CN102373234A - 一种内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用内含肽介导的类弹性蛋白(ELPs)纯化重组药物蛋白的方法。本方法基于类弹性蛋白(ELPs)的温度依赖的相变特性和内含肽的标签自切割功能，利用二者的结合开发出一种无需亲和介质和标签切除酶的方法，此方法操作简单，成本低廉，具有极好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组药物蛋白的纯化方法，更具体地讲，涉及一种利用内含肽介导的类弹性蛋白通过非色谱方法纯化重组蛋白药物的方法。
背景技术
90年代以来，基因重组技术得到很大的发展，特别是近年来随着对蛋白质研究和生产的需要，基因重组技术突飞猛进，出现了很多基因工程产品，深刻的影响着我们人类自身及其环境。而作为基因技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示出其重要性。基因工程产品分离纯化的成本约占其全部成本的60％～80％，因此对于蛋白质高效制备新技术和新策略的研究变的极其紧迫与重要。
在现代蛋白质的分离纯化中，层析技术运用的最广泛。离子交换层析、凝胶层析、疏水层析和亲和层析是人们用的最多的层析方法，其中亲和层析对于重组蛋白的分离纯化应该是目前应用最广泛的一种简单的分离方法，即将与相应配基的特异性结合的亲和标签融合到重组蛋白上进行表达，这样目的蛋白就能专一的与结合有配基的介质进行吸附。基于这种专一的结合作用，单步的纯化步骤就可以很容易有效的分离和纯化出我们需要的目的蛋白。这样的分离方法结合效率高、分离速度快、特异性高，分离得到的蛋白纯度也高。亲和层析按配基不同可分为：金属螯合介质、小配体亲和介质、抗体亲和介质、颜料亲和介质、外源凝集素亲和介质，目前用的最好最广泛的是金属螯合介质。但是，用这种传统的亲和标签的方法仍然有两个较大的不足。第一，标签必须要除去。标签的除去一般用酶解法，即在构建重组DNA时在标签和目的蛋白间引入酶切位点，表达后再用相应的酶将标签除去。这种方法虽然有效，但蛋白酶的价格昂贵不适合用于大规模的应用。另外，由于非特性的剪切或是剪切不完全会引起目的产品的大量损失，而且在最后还要多一步蛋白和标签的除去步骤。基于这些原因，最后我们得到的蛋白是很少的。第二，树脂和分离设备的价格昂贵，这就使得整个成本的提高，使得大规模回收和纯化蛋白质显得仍然很昂贵和困难。特别地，在医药和酶工业方面要求更高，它们要求制备出的是高纯度高活性药物蛋白，为了满足日益增长的需要，蛋白分离纯化的方法就必须从高效、可靠、稳定、低成本方面进行研究。
基于这些原因，避免最后亲和标签酶的处理和昂贵的亲和树脂的分离方法在重组蛋白的快速高效制备方面具有很大意义。本发明就针对上述这两点，开发出一种无需酶也无需昂贵介质的纯化方法。
类弹性蛋白(Elastin-like polypeptides(ELPs))是一类人工合成的生物大分子.由五肽重复序列单元VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，Xaa可以是除了Pro以外的任意一种氨基酸，来源于哺乳动物的弹性蛋白序列VPGVG)组成。ELPs具有温度依赖性，即它存在一个相变温度，我们称之为反转相变温度(Tt，inverse transition temperature)，ELPs的相变一般就发生在2～3℃的范围内，低于Tt，ELPs是一个单体且高度可溶，然而，当温度高于Tt时，ELPs会沉淀而不可溶。Tt的高低与ELPs链的长度、链的组成、Xaa的种类、缓冲液体系以及盐溶度有关。比如，当链长，盐浓度高时，Tt温度就低。由于ELPs具有很好的生物相容性，并且已证明ELPs的融合蛋白也具有与ELPs相似的性质，所以基于ELPs的生物相容性和依赖温度的相变的性质，ELPs可以作为分离重组蛋白一种很好的工具。
内含肽(intein)是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，同时将两端的蛋白质外显肽(extein)连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程。内含肽以其独特的蛋白质自剪切功能而被广泛应用于蛋白质工程领域。
Survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的一个新成员，人Survivin基因位于第17号染色体的q25带上，Survivin的主要功能是抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖，并参与细胞有丝分裂的调控。Survivin在绝大多数的肿瘤细胞中都有高表达，而在成人中除胸腺、睾丸、分泌期子宫内膜、神经干细胞外，正常组织中均无表达。在对绝大多数实体瘤(乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、组织肉瘤等)进行研究后发现，Survivin的表达水平可以提供有关肿瘤的预后信息。目前以Survivin作为靶点的肿瘤治疗、诊断及预后判断研究成为抗肿瘤研究中一个热点。本实验室成功构建了以Survivin为药靶的促癌细胞凋亡的重组蛋白药物TAT-Survivin(T34A)(参见文献Ma Xingyuan，et al.，Journal ofBiotechnology，2006，123：367-378)，而此蛋白在制备过程中通常是以包涵体的形式表达出来，蛋白的基本纯化工艺也是传统的包涵体变性复性和层析方法，在此纯化过程中包涵体的复性是个难题，由于复性的不完全，造成药物活性的损失。除此之外，层析法所用的介质成本高，处理量小。
