CN112143691A - 大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用 - Google Patents

大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌zjut‑bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用，所述的应用为：大肠杆菌zjut‑bvr经种子扩大培养后，以体积浓度3％–5％的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的表达培养基，于35–37℃、150–200r/min振荡培养至OD600＝0.6–1.0，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L的IPTG，诱导培养至OD600＝1.2–2.5，获得含胆绿素还原酶的培养液，将培养液分离提取，获得胆绿素还原酶；本发明大肠杆菌经表达培养，获得含胞内活性胆绿素还原酶的菌体，培养液的酶活为0.267U/mL，经分离纯化获得活性为1.84U/mg的胆绿素还原酶。

Description

大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌，以及该菌株在制备胆绿素还原酶中的应用。
(二)背景技术
胆绿素还原酶(biliverdin reductase，简称BvdR，EC l.3.1.24)是在血红素代谢中，催化胆绿素还原生成胆红素的酶(代谢途径见附图1)。胆绿素还原酶广泛存在于哺乳动物及一些鱼类各种组织胞液内，在肝脏和肾脏中含量最高。近年来研究发现，胆红素是体内有效的抗氧化剂，参与氧化应激反应等，因此催化胆红素生成的胆绿素还原酶逐渐引起人们的重视。
在脊椎动物体内，血红素在细胞代谢中的重要作用显而易见，但以往认为血红素代谢产物不仅对机体无益，过量时还可对机体造成损害。如游离胆红素如果不能和葡萄糖醛酸充分结合并排出体外，就容易透过血脑屏障对神经系统造成损伤。血红素加氧酶(hemeoxygenase，简称HO，EC 1.14.99.3)是血红素分解代谢的第一步限速酶，将血红素氧化为胆绿素。近些年来，关于血红素加氧酶的功能以及与疾病的关系逐渐被人们认识，大量研究结果表明血红素加氧酶具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增生等生理效应。在血红素加氧酶研究中，酶的活性多采用检测血红素分解代谢终产物胆红素的生成量来计算，需要在酶反应体系中加入胆绿素还原酶。目前，测定所需的胆绿素还原酶一般都是从动物肝脏直接提取的方法获得，这种制备的胆绿素还原酶成本高，且活性不够理想，因此，用基因工程的方法制备胆绿素还原酶是一条经济有效的途径。此外，胆绿素还原酶还可以用于生物转化胆绿素制备胆红素。
目前，国内外已有不少利用大肠杆菌表达牛、大鼠、柞蚕基因来源的胆绿素还原酶的研究报道，将真核生物来源的基因在原核细胞中表达，往往存在产物以包涵体存在的缺点。目前未见关于利用大肠杆菌表达原核细胞来源的胆绿素还原酶的研究报道。将原核生物的胆绿素还原酶基因在大肠杆菌中表达，则具有表达效率高、胞内活性好等优点，可以降低生产成本。为此，本发明将集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的胆绿素还原酶基因在大肠杆菌中表达，并经过紫外线诱变和筛选，获得一株产酶活性显著提高的胆绿素还原酶产酶菌株，该菌株可应用于发酵生产胆绿素还原酶。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌，经诱导表达培养后，从菌体内分离获得胆绿素还原酶。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-bvr菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61045，保藏日期2020年6月8日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
本发明所述大肠杆菌zjut-bvr菌株的获得包括以下步骤：
(1)依据NCBI上提供的bvdr基因序列经大肠杆菌偏好密码子优化，并在序列的5′端引入限制性内切酶EcoR I位点、3′端引入限制性内切酶SaI I位点，化学合成的含EcoRI/SaI I酶切位点的bvdr基因，DNA序列见SEQ ID No.1；
(2)合成的DNA序列和表达载体pET-28a，分别经限制性内切酶EcoR I和SaI I双酶切，酶切产物经过电泳割胶回收后，目标基因片段和开环的载体pET-28a经T4 DNA酶连接后，热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提取质粒进行双酶切验证，获得重组质粒载体pET-28-mbvdr(电泳图见图2)；
