CN113186235A - 一种生物转化法合成胆红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物转化法合成胆红素的方法,将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌菌株产酶培养后的发酵液离心,收集菌体,经蒸馏水洗涤后作为生物催化剂,以pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液为反应介质,加入胆绿素为底物,以甲醇为助溶剂构成转化体系,在35–37℃、100–200r/min恒温振荡条件下转化10–14h,转化反应结束后,将转化液离心,收集菌体,获得含胆红素的菌体,分离提取,获得胆红素。本发明含胆红素的菌体中胆红素的含量最高可达2.02%,是猪胆汁中胆红素含量0.05%的40.4倍,从菌体中提取胆红素的步骤相对简单,对降低胆红素的生产成本具有显著效果。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种利用表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌,生物转化胆绿素合成胆红素的方法。
(二)背景技术
胆红素(bilirubin,CAS号635-65-4)是在一些生物体产生的一类胆色素,主要由血红素(heme,CAS号14875-96-8)降解产生。在人体中,衰老的红细胞在单核吞噬细胞系统的作用下,释放出血红蛋白,血红蛋白随后被分解成球蛋白和血红素。血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase,简称HO,EC 1.14.99.3)的作用下,将卟啉环氧化断裂而成为胆绿素(biliverdin,CAS号114-25-0),胆绿素进而被胆绿素还原酶(biliverdin reductase,简称BvdR,EC l.3.1.24)还原生成胆红素。
健康正常的成年人个体每天产生约300mg胆红素,胆红素如果过量存在,会在大脑中堆积,使人易患精神疾病,或导致脑部组织受损,如新生儿核黄疸,所以在很长一段时间内,胆红素都被认为是有毒的代谢产物。但是近年来,越来越多的研究显示胆红素是人体内发挥重要抗氧化作用的脂溶性抗氧化剂,当血清胆红素水平正常或稍高时,胆红素具有强大的抗氧化和抗炎能力,能够清除体内的过氧化氢自由基、氧自由基,其抑制脂蛋白氧化的能力是维生素E类似物的30倍,在预防糖尿病和冠心病方面发挥着重要的作用。
胆红素是牛黄的主要成分之一,牛黄是珍稀名贵中药材,具有极高的药用价值。2015版药典中牛黄类药品多达50余种,包括牛黄解毒片、安宫牛黄丸、牛黄上清胶囊等,但是天然牛黄来源稀少。为了缓解天然牛黄药源短缺,我国药学工作者在上个世纪70年代根据天然牛黄的成分,成功地研制出人工牛黄。但是,人工牛黄中胆红素的含量与天然牛黄还是存在很大差距,提高胆红素的含量和纯度有利于提高人工牛黄的品质。此外,胆红素也是药典中100多种中成药制剂的主要成份,如扑热息痛片、银翘解毒丸等,市场需求量大,目前市场价格高达8万元/公斤。
目前,胆红素基本都是从动物胆汁中提取,但胆汁中天然胆红素含量相当低,如猪胆汁中的胆红素含量仅为0.05%左右,由于原料来源受到限制,所以国内开发活猪造瘘引流胆汁的技术,该技术虽然解决了胆汁来源的问题,但是虐待动物的问题引起很大的社会争议,应用受到限制。因此,开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法具有重要经济价值和社会意义。
本发明以表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌细胞为生物催化剂,以胆绿素为底物生物转化合成胆红素(反应式见附图1)。富含胆红素的大肠杆菌菌体作为胆红素提取的原料,克服了从动物胆汁中提取胆红素原料来源不足的问题。
(三)发明内容
本发明提供一种生物转化法合成胆红素的方法,以表达胆绿素还原酶的大肠杆菌为催化剂,以胆绿素为底物,生物转化合成胆红素。该新方法解决了胆红素只能从动物胆汁中提取的问题,生产成本较提取法显著降低,且生产工艺具有高效、绿色环保等优点。
本发明采用的技术方案为:
本发明提供一种生物转化法合成胆红素的方法,所述方法为:将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌(优选Escherichia coli zjut-bvr)菌株产酶培养后的发酵液离心,收集菌体,经蒸馏水洗涤后作为生物催化剂,以pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液为反应介质,加入胆绿素为底物,以甲醇为助溶剂构成转化体系,在35–37℃、100–200r/min恒温振荡条件下转化10–14h,转化反应结束后,将转化液离心,收集菌体,烘干(优选85℃),获得含胆红素的菌体,分离提取,获得胆红素。