1971年Folkman提出“肿瘤生长依赖血管生成”的重要概念以来，众多学者进行了大量的有关肿瘤血管生成的研究。研究表明，正常组织血管中很少表达VEGF，而常见的实体瘤均有VEGF的过量表达。VEGF通过增加血管通透性，引导内皮细胞表达整合素和蛋白酶激活因子，溶解基底膜，促进内皮细胞分裂、迁移，在肿瘤血管生成过程中起着关键作用。1993年Kim首次报道抗VEGF单克隆抗体(单抗)抑制荷瘤鼠的肿瘤生长，随后又发现其抑制转移瘤的发生。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应，使其临床应用严重受限。基因工程技术对抗体的改造(即抗体基因重组)可降低其免疫源性，抗体工程也因此成为国内外研究热点。单链抗体(ScFv)以其分子量小，穿透力强，免疫源性低，易于大量生产等优点，得到了较为广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无需亲和介质和标签切除酶的、利用内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组药物蛋白的方法。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待分离蛋白的基因、内含肽和类弹性蛋白ELPs连接到原核表达载体PET-32a(+)上，构成融合表达载体PET-ELPs-intein-待分离蛋白基因；
(2)步骤(1)中构建好的表达载体热冲击转化进大肠杆菌DH5α菌株，然后将鉴定过的阳性转化子亚克隆进大肠杆菌BL21表达菌株中，用IPTG和低温进行诱导表达；
(3)收集步骤(2)获得的菌体，超声破碎，离心去除细胞碎片，收集得到上清细胞裂解液，置于4℃冰箱备用；
(4)测定蛋白的相变温度Tt；
(5)用ITC循环方法纯化重组蛋白和切除ELPs标签。
所述待分离蛋白优选为重组药物蛋白TAT-Survivin(T34A)或者TAT-Anti-VEGF单链抗体。
步骤(2)中的诱导条件为：将转化子接种到LB培养基中，200rmp，37℃培养，直至OD600＝0.5～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM/L后放入18℃，150rmp，培养24h。
步骤(3)中菌体收集条件为：4℃，3000rmp，离心10min收集菌体，菌体用Tris缓冲液洗涤一次，离心后收集菌体置-20℃中冻存备用。
步骤(4)中相变温度的测定过程为：取超声上清液，加入0.5M NaCl，以2℃为温度梯度从15℃到40℃测定重组蛋白上清液的OD600，当OD值减少到原来的一半时，该温度即为相变温度Tt。
步骤(5)中ELPs标签的切除条件为：用Cleaving buffer18℃温育相变后沉淀下来的蛋白16小时；Cleaving buffer配方为：pH6.4的Tris缓冲液，40mMBis-Tris，0.5mM EDTA。
步骤(5)中ITC循环的次数为3次。
本发明的有益效果在于：利用内含肽介导的类弹性蛋白纯化系统来纯化重组蛋白，由于ELPs的温度依赖性自我凝集和intein的自我切割功能，将二者结合，就构成了一种不需要传统分离方法中所需要的昂贵的树脂和切除标签所需要的酶，此方法操作简便，快速，高效而且试用成本低。
附图说明
图1为重组质粒构建流程示意图。
图2为重组质粒构建示意图。
图3为PCR扩增的TAT-Survivin(T34A)和TAT-Anti-VEGF基因琼脂糖电泳图，其中条带1：Marker；1～4：目的条带，左为TAT-Survivin，右为TAT-Anti-VEGF。
图4为TAT-Survivin(T34A)蛋白电泳图，其中条带1：全菌液；2：菌体超声后沉淀；3：菌体超声后上清；4：cleaving buffer 22℃温育16h后；5：ITC3次后最后得到的目的蛋白TAT-Survivin(T34A)；6：Marker。
图5为TAT-Anti-VEGF(ScFv)蛋白电泳图，其中条带1：全菌液；2：菌体超声后沉淀；3：菌体超声后上清；4：cleaving buffer 22℃温育16h后；5：ITC3次后最后得到的目的蛋白TAT-Anti-VEGF单链抗体；6：Marker。
图6为重组蛋白TAT-Survivin(T34A)对2种细胞抑制率的MTT法检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。
实施例一：内含肽介导的类弹性蛋白纯化系统纯化重组蛋白TAT-Survivin(T34A)和TAT-Anti-VEGF单链抗体(ScFv)。