(3)将步骤(2)pET-28-mbvdr质粒，热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，获得的重组菌命名为大肠杆菌bvr菌株。
(4)以大肠杆菌bvr菌株为出发菌株，用紫外线照射诱变，经过筛选，获得一株产胆绿素还原酶活力较出发菌株提高27.6％的菌株，即大肠杆菌zjut-bvr菌株。
本发明还涉及大肠杆菌zjut-bvr在制备胆绿素还原酶中的应用，具体所述的应用为：大肠杆菌zjut-bvr经种子扩大培养后，以体积浓度3％–5％(优选5％)的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基，于35–37℃、150–200r/min振荡培养3.5–4.5h至OD600＝0.6–1.0(优选37℃、200r/min摇床中培养4h至OD600＝0.745)，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L(优选1.25mmol/L)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于30–32℃、150–200r/min诱导培养6-10h至OD600＝1.2–2.0(优选32℃，200r/min的摇床中表达培养6h，得OD600＝2.035)，获得含胆绿素还原酶的培养液，经分离纯化，获得胆绿素还原酶。所述的产酶培养基终浓度组成为：甘油15–20g/L，酵母浸出粉15–20g/L，(NH4)2SO4 3–5g/L，NaCl 3–5g/L，Na2HPO4·12H2O 10–15g/L，KH2PO4 2–5g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.2–7.4。
进一步，所述胆绿素还原酶分离纯化的方法为：将培养液离心(优选经4℃、8000g离心5–10min)，收集菌体后用结合缓冲液重悬，加入溶菌酶，经超声波破碎细胞，再离心(优选4℃、8000g离心5–10min)，收集上清液，上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥，获得胆绿素还原酶。
进一步，所述结合缓冲液组成：50mmol/L Na2HPO4，300mmol/L NaCl，用1mol/L的NaOH调节pH至8.0；所述结合缓冲液体积用量以菌体湿重计为2–5mL/g(优选4mL/g)；所述溶菌酶(20000U/mg)加入终浓度为1mg/mL。
进一步，所述超声波破碎细胞条件为：冰水浴下，功率200W，工作2s，间隔3s，工作200次。
进一步，所述上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥。具体方法为：Ni–NTA柱(1cm×5cm)经蒸馏水冲洗后，用2个柱体积的结合缓冲液预先平衡，将上清液以1mL/min的流速上样，用1倍柱体积的洗涤缓冲液洗柱5–10次，至洗涤缓冲液中不含杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱至A280为0，收集全部洗脱液；将洗脱液于透析袋(截留分子量为3.5kD)，用结合缓冲液透析除去咪唑，透析液于超滤管(截留分子量3kD)浓缩，浓缩液于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素还原酶冻干酶粉；所述的洗涤缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为2mmol/L的咪唑；所述的洗脱缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为50mmol/L的咪唑。
进一步，所述大肠杆菌zjut-bvr种子扩大培养方法为：按体积浓度1％的接种量，移取20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，或大肠杆菌zjut-bvr斜面菌体，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min摇床中培养10-14h至OD600＝1.0–1.5，得扩大培养的种子液(优选OD600＝1.047)；所述的LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。所述的20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，是该菌在LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h后，与40％甘油水溶液等体积混合，保藏于-80℃冰箱。
进一步，优选所述的产酶培养基组成为：甘油20g/L，酵母浸出粉20g/L，(NH4)2SO45g/L，NaCl 5g/L，Na2HPO4·12H2O 15g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。