进一步,在转化体系中,所述生物催化剂用量按干菌体重量计为15–18g/L。所述的底物胆绿素,也可以是胆绿素的盐类,如氯化胆绿素,在转化体系中浓度为0.055–0.44g/L,所述助溶剂甲醇的体积终浓度为10%转化体系(优先选用甲醇溶解胆绿素,然后再加入到生物转化体系中)。
进一步,所述生物催化剂按如下方法制备:将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌接种至含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基中,于35–37℃、200–300r/min摇床中培养3.5–4.0h至OD600=0.6–1.0(未稀释测定),加入终浓度为0.5–1.0mmol/L(优选1.0mmol/L)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,在30–32℃,200–300r/min的摇床中表达培养8–12h,得OD600=6.8–7.5的培养液,菌体干重浓度为3.1–3.6g/L,离心,收集菌体。所述的产酶培养基终浓度组成为:甘油15–20g/L,酵母浸粉15–20g/L,(NH4)2SO4 3–5g/L,NaCl 3–5g/L,Na2HPO4·12H2O 10–15g/L,KH2PO4 2–5g/L,MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4。
进一步,优选产酶培养基终浓度组成为:甘油20g/L,酵母浸粉20g/L,(NH4)2SO45g/L,NaCl 5g/L,Na2HPO4·12H2O 15g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2。
进一步,所述表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌在产酶培养前,通常需要先经活化培养,再经过种子扩大培养,获得种子液再以体积浓度3%–5%的接种量接入产酶培养基进行培养,具体步骤如下:
(1)活化培养:将低温保存的表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌(优选zjut-bvr菌株,4℃保存的斜面或–20℃保存的20%甘油水溶液菌悬液),接种于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基,于37℃恒温培养24h,获得活化的斜面菌体;所述的LB斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min;
(2)种子扩培:挑取步骤(1)活化的斜面菌体2环,接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,35–37℃、150-200r/min摇床中培养10–15h,得OD600=4.0–5.0的种子液。所述的LB液体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl10g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步,所述的离心收集菌体的条件均为:室温条件下,5000–8000r/min离心5–10min。
本发明所述表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌,优选大肠杆菌zjut-bvr菌株,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号:GDMCC No:61045,保藏日期2020年6月8日,该菌株的来源已在专利申请CN202010912807.8中公开。
进一步,所述分离提取胆红素的方法为:含胆红素的干菌体中,加入以干菌体重量计的50–100mL/g的二氯甲烷,充分振荡后于30℃、200W条件下超声30min,再于室温下8000r/min离心5min,收集上清液于45℃下减压浓缩至无馏分流出,残留物中加入与二氯甲烷相同体积的石油醚洗涤2次,固形物于60℃干燥得胆红素成品。
与现有技术相比,本发明提供了一种获得胆红素的新方法,有益效果主要体现在:表达胆绿素还原酶的大肠杆菌zjut-bvr经发酵培养后,收集的菌体作为生物催化剂,在柠檬酸缓冲体系中,加入胆绿素为底物,经过转化后,生成的胆红素富集在菌体中。菌体作为胆红素提取的原料,菌体中胆红素的含量最高可达2.02%,是猪胆汁中胆红素含量0.05%的40.4倍。本发明解决了目前只能从动物胆汁中提取生产胆红素难题,而且从菌体中提取胆红素的步骤相对简单,对降低胆红素的生产成本具有显著效果。
(四)附图说明
图1.生物转化胆绿素合成胆红素的反应式。
图2.生物转化反应后大肠杆菌zjut-bvr菌体照片(3个平行样)。
图3.大肠杆菌zjut-bvr生物转化合成的胆红素HPLC分析图谱,A:胆绿素标准品;B:胆红素标准品;C:菌体的甲醇-二氯甲烷萃取液。