一、PCR扩增TAT-Survivin(T34A)/TAT-Anti-VEGF单链抗体基因。
根据本实验室构建的pRest-TAT-Survivin(T34A)、PET28a-Anti-VEGF单链抗体和PET-ELP-intein(获赠于美国杜克大学的Dr.Wood)质粒的序列，设计了以下引物用于上述基因的扩增。其序列见下表1。所用的引物由华大基因公司合成。
表1 本实验中所用的引物
利用分子生物学实验技术，具体方法见《分子克隆》进行。按照下列技术路线及方法进行构建。图1为质粒构建示意路程图，最后构建好的表达载体如图2所示。
图3为PCR扩增的TAT-Survivin(T34A)和TAT-Anti-VEGF基因。通过菌液PCR和华大公司的测序结果比对分析，正确构建了融合表达质粒PET-ELP-intein-TAT-Survivin(T34A)和PET-ELP-intein-TAT-Anti-VEGF。
二、表达并制备ELP-intein-TAT-Survivin(T34A)蛋白和TAT-Anti-VEGF单链抗体。
1)将测序正确的重组载体转化进大肠杆菌DH5α(Novagen，USA，实验室保存)用于质粒扩增，大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，USA，实验室保存)作为质粒表达的宿主菌。
2)重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
将测序正确的质粒转化进大肠杆菌表达菌株BL21感受态中，37℃过夜培养出单菌落后，挑单菌于5ml LB(含amp)培养基中37℃，180rmp，过夜培养。取5ml菌液于200ml TB培养基中37℃，180rmp培养，至OD600＝0.7左右加入IPTG(终溶度1mM/L)后，转入18℃，120rmp，培养24h。24h后离心收集菌体，离心条件，3000rmp，4℃，15min。收集的菌体用Tris缓冲液洗涤一次后置于4℃保存待用。
三、利用ITC循环纯化TAT-Survivin(T34A)蛋白/TAT-Anti-VEGF单链抗体。
1)菌体超声破碎。
将收获的菌体用超声裂解液裂解重悬后，进行超声破碎，超声破碎条件为：150w。超3s停5s，99次循环，冰浴。超声完成后离心收集上清，离心条件：12000rmp，4℃，12min。
2)相变温度(Tt)的测定。
取超声上清液，加入0.5M NaCl，以2℃为温度梯度从15℃到40℃测定重组蛋白上清液的OD600，但OD值将少到原来的一半时，改温度即为箱变温度Tt。经测定发现：在NaCl为0.5M时37℃时，目的蛋白可以很好的沉下来。
3)ITC纯化重组蛋白。
将收集到的上清加入Nacl(终溶度为0.5M)，震荡混匀后放入37℃水浴锅，温育10min，10min后离心收集沉淀，离心条件：12000rmp，37℃，10min。收集后的沉淀中加入冰的Cleaving buffer，震荡混匀，放入水浴锅中进行ELP-intein标签的自切割，自切割条件：22℃水浴，16h。16h后至水浴锅中取出，加入NaCl(终溶度为0.5M)，进行ITC沉淀，ITC沉淀条件：37℃水浴，10min，沉淀完全后离心收上清，离心条件：12000rmp，37℃，10min，离心后的上清即为目的蛋白。
4)SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。
电泳缓冲液：参照《分子克隆》(第2版相关章节)。蛋白电泳系统：30％丙烯酰胺∶29丙烯酰胺，N，N’-亚甲双丙烯酰胺1g，溶解于水中，定容至100ml，置于棕色瓶中4℃保存；1×SDS凝胶加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油；Tris-HCl-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS。电泳图如图4和图5所示。
四、纯化后TAT-Survivin(T34A)蛋白的活性检测。
1)细胞冻存。
计划冻存的细胞进入对数生长期时，在冻存前一天提前换培养液。冻存时先用0.25％胰蛋白酶消化单层细胞，收集在EP管中，离心，弃上清，即去除胰蛋白酶及旧的培养基，加入预先配制的冻存液，维持细胞终密度为5×107cells/ml。无菌冻存管中加冻存液1ml。对冻存管进行封口，然后直接冻存。冻存程序为：4℃保存30min，-20℃保存30min，-80℃过夜保存，然后迅速投入-196℃液氮罐长期保存。
2)细胞复苏。
从冰库中取出冻存管后用酒精消毒，用移液器吸出细胞冻存液，慢慢滴入10倍体积的新鲜1640培养基中，使冻存液中1640逐渐从细胞中渗出，混匀后低速离心，弃上清液，再用新鲜1640培养基重复洗一次。培养基稀释成106cells/ml的悬液后接种于无菌培养瓶中，37℃培养，5％CO2，饱和湿度，24小时后换液一次，继续培养。
3)细胞传代。