进一步，所述的大肠杆菌zjut-bvr制备胆绿素还原酶的具体步骤包括：
(1)将低温保存的大肠杆菌zjut-bvr接种于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)挑取步骤(1)的斜面菌体2环；或按体积分数1％的接种量移取20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min摇床中培养10–14h，得OD600＝1.0–1.5的种子液；
(3)按体积分数3％–5％的接种量，移取步骤(2)制备的种子液接种于含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基中，于35–37℃、150–200r/min摇床中培养3.5–4.5h至OD600＝0.6–1.0，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L的IPTG作为诱导剂，在30–35℃，150–200r/min的摇床中表达培养6–10h，得OD600＝1.0–2.0的培养液；
(4)步骤(3)的培养液经4℃、8000g离心5–10min收集菌体，每克湿菌体沉淀中加入2–5mL结合缓冲液，加终浓度为1mg/mL的溶菌酶(20000U/mg)，冰水浴30min；冰水浴条件下超声波破碎细胞(功率200W，工作2s，间隔3s，工作200次)，细胞破碎液4℃、8000g离心5–10min，收集上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后得细胞裂解液；
(5)Ni–NTA柱(1cm×5cm)经蒸馏水冲洗后，用2个柱体积的结合缓冲液预先平衡，步骤(4)的细胞裂解液进样，流速为1mL/min；进样结束后，用1倍柱体积的洗涤缓冲液洗柱5–10次，至洗涤缓冲液中不含杂蛋白；再用洗脱缓冲液洗脱至A280为0，收集洗脱液；含胆绿素还原酶的洗脱液于透析袋(截留分子量为3.5kD)，透析除去咪唑；透析液于超滤管(截留分子量3kD)浓缩，浓缩液于培养皿中，经冷冻干燥，即得到胆绿素还原酶冻干粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明合成并克隆了集胞藻来源的胆绿素还原酶经偏好密码子优化的基因，构建了能够产胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌，并经过紫外线诱变，获得一株酶活力高、传代稳定的突变株。该菌株经产酶培养，获得含胞内活性胆绿素还原酶的菌体，培养液的酶活为0.267U/mL。经分离纯化获得活性为1.84U/mg的胆绿素还原酶。该酶能够催化胆绿素为胆红素，可应用于血红素加氧酶活性的测定和生物转化法制备胆红素。
(四)附图说明
图1胆绿素还原酶参与血红素分解代谢的反应式。
图2重组质粒pET-28-mbvdr经双酶切后电泳图(M：Marker；1：酶切产物)。
图3大肠杆菌bvr菌株表达胆绿素还原酶的SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：细胞裂解液；2：阴性对照)。
图4胆绿素还原酶的纯化电泳图(M：Marker；CL：细菌裂解液；FT：上样穿流液；W1-W4：洗涤液1-4；E1-E3：洗脱液1-3。
图5胆红素浓度—A450的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例中，如未说明具体的实验方法，均按照常规分子生物学实验方法操作，如魏群主编的《分子生物学实验指导》(第三版，科学出版社，2015)中所述的方法，或按照试剂盒生产商建议方法操作。
本发明实施例用于培养重组大肠杆菌的LB斜面培养基、LB平板培养基、LB液体培养基和产酶培养基中，均在接种前加入终浓度为50μg/mL卡那霉素，卡那霉素以浓度为50mg/mL的水溶液的形式加入。
实施例1表达胆绿素还原酶的大肠杆菌bvr菌株的构建
本发明所述的表达胆绿素还原酶的大肠杆菌bvr菌株，按以下步骤构建：
(1)根据NCBI数据提供的集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的bvdr序列(Accession:CP012832，SEQ ID No.2)，经大肠杆菌偏好密码子优化，并在序列的5′端引入EcoR I酶切位点GAATTC、3′端引入SaI I酶切位点GTCGAC，化学合成密码子优化后的bvdr基因序列(如SEQ ID No.1所示)。基因序列的化学合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
(2)步骤(1)合成的DNA序列(SEQ ID No.1所示)，以及表达载体pET-28a，分别经限制性内切酶EcoR I和SaII双酶切，酶切产物经过电泳割胶回收后，用T4 DNA连接酶将目标基因片段和载体进行连接，得重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提取质粒进行酶切鉴定，序列大小符合目标(电泳图见图2)。经测序验证显示插入序列正确，获得重组质粒pET-28-mbvdr；
