重组菌株的构建
1.1重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETIN-ELP的构建
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的IN序列，并在IN序列两端添加EcoRI和NdeI酶切位点；由上海生工生物股份有限公司合成。
(2)化学合成氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的ELP片段，并在两端添加NdeI和SacI位点；由上海生工生物股份有限公司合成；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的片段插入载体pET28a的EcoRI和SacI位点中，得到在ELP的N端融合IN的重组质粒pETIN-ELP。
将上述重组质粒测序无误后，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，构建得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETIN-ELP。
1.2重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETIC-EGFP的构建
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的EGFP片段和核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示C端内含肽IC片段；
(2)分别使用两对引物F1IC-EGFP、R1IC-PET和F2PET、R2PET，将C端内含肽IC片段与EGFP片段插入到载体pET28a中，得到EGFP的N端融合IC的重组质粒IC-EGFP；
(3)将上述重组质粒测序无误后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，构建得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETIC-EGFP。
2.重组蛋白的诱导表达
具体步骤如下：
(1)重组菌株的种子液的制备：
将步骤1制备得到的重组菌株划线活化，接种单克隆于含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm的条件下培养10-12h；分别制备得到种子液；
(2)分别将上述种子液按照1％(v/v)的比例接种至含有浓度为50μg/mL卡那霉素的100mL TB/LB液体培养基中(其中，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETIN-ELP的培养是采用TB液体培养基进行培养；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETIC-EGFP的培养是采用LB液体培养基进行培养)，分别在37℃，200rpm的条件下培养至OD600为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol·L-1，在18℃，200rpm的条件下培养16h后结束，分别制备得到发酵液；
(3)分别将发酵液置于4℃、9000rpm条件下离心10min后收集菌体，将收集得到的菌体采用生理盐水洗涤1～2次称重后，以1:20(w/v)的比例，使用结合缓冲液(pH＝9.0)重悬菌体，冰浴条件下进行超声破碎(功率39％，超声2s暂停3s，10-15min)，于4℃、10000rpm条件下离心30min后收取上清液备用。
分别制备得到含有IN-ELP的上清液和含有IC-EGFP的上清液；分别对上述上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2～3所示，结果证明上述重组蛋白均表达成功。
3.重组蛋白的胞外结合
3.1IN-ELP预纯化
(1)取含有IN-ELP的上清液样品40mL，在50mL离心管中添加与IN-ELP的上清液体积比为3:5的比例的4M氯化钠溶液，至溶液中氯化钠的终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中进行孵育10min使IN-ELP发生相变反应；孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，10000rpm、37℃离心10min，离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之；保留沉淀。
(2)将(1)所得沉淀用预冷的结合缓冲液(pH 9.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使IN-ELP发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；然后将溶液置于4℃、12000rpm离心10min，离心结束后得到含有较纯IN-ELP的上清液。
3.2加入IC-EGFP共纯化
(1)使用含有IC-EGFP的上清液样品，与上述经预纯化步骤得到的IN-ELP上清液混合，使IN-ELP结合IC-EGFP，得到混合液。
(2)在(1)所得混合液中按照与混合液体积比为3:5的比例加入4M氯化钠溶液，至溶液中氯化钠的终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中进行一次孵育，时间为15min，使融合蛋白发生相变反应；一次孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，10000rpm、37℃离心10min，离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之，取沉淀。
(3)将(2)所得沉淀用预冷的结合缓冲液(pH 9.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；4℃、12000rpm离心10min，离心结束后得到含有较纯融合蛋白的上清液。
(4)向含有步骤(3)制备得到的上清液的离心管中加入4M氯化钠溶液，至溶液中氯化钠终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中进行二次孵育，孵育时间为10min，使融合蛋白发生相变反应；二次孵育完毕，立即将离心管放入预热好的离心机中，12000rpm、37℃离心10min，离心结束，迅速取出离心管，用力甩出管里的上清液弃之；收集沉淀。
4.结合蛋白在改变条件下进行切割反应
(1)将步骤3制备得到的含有融合蛋白的沉淀，用预冷的切割缓冲液(pH为6.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；置于30℃恒温水浴锅中孵育3h，使融合蛋白发生断裂反应。反应结束后取样进行蛋白凝胶电泳分析(在切割反应全过程中取样，通过电泳可分析得到切割反应的进行情况)，得到反应完成后的溶液；
(2)向步骤(1)制备得到的溶液中加入4M氯化钠溶液至终浓度为1.5M，轻轻上下翻转混匀，置于37℃恒温水浴锅中孵育10min；孵育完毕，将离心管放入预热好的离心机中12000rpm、37℃离心10min，最终收集含有纯化目的蛋白的上清液，经计算，切割率为98.17％；
将最终回收得到的上清液与最初IN-ELP结合IC-EGFP的混合液进行蛋白浓度对比，得到该设计纯化EGFP的回收率为56％。
实施例2：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的纯化方法的优化
具体步骤同实施例1，区别在于，分别调整步骤4中的切割缓冲液的pH为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0；在不同pH(5.0-9.0)条件下切割时，在切割反应的开始与结束分别取样进行电泳，电泳结束后，将胶图通过ImageJ软件分析，得出不同pH条件下未断裂的IC-EGFP和断裂后的EGFP相对应条带的含量，进而计算不同pH条件的切割效率；对于目的蛋白绿色荧光蛋白的切割结果如表2及图1所示。
表2：本发明的新型内含肽在不同pH条件下的切割效率
| pH | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 | 8.5 | 9.0 |
| 切割效率(％) | 51.59 | 50.69 | 98.17 | 96.13 | 87.41 | 66.13 | 46.66 | 35.23 | 23.17 |
结果显示，计算得到本发明的新型内含肽在pH＝6.0时切割效率最高，可超过98％。
将pH为6.5，7.0的反应液待切割反应结束后，再进行相变，最终收集含有纯化目的蛋白的上清液。经计算，得到pH为6.5时，该设计纯化EGFP的回收率为54.8％；pH为7.0时，该设计纯化EGFP的回收率为50％。
可见，采用本发明的技术方案，能够实现在不添加硫醇试剂及无需价格昂贵的亲和纯化柱的条件下，3个小时内完成切割，并且蛋白回收率(蛋白纯化率)可高达50％以上，切割效率在87％以上。
实施例3：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的纯化方法的优化
具体步骤同实施例1，区别在于，分别调整步骤4结合蛋白在改变条件下进行切割反应中的反应孵育温度为25℃和37℃；即：调整为，将步骤3制备得到的含有融合蛋白的沉淀，用预冷的切割缓冲液(pH为6.0)轻柔地重悬(尽量减少气泡的产生)，使融合蛋白发生可逆相变由沉淀状态变回可溶状态；分别置于25℃和37℃恒温水浴锅中进行孵育，孵育3h后最终收集含有纯化目的蛋白的上清液。
经计算，切割反应条件为25℃，pH＝6.0时，切割效率为95.73％，该设计纯化EGFP的回收率为54.7％；
切割反应条件为37℃，pH＝6.0时，切割效率为98.03％，纯化EGFP的回收率为56％。
实施例4：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的纯化方法的优化