图4.大肠杆菌zjut-bvr生物转化合成胆红素的LC-MS分析图谱。
图5.胆红素浓度—HPLC峰面积标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例中,用于培养大肠杆菌zjut-bvr菌株的LB斜面培养基、LB液体培养基和产酶培养基中,均在接种前加入终浓度为50μg/mL卡那霉素,卡那霉素以浓度为50mg/mL的水溶液的形式加入。
本发明所述的室温是指25–30℃。
实施例1
利用大肠杆菌zjut-bvr菌株生物转化胆绿素合成胆红素的方法按以下步骤操作:
(1)0.2mL的体积浓度20%甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr(GDMCC No:61045)的菌液,接种于LB斜面培养基,于37℃恒温培养24h,获得活化的斜面菌体。所述的LB斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2,121℃高压蒸汽灭菌20min。所述的20%甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr的菌液,是该菌在LB液体培养基中,37℃、200r/min培养12h后,与无菌的40%甘油水溶液等体积混合,保藏于–80℃冰箱中。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化的斜面菌体2环,接种到20mL的LB液体培养基中,37℃、200r/min摇床中培养15h,得OD600=4.96的种子液;所述的LB液体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2。100-mL三角瓶装20mL的培养基,八层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)按体积浓度3%的接种量,移取步骤(2)制备的种子液1.5mL接种于50mL的产酶培养基,于37℃、200r/min摇床中培养4.0h(OD600=1.05,未稀释测定),加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂,于30℃,200r/min的摇床中表达培养12h,得OD600=7.49的培养液,菌体干重浓度为3.61g/L。所述的产酶培养基终浓度组成为:甘油20g/L,酵母浸粉20g/L,(NH4)2SO4 5g/L,NaCl 5g/L,Na2HPO4·12H2O 15g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2。250-mL三角瓶装50mL的产酶培养基,八层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)步骤(3)制备的培养液50mL,室温条件下5000r/min离心10min,弃去上清液,加50mL的蒸馏水重悬菌体,于上述条件再次离心收集菌体,得湿菌体(按干菌体重量计为0.181g)。
(5)步骤(4)获得的全部湿菌体,加9mL的pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液,重新悬浮菌体,再加入用1mL甲醇溶解的胆绿素,使胆绿素在转化体系中的终浓度为0.055g/L,构成转化体系,于35℃、100r/min条件下转化10h。转化反应结束后,转化液于室温条件下,5000r/min离心10min,收集菌体(湿菌体照片见附图2),菌体于85℃下烘干,获得干菌体0.181g。
(6)HPLC分析样品中胆红素浓度:步骤(5)获得的全部干菌体,加20mL的甲醇-二氯甲烷混合液(体积比2:1),充分振荡后于30℃、200W条件下超声30min,再于室温下8000r/min离心5min,收集上清液并于45℃下减压浓缩至1mL,0.45μm微孔滤膜过滤,HPLC分析样品中胆红素浓度。HPLC分析结果表明:一物质出峰保留时间与标准品胆红素一致(图谱见附图3)。液质联用(LC-MS)分析(图谱见附图4)结果显示,该物质的分子量为583.9,与胆红素分子量(分子式C33H36N4O6,分子量584)一致,可以确定该物质为胆红素。
由HPLC分析结果计算得:10mL转化体系中胆红素浓度为44.1mg/L,即制备得到胆红素0.441mg,胆绿素的摩尔转化率为79.9%,由此计算得干菌体中胆红素的含量为0.244%。
所述的HPLC分析方法为:LC–20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司),色谱柱为C18-R柱(5μm,150mm×4.6mm),柱温为室温;流动相:体积比为5:95的含0.1%三氟乙酸的双蒸水和乙腈,流速1.0mL/min,检测波长450nm,进样量20μL。由相同分析条件下的标准品胆红素浓度—HPLC峰面积标准曲线(附图5),计算出检测样品中胆红素的浓度