(3)重组质粒pET-28-mbvdr热激法转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，得bvdr基因重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌bvr菌株；
(4)大肠杆菌bvr菌株接种于LB液体培养基中，37℃、150r/min培养4.5h(OD600＝0.853)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃、150r/min诱导培养8h至OD600＝1.207。所述的LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2–7.4；
(5)步骤(4)的培养液经4℃、8000g离心10min收集菌体，用原培养液1/5体积pH5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液重悬菌体，冰水浴条件下超声波破碎细胞(功率200W，工作2s，间隔3s，工作200次)，经4℃、8000g离心5–10min，收集上清液，得细胞裂解液。
(6)步骤(5)的细胞裂解液经SDS-PAGE蛋白电泳分析(图3)，重组菌表达了分子量约为37kD的蛋白，与胆绿素还原酶分子量大小一致(36.65kD)；酶活测定表明：按培养液的体积计算，胆绿素还原酶活力为0.121U/mL，表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌构建成功。
所述的限制性内切酶EcoR I和SaI I、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司。质粒载体pET-28a、大肠杆菌DH5α菌株和BL21(DE3)菌株本实验室保藏。DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量制备试剂盒等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
所述的胆绿素还原酶活力测定方法为：上述细胞裂解液800μL，0.1mmol/L的NADPH水溶液120μL，150μmol/L的胆绿素水溶液40μL，10.0g/L牛血清白蛋白水溶液40μL，上述溶液于试管中混合均匀后(即为反应体系)于37℃保温15min，测定样品的A450，由胆红素-A450标准曲线(图5)，计算得到产物胆红素的浓度。按以下公式计算胆绿素还原酶的酶活力。
Figure BDA0002663916170000061
式中：C-胆红素浓度(μg/mL)；T-反应时间(min)；V1-反应体系体积，即1mL；V2-测定酶液的体积(mL)。
胆绿素还原酶活力的定义：在37℃、pH 5.8条件下，每分钟还原胆绿素生成1μg胆红素所需胆绿素还原酶的酶量(mL或mg)为一个酶活力单位(U)。
实施例2大肠杆菌bvr菌株表达胆绿素还原酶
利用大肠杆菌bvr菌株，表达胆绿素还原酶的培养方法可按如下步骤操作：
(1)0.2mL的20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌bvr菌液接种于LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体。所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；所述的20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌bvr菌液，是该菌在LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h后，与40％甘油水溶液等体积混合，保藏于-80℃冰箱。
(2)用接种环挑取步骤(1)斜面菌体2环，接种到20mL的LB液体培养基中，37℃、150r/min摇床中培养14h，得OD600＝1.463的种子液；所述的LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。100-mL三角瓶装20mL的培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)按体积分数3％的接种量，移取步骤(2)制备的种子液1.5mL接种于50mL的LB液体培养基中，于37℃、150r/min摇床中培养3.5h(OD600＝0.626)，加入终浓度为0.75mmol/L的IPTG作为诱导剂，于30℃，200r/min的摇床中表达培养6h，得OD600＝1.185的培养液。所述的LB液体培养基同步骤(2)所述，250-mL三角瓶装50mL的培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