肺癌细胞系A549培养于含10％的FBS的1640培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中，细胞长到90％左右时，弃掉旧培养液后加入PBS洗涤一遍，以去掉残留培养基中的血清，加0.25％胰酶，轻轻摇动细胞瓶使胰酶布满细胞平底，计时，用胰酶消化1min，显微镜观察细胞形态变化，待细胞质收缩且细胞间隙变大后，迅速加入含血清的培养基以终止胰酶消化。吸取瓶内培养液并轻轻吹打瓶壁细胞，使细胞完全从瓶壁脱落且形成单细胞悬液为止，按1传3比例传代。
4)MTT检测法。
取对数生长期的A549/HCT116细胞，取对数生长期的A549/HCT116细胞，胰酶消化后，加入适量含10％新生牛血清的新鲜1640培养基。显微镜下血球计数板计数，然后再加细胞培养基将细胞稀释成1×105cells/ml悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μl(边缘孔用无菌PBS填充)。同时设置调零孔(培养基+MTT+二甲基亚砜)，对照孔(细胞+相同浓度的药物溶解介质+培养液+MTT+二甲基亚砜)。5％CO2，37℃孵育，当细胞待细胞长到50％～60％汇聚时，小心吸去旧的培养基，分别加入200μl含重组蛋白TATm-Survivin(T34A)的新鲜培养基，每种蛋白终浓度梯度依次为0、36.7、49.0、65.4、87.2、116.2、155、206.6、274.66μg/ml，另设调零孔、只加含有10％小牛血清培养基将的对照空、加20μl对应缓冲液的对照孔，每个处理6个复孔；。5％CO2，37℃分别孵育24h、48h、72h小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。4h后弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定其A495值。图6为重组蛋白TAT-Survivin(T34A)对2种细胞抑制率的MTT法检测结果。
5)蛋白药物对癌细胞抑制率与半数致死率(IC50)。
以药物浓度为横坐标轴，抑制率为纵坐标，通过计算重组蛋白作用后的细胞存活率来反映细胞的增殖情况，并计算药物对细胞作用24h的半抑制浓度(IC50)，计算结果如下表2所示。
表2：24h时重组蛋白TAT-Survivin(T34A)对A549和HCT116的半数抑制浓度。
从上述实验结果可发现，通过类弹性蛋白和内含肽来能用的纯化系统纯化的蛋白不仅纯度高，操作简单，成本低而且活性相较于传统方法有相对提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待分离蛋白的基因、内含肽和类弹性蛋白ELPs连接到原核表达载体PET-32a(+)上，构成融合表达载体PET-ELPs-intein-待分离蛋白基因；
(2)步骤(1)中构建好的表达载体热冲击转化进大肠杆菌DH5α菌株，然后将鉴定过的阳性转化子亚克隆进大肠杆菌BL21表达菌株中，用IPTG和低温进行诱导表达；
(3)收集步骤(2)获得的菌体，超声破碎，离心去除细胞碎片，收集得到上清细胞裂解液，置于4℃冰箱备用；
(4)测定蛋白的相变温度Tt；
(5)用ITC循环方法纯化重组蛋白和切除ELPs标签。
2.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，所述待分离蛋白为重组药物蛋白TAT-Survivin(T34A)或者TAT-Anti-VEGF单链抗体。
3.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中的诱导条件为：将转化子接种到LB培养基中，200rmp，37℃培养，直至OD600＝0.5～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM/L后放入18℃，150rmp，培养24h。
4.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中菌体收集条件为：4℃，3000rmp，离心10min收集菌体，菌体用Tris缓冲液洗涤一次，离心后收集菌体置-20℃中冻存备用。
5.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中相变温度的测定过程为：取超声上清液，加入0.5MNaCl，以2℃为温度梯度从15℃到40℃测定重组蛋白上清液的OD600，当OD值减少到原来的一半时，该温度即为相变温度Tt。
6.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中ELPs标签的切除条件为：用Cleaving buffer18℃温育相变后沉淀下来的蛋白16小时；Cleaving buffer配方为：PH6.4的Tris缓冲液，40mM Bis-Tris，0.5mM EDTA。
7.根据权利要求1所述的内含肽介导的类弹性蛋白纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中ITC循环的次数为3次。
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