具体步骤同实施例1，区别在于，分别调整步骤2与步骤3涉及的结合缓冲液的pH分别为8.0，10.0。
结果为：结合缓冲液的pH为8.0时，EGFP的回收率为44％；
结合缓冲液的pH为10.0时，EGFP的回收率达到55％。
实施例5：脂肪酶的纯化
本发明的蛋白纯化方法适用于任何蛋白，没有特殊的选择性，本实施例仅以脂肪酶为目的蛋白，使用该无固相载体纯化方法纯化脂肪酶。
具体步骤同实施例1，区别在于，调整目的蛋白为脂肪酶(GenBank:ABN59381.2)，其中，重组菌株BL21/pETIC-RCL的构建引物如表1所示。
结果显示：脂肪酶的回收效率达到52％，并且能在3个小时完成切割，切割效率≥98％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种蛋白纯化方法及其应用
<130> BAA211063A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Ser Thr Val Tyr Thr
20 25 30
Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His
35 40 45
Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Gln
85 90 95
Val Asp Gly Leu Pro
100
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val Tyr Gly
1 5 10 15
Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly Leu Val
20 25 30
Ala His Asn
35
<210> 3
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgctgagct acgataccga aatcctgacc gttgaatacg gcttcctgcc gatcggcaaa 60
atcgttgaag aacgtatcga aagcaccgtt tacaccgttg ataaaaacgg tttcgtttac 120
acccagccga tcgcgcagtg gcacaaccgt ggtgaacagg aagttttcga atacagcctg 180
gaagatggca gcatcatccg tgcgaccaaa gatcacaaat tcatgaccac cgatggtcag 240
atgctgccga tcgatgaaat cttcgaacgt ggcctggatc tgaaacaggt tgatggcctg 300
ccg 303
<210> 4
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttaaaatca tcagccgtaa aagcctgggc acccagaacg tttacggtat cggcgttgaa 60
aaagatcaca acttcctgct gaaaaacggc ctggttgcgc acaac 105
<210> 5
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
20 25 30
Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
35 40 45
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
50 55 60
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
85 90 95
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
100 105 110
Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
115 120 125
Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
130 135 140
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
165 170 175
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
180 185 190
Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
195 200 205
Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
210 215 220
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
245 250 255
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
260 265 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
275 280 285
Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
290 295 300
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
305 310 315 320
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
325 330 335
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
340 345 350
Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
355 360 365
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
370 375 380
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
405 410 415
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
420 425 430
Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
435 440 445
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
450 455 460
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
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gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
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ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
Claims (5)
1.一种蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽与氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN-ELP；将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的C端内含肽IC作为亲和标签，与目的蛋白融合，制备得到N端融合了C端内含肽的IC-目的蛋白；
（2）将IC-目的蛋白与亲和配基IN-ELP混合，使IN-ELP结合IC-目的蛋白，得到混合液；向混合液中添加氯化钠溶液进行孵育后离心取沉淀，将沉淀用pH 9.0的结合缓冲液重悬后离心取上清液；将上清液与氯化钠溶液进行孵育后离心，收集沉淀；
（3）将步骤（2）得到的沉淀采用切割缓冲液重悬，在37℃，pH 6.0条件下进行反应后，添加氯化钠溶液进行孵育，孵育结束后离心，得到的含有纯化后目的蛋白的上清液；所述切割缓冲液为磷酸缓冲液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述N端内含肽IN的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；编码所述C端内含肽IC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为：增强型绿色荧光蛋白或脂肪酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，亲和配基IN-ELP的制备方法为：
（1）分别在N端内含肽IN、ELP蛋白添加酶切位点后，插入到载体pET28a中，制备得到在ELP的N端融合IN的重组质粒；
（2）将重组质粒转入宿主细胞中，得到表达融合蛋白的重组菌株，将重组菌株发酵制备得到亲和配基IN-ELP。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述IC-目的蛋白的制备方法为：
（1）化学合成目的蛋白片段；
（2）分别使用引物将IC序列与目的蛋白片段插入到载体pET28a中，制备得到含有N端融合了C端内含肽的目的蛋白的重组质粒；
（3）将重组质粒转入宿主细胞中，得到表达N端融合了IC的目的蛋白的重组菌株，将重组菌株发酵制备得到N端融合了IC的目的蛋白。
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| Publication number | Publication date |
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