采用实施例1方法检测，按本实施例步骤，制备的大肠杆菌bvr菌株的培养液，胆绿素还原酶的活力为0.127U/mL。
实施例3诱变选育获得大肠杆菌zjut-bvr菌株
所述的大肠杆菌zjut-bvr按以下方法诱变筛选获得：
(1)菌体制备：20mL的LB液体培养基中，接入大肠杆菌bvr菌株斜面菌体，于37℃、200r/min振荡条件培养12h。取1mL菌液于离心管中，8000×g离心5min，弃上清液，加入等量无菌生理盐水(0.85％NaCl水溶液)重悬菌体，再次离心收集菌体，如此重复洗涤菌体2次后，用10mL无菌生理盐水重悬菌体于100mL三角瓶备用。
(2)诱变：取直径6cm无菌培养皿5副，分别加入上述菌悬液1mL。打开培养皿盖，在20W紫外灯下距离30cm处边搅拌边照射，分别照射0、30、60、90、120s。完毕后将各菌液用无菌生理盐水稀释1×103～1×106倍，取0.1mL稀释菌液涂布LB平板培养基，黑布包裹平板于37℃下培养24h。所述的LB平板培养基终浓度组成同LB斜面培养基，高压蒸汽121℃灭菌20min后，冷却至50℃，加入终浓度为50μg/mL卡那霉素水溶液，摇匀后倒入直径9cm的无菌培养皿，冷却后备用。
上述平板菌落计数结果表明：随着紫外线照射时间的延长，致死率逐渐增加，当照射90s时，致死率达到90％。一般认为致死率在90％～99.9％时，诱变效果较好(施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社,2013)，所以从紫外线照射时长90s和120s诱变后的平板中挑取突变株菌落。
(3)筛选：从紫外线照射诱变后的平板中挑取单菌落，转接LB斜面37℃培养24h后，再挑取菌体接种LB液体培养基，于37℃、150r/min摇床中培养4h，加入终浓度为0.75mmol/L的IPTG作为诱导剂，于30℃，200r/min的摇床中表达培养6h，按实施例1方法测定胆绿素还原酶酶活力，从筛选的菌株中选取酶活提高20％的7个突变菌株进行复筛(每个菌株做3个重复样)，复筛的7个菌株产胆绿素还原酶的活力见表1。
表1经紫外线诱变的突变菌株复筛产酶活力
Figure BDA0002663916170000081
经过复筛后，编号为UV-78菌株的产酶活力提高幅度较大，较出发菌株提高了27.6％。用LB斜面培养基接种传代5次，每代的产酶活力见表2。
表2不同传代次数的UV-78菌株产胆绿素还原酶的活力
Figure BDA0002663916170000082
从表2数据可以看出，诱变获得的UV-78产胆绿素还原酶活力稳定。将该菌株重新命名为大肠杆菌zjut-bvr(Escherichia colizjut-bvr)，提交广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：GDMCC No:61045，保藏日期2020年6月8日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
实施例4大肠杆菌zjut-bvr产胆绿素还原酶的培养条件优化
在实施例3获得能产胆绿素还原酶大肠杆菌zjut-bvr菌株的基础上，对该菌株产胆绿素还原酶的表达条件进行了优化。经过优化后，胆绿素还原酶的表达量显著提高，优选的大肠杆菌zjut-bvr菌株产胆绿素还原酶的培养方法步骤如下：
(1)按体积分数1％的接种量，移取0.2mL 20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，接种到20mL的LB液体培养基中，37℃、150r/min摇床中培养10h，得OD600＝1.047的种子液；所述的LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。100-mL三角瓶装20mL的培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。所述的20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，是该菌在LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h后，与40％甘油水溶液等体积混合，保藏于-80℃冰箱。
(2)按体积分数5％的接种量，移取步骤(1)制备的种子液2.5mL接种于50mL的产酶培养基中，于37℃、200r/min摇床中培养4h(OD600＝0.745)，加入终浓度为1.25mmol/L的IPTG作为诱导剂，于32℃，200r/min的摇床中表达培养6h，得OD600＝2.035的培养液。所述的产酶培养基组成为：甘油20g/L，酵母浸出粉20g/L，(NH4)2SO4 5g/L，NaCl 5g/L，Na2HPO4·12H2O 15g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。250-mL三角瓶装50mL的产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