LC-MS分析条件为:Thermo Fisher LCQTM Deca XP plus质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司),电喷雾负离子化(ESI-)检测,干燥气温度350℃,毛细管电压4.0kv,扫描范围为530–650m/z。
所述的胆绿素的摩尔转化率计算公式为:
所述的干菌体中胆红素的含量计算公式为:
实施例2
利用大肠杆菌zjut-bvr菌株生物转化胆绿素合成胆红素的方法按以下步骤操作:
(1)0.2mL的20%甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr的菌液,接种于LB斜面培养基,于37℃恒温培养24h,获得活化的斜面菌体。所述的LB斜面培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化的斜面菌体2环,接种到20mL的LB液体培养基中,37℃、200r/min摇床中培养12h,得OD600=4.77的种子液;所述的LB液体培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(3)按体积分数4%的接种量,移取步骤(1)制备的种子液2.0mL接种于50mL的产酶培养基中,于37℃、250r/min摇床中培养3.5h(OD600=0.825,未稀释测定),加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂,于32℃,200r/min的摇床中表达培养12h,得OD600=7.23的培养液,培养液的菌体干重浓度为3.44g/L。所述的产酶培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(4)步骤(3)收集的培养液50mL,室温条件下5000r/min离心10min,弃去上清液,加50mL的蒸馏水重悬菌体,于上述条件再次离心收集菌体,得湿菌体(按干菌体重量计为0.172g)。
(5)步骤(4)获得的全部湿菌体,加9mL的pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液,重新悬浮菌体,再加入用1mL甲醇溶解的胆绿素,使胆绿素在转化体系中的终浓度为0.22g/L,构成转化体系于35℃、150r/min条件下转化12h。转化反应结束后,转化液于室温条件下,5000r/min离心10min,收集菌体,菌体于85℃下烘干,获得干菌体0.172g。
(6)步骤(5)获得的全部干菌体,加20mL的甲醇-二氯甲烷混合液(体积比2:1),充分振荡后于30℃、200W条件下超声30min,再于室温下8000r/min离心5min,收集上清液并于45℃下减压浓缩至1mL,0.45μm微孔滤膜过滤,HPLC分析样品中胆红素浓度。
由HPLC分析结果计算得:10mL转化体系中胆红素浓度为163mg/L,即制备得到胆红素1.63mg,胆绿素的摩尔转化率为73.8%,由此计算得干菌体中胆红素的含量为0.948%。
实施例3
利用大肠杆菌zjut-bvr菌株生物转化胆绿素合成胆红素的方法按以下步骤操作:
(1)0.2mL的20%甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr的菌液,接种于LB斜面培养基,于37℃恒温培养24h,获得活化的斜面菌体。所述的LB斜面培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化的斜面菌体2环,接种到20mL的LB液体培养基中,37℃、150r/min摇床中培养10h,得OD600=4.15的种子液;所述的LB液体培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(3)按体积分数5%的接种量,移取步骤(1)制备的种子液2.5mL接种于50mL的产酶培养基中,于37℃、300r/min摇床中培养3.5h(OD600=0.617,未稀释测定),加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂,于32℃,300r/min的摇床中表达培养10h,得OD600=6.78的培养液,培养液的菌体干重浓度为3.14g/L。所述的产酶培养基终浓度组成和制备方法同实施例1。
(4)步骤(3)收集的培养液50mL,室温条件下5000r/min离心10min,弃去上清液,加50mL的蒸馏水重悬菌体,于上述条件再次离心收集菌体,得湿菌体(按干菌体重量计为0.157g)。
(5)步骤(4)获得的全部湿菌体,加9mL的pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液,重新悬浮菌体,再加入用1mL甲醇溶解的胆绿素,使胆绿素在转化体系中的终浓度为0.44g/L,构成转化体系于37℃、200r/min条件下转化14h。转化反应结束后,转化液于室温条件下,8000r/min离心10min,收集菌体,菌体于85℃下烘干,获得干菌体0.157g。