采用实施例1方法检测，按本实施例步骤，制备的大肠杆菌zjut-bvr菌株的培养液，胆绿素还原酶的活力为0.267U/mL。
实施例5胆绿素还原酶的分离纯化
按实施例4的方法，培养表达胆绿素还原酶的大肠杆菌zjut-bvr菌体，按以下步骤分离纯化获得胆绿素还原酶：
(1)按实施例4方法制备的OD600＝2.035培养液100mL，经4℃、8000g离心5min收集菌体，得湿菌体0.853g，加入3.4mL结合缓冲液(按4mL/g湿菌体计)，加溶菌酶(20000U/mg)至终浓度1mg/mL，冰水浴30min。冰水浴条件下超声波破碎细胞(功率200w，工作2s，间隔3s，工作200次)。细胞破碎液4℃、8000g离心5–10min收集上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后得滤液，即得细胞裂解液约3mL。
(2)Ni-NTA柱(1cm×5cm)经蒸馏水冲洗后，用2个柱体积的结合缓冲液预先平衡。步骤(1)的全部细胞裂解液进样，流速为1mL/min。进样结束后，用1倍柱体积的洗涤缓冲液洗柱5–10次，至洗涤缓冲液中不含杂蛋白(图4的W1–W4条带)，再用洗脱缓冲液洗脱至A280为0，收集全部洗脱液(SDS-PAGE电泳图见图4条带E1–E3)。
(3)将步骤(2)收集的洗脱液于透析袋(截留分子量为3.5kD)，用结合缓冲液透析除去咪唑。透析液于超滤管(截留分子量3kD)浓缩，浓缩液于培养皿中，于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥，得到11.3mg冻干酶粉，此冻干粉的酶活力1.84U/mg，即得到胆绿素还原酶冻干酶粉。
所述的结合缓冲液的配制方法为：50mmol/L Na2HPO4，300mmol/L NaCl，用1mol/L的NaOH调节pH至8.0；所述的洗涤缓冲液配制方法为：上述结合缓冲液中添加终浓度为2mmol/L的咪唑；所述的洗脱缓冲液配制方法为：上述结合缓冲液中添加终浓度为50mmol/L的咪唑。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> 集胞藻( Synechocystissp.)
<400> 1
gaattcatgt ctgaaaactt cgcggttgcg accccggttc gtgttggcat cgttggtacc 60
ggttacgcgg cgcagcgtcg tgcggaagtt ttccgtggcg atcgtcgtag ccagctggtt 120
tctttctggg gcaacagcga agcgaacacc gcgaaattcg cggatacctt cggcgtgcgt 180
ccgcagcagt cttggcaggc cctgatcaac gatccggaaa tcgacctggt tctgatcgcg 240
accatcaacc agctgcacgg tgcgatcgcg gaagcggcgc tgcaggcggg taaacacgtt 300
gttctggaat acccgctggc gctgacctac gcgatgggca aaaaactgca gcagctggcg 360
cgtgaaaaag gtaaactgct gcacgttgaa cacatcgaac tgctgggtgg tgttcaccag 420
gcgattcgtc agaacctggg caaaatcggc gaagtgttct acgcgcgtta cagcaccatc 480
atgggccaga acccggcacc gcagcgctgg acctaccacc accagcagtt cggcttcccg 540
ctggttgcgg cgctgagccg tatcagccgt ttcaccgacc tgttcggtac cgttcagcag 600
gttgatgcgc agtgccgctt ctgggatcag ccgaacccgg aatacttccg tgcgtgcctg 660
gcgaccgcgt acctgcagtt caacaacggt ctgaaagcgg aagttatcta cggtaaaggc 720
gaagttttcc atcagaacga acgcatcttc accctgcacg gtgatcgtgg caccctgatc 780
ttcgtgggcg aaaccggccg tctgatccag ggccagaccg aaaccgaaat caccgttggt 840
agccgtcgtg gtctgttccg tcaggatacc gaagcagttc tggattacct gaccaccggt 900
aaaccgctgt acgttgatct ggaagcgtcc ctgtacgcgc tggaagtggc ggatctgtgc 960
gcgcaggcgt gcggctacaa agttgaaaac gtcgac 996
<210> 2
<211> 984
<212> DNA
<213> 集胞藻( Synechocystissp.)
<400> 2
atgtctgaaa attttgcagt tgctacgccg gtgcgggtcg gaattgtcgg tactggttat 60
gcggcccaac gtcgggcgga agttttccgg ggcgatcgcc gtagtcaatt ggttagtttt 120
tggggcaata gtgaagccaa tacagctaaa tttgccgata cttttggagt tagaccccag 180
caatcttggc aggcattaat taatgatcca gagatagatt tagtgctcat tgccaccatt 240
aaccaactcc atggggcgat cgccgaggcg gcattgcaag ccggtaaaca tgtggtgttg 300
gaatatcctt tagcgttaac ctatgccatg ggcaaaaaac tacaacagtt agcccgggaa 360
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cgccagaacc taggcaaaat tggtgaggtt ttttacgccc gctatagcac catcatggga 480
caaaatcccg ctccccaacg ttggacctat caccatcagc aatttggctt tcctttagtg 540
gcggccttgt cccgcatcag tcggtttacg gatttattcg gtacagtaca gcaggtggat 600
gcccaatgtc gtttttggga tcagcctaat ccggaatatt ttcgggcttg tttagccacc 660
gcctatctcc agtttaataa tggtcttaaa gcggaggtta tctatggcaa aggggaagtt 720
tttcaccaga atgaacggat ttttaccctc catggcgatc gaggcacctt aatttttgtc 780
ggggaaacag gtaggttaat tcagggacaa acggaaactg aaattaccgt tggtagtcgt 840
cgaggactgt tcagacaaga cacggaagca gtgttggatt atctaaccac tggtaagccc 900
ctttatgtgg atttagaagc tagtttatat gctttagaag tggcggatct ctgtgcccaa 960
gcttgtggat ataaggttga aaat 984

Claims (10)

1.一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-bvr，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61045，保藏日期2020年6月8日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
2.一种权利要求1所述大肠杆菌zjut-bvr在制备胆绿素还原酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：大肠杆菌zjut-bvr经种子扩大培养后，以体积浓度3％–5％的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基，于35–37℃、150–200r/min振荡培养至OD600＝0.6–1.0，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L的IPTG，于30–32℃、150–200r/min诱导培养至OD600＝1.2–2.0，获得含胆绿素还原酶的培养液，将培养液分离提取，获得胆绿素还原酶；所述产酶培养基终浓度组成为：甘油15–20g/L，酵母浸出粉15–20g/L，NH4SO4 3–5g/L，NaCl 3–5g/L，Na2HPO4·12H2O 10–15g/L，KH2PO4 2–5g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.2–7.4。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述培养液分离提取的方法为：将培养液离心，收集菌体后用结合缓冲液重悬，加入溶菌酶，经超声波破碎细胞，再离心，收集上清液，上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥，获得胆绿素还原酶。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述结合缓冲液组成：50mmol/L Na2HPO4，300mmol/L NaCl，用1mol/L的NaOH调节pH至8.0。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述溶菌酶酶活20000U/mg，所述溶菌酶加入终浓度为1mg/mL。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述超声波破碎细胞条件为：冰浴下，功率200W，工作2s，间隔3s，工作200次。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥的方法为：Ni–NTA柱经蒸馏水冲洗后，用2个柱体积的结合缓冲液预先平衡，将上清液以1mL/min的流速上样，用1倍柱体积的洗涤缓冲液洗柱5–10次，至洗涤缓冲液中不含杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱至A280为0，收集洗脱液；将洗脱液于透析袋中，用结合缓冲液透析除去咪唑，透析液于超滤管浓缩，浓缩液于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素还原酶冻干酶粉；所述的洗涤缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为2mmol/L的咪唑；所述的洗脱缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为50mmol/L的咪唑。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于透析袋截留分子量为3.5kD；超滤管截留分子量3kD。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌zjut-bvr种子扩大培养方法为：按体积浓度1％的接种量移取15％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，或大肠杆菌zjut-bvr斜面菌体，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、150r/min摇床中培养至OD600＝1.0–1.5，得扩大培养的种子液；所述的LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。
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