(6)步骤(5)获得的全部干菌体,加20mL的甲醇-二氯甲烷混合液(体积比2:1),充分振荡后于30℃、200W条件下超声30min,再于室温下8000r/min离心5min,收集上清液并于45℃下减压浓缩至1mL,0.45μm微孔滤膜过滤,HPLC分析样品中胆红素浓度。
由HPLC分析结果计算得:10mL转化体系中胆红素浓度为317mg/L,即制备得到胆红素3.17mg,胆绿素的摩尔转化率为71.8%,由此计算得干菌体中胆红素的含量为2.02%。
实施例4
从含胆红素的干菌体中分离纯化胆红素的方法,按以下步骤操作:
按实施例3制备的干菌体1g,加入50mL的二氯甲烷,充分振荡后于30℃、200W条件下超声30min,再于室温下8000r/min离心5min,收集上清液于45℃下减压浓缩至无馏分流出,残留物中加入与二氯甲烷相同体积的石油醚洗涤2次,固形物于60℃干燥得胆红素成品。
按上述分离纯化步骤,从胆红素含量为2.02%的1g干菌体中,获得胆红素成品18.7mg,胆红素含量为78.2%。
Claims (6)
1.一种生物转化法合成胆红素的方法,其特征在于所述方法为:将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌菌株产酶培养后的发酵液离心,收集菌体,经蒸馏水洗涤后作为生物催化剂,以pH 5.8、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液为反应介质,加入胆绿素为底物,以甲醇为助溶剂构成转化体系,在35–37℃、100–200r/min恒温振荡条件下转化10–14h,转化反应结束后,将转化液离心,收集菌体,获得含胆红素的菌体,分离提取,获得胆红素。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在转化体系中,所述生物催化剂用量按干菌体重量计为15–18g/L;所述的底物加入终浓度为0.055–0.44g/L,所述助溶剂加入体积终浓度为10%。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述生物催化剂按如下方法制备:将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌接种至含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基中,于35–37℃、200–300r/min摇床中培养至OD600=0.6–1.0,加入终浓度为0.5–1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷作为诱导剂,在30–32℃,200–300r/min的摇床中表达培养只OD600=6.8–7.5,培养液离心,收集菌体;所述的产酶培养基终浓度组成为:甘油15–20g/L,酵母浸粉15–20g/L,(NH4)2SO4 3–5g/L,NaCl 3–5g/L,Na2HPO4·12H2O 10–15g/L,KH2PO4 2–5g/L,MgSO4·7H2O0.5–1.0g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于产酶培养基终浓度组成为:甘油20g/L,酵母浸粉20g/L,(NH4)2SO4 5g/L,NaCl 5g/L,Na2HPO4·12H2O 15g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌在产酶培养前,先经活化培养,再经过种子扩大培养,获得种子液再以体积浓度3%–5%的接种量接入产酶培养基进行培养:
(1)活化培养:将表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基,于37℃恒温培养24h,获得斜面菌体;所述的LB斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4;
(2)种子扩培:挑取步骤(1)的斜面菌体2环,接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,35–37℃、150–200r/min摇床中培养至OD600=4.0–5.0,获得种子液;所述的LB液体培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为去离子水,pH 7.2–7.4。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述表达胆绿素还原酶的重组大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)GDMCC No:61045。
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