CN102965407A - 一种利普司他汀生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利普司他汀生产工艺，采用特定的发酵培养基发酵培养毒三素链霉菌，经发酵、纯化、精制而获得利普司他汀。本发明以黄豆粉、葵花油、甘油等作为发酵培养基的主要氮源和碳源，并通过调控发酵工艺和纯化工艺，获得高纯度利普司他汀，使利普司他汀的生产成本大大降低，发酵效价提高，解决了现有技术中存在的生产成本高、发酵效价低的缺点。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，更具体的，本发明涉及一种利普司他汀的新的生产工艺。
背景技术
利普司他汀(英文名Lipstatin)，白色油状物，是一种用于生产新型减肥药奥利司他的医药中间体。奥利司他是由发酵物利普司他汀经一步加氢还原制得。奥利司他目前是全球唯一的减肥类药品，是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。
毒三素链霉菌(拉丁学名：Streptomycestoxytricini )为链霉菌科、链霉菌属，孢子丝长，顶端2-3圈紧密大螺旋形。孢子椭圆形至柱形，表面光滑。抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母、颗粒青霉。
现有技术中，发酵生产利普司他汀的工艺存在生产成本高(约2500~3000元/千克)、发酵效价低(约7000mg/L)的缺点。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生产成本低、发酵效价高的利普司他汀的新的生产工艺。
为实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案。
一种利普司他汀生产工艺，包括以下步骤：
(1) 按2%-10%的接种量，在发酵培养基中接种毒三素链霉菌菌液，26℃~30℃发酵140~198小时，控制发酵液pH值为6.8~7.8，搅拌速度为60-160rpm；所述菌液中菌种浓度为15%-25%；
以质量百分含量计，所述发酵培养基包括：甘油2.5%-6.5%、黄豆粉3%-8.5%、卵磷脂0.5%-2%、葵花油3%-10%、硫酸镁0.01%-0.15%、碳酸钙0.05%-0.4%；
(2) 发酵结束后，酸处理，使发酵液的pH值为2-7，喷雾干燥获得干菌丝体；
(3) 将干菌丝体加入1-14倍体积的丙酮中，浸泡8~24小时，板框过滤除去菌丝，收集滤液；
(4) 在滤液中加入纯水，得到浓度为35%~55%的丙酮溶液；加入12-18倍体积的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；
(5) 减压浓缩至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；加入15-25倍体积的乙腈，冷却后，分层除油，收集乙腈相；
(6) 减压浓缩至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；加入8-12倍体积的己烷，上硅胶柱进行吸附；吸附完毕后，己烷洗脱，收集洗脱液；
(7) 减压浓缩洗脱液至无馏分析出；二次结晶，收集晶体，减压浓缩，即得。
上述发酵培养基以黄豆粉、葵花油、甘油等作为主要氮源和碳源。所述发酵培养基的筛选，是在首先了解单个因素对毒三素链霉菌生长及利普司他汀表达的影响后，再通过正交实验综合考虑各因素之间的交互作用，经统计学分析后确定培养基配方的。同时进行发酵工艺检验和优选，从而选定发酵工艺，通过一系列纯化工艺检验与优化，从而确定了最终的纯化工艺。
优选地，步骤(1)中，所述发酵培养基包括：甘油4.5%、黄豆粉6.5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸镁0.15%、碳酸钙0.4%。
优选地，所述发酵培养基还包括适量微量元素。添加微量元素促进了菌种对数期前体物质的转化。
优选地，步骤(1)中发酵温度为27±1℃，发酵时间为140-192小时。
优选地，步骤(2)中采用25%-45%的硫酸进行酸处理，使发酵液的pH为4。
优选地，步骤(3)中加入10-14倍体积的丙酮中，浸泡12-16小时。
优选地，步骤(4)中丙酮溶液的浓度为45-55%。
优选地，步骤(6)中所述硅胶柱中的硅胶为80-120目。选择这样的目数是为了分离利普司他汀，使其与其他杂质分开。
通过上述工艺提高了发酵水平，使发酵水平达到10000mg/L以上，增加了回收率，使回收率达到75%。
本发明的利普司他汀生产工艺采用特定的发酵培养基发酵培养毒三素链霉菌，并通过控制发酵工艺和纯化工艺，经发酵、纯化、精制而获得利普司他汀，生产成本大大降低，发酵效价提高，具体地说，具有以下有益效果：
1、发酵时间短，一般6天即可达到最大发酵产量的90%；
2、菌体得率高，可达到250~350克（菌体湿重）/升（发酵液）；
3、发酵成本低，比当前成本低15%；
4、分离工艺精密，获得产物纯度高，获得的利普司他汀含量可以达到98%；
5、利普司他汀效价高（包括相对含量和绝对含量），其表达量可达到8000mg/L到14000mg/L。
附图说明
图1是本发明实施例1的产物利普司他汀的HPLC图谱；
图2是本发明实施例2的产物利普司他汀的HPLC图谱；
图3是本发明实施例3的产物利普司他汀的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的描述。
以下实施例均以20L发酵罐进行说明，所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均为工业级，含量均大于95%。
实施例1 一种利普司他汀生产工艺
包括如下步骤：
A、配制发酵培养基
按质量百分含量计，20L发酵培养基的配方为：甘油2.5%、黄豆粉3%、卵磷脂1.5%、葵花油5%、硫酸镁0.01%、碳酸钙0.05%，微量元素适量(氯化锰：0.001%，氯化锌0.0015%)，余量为去离子水。常规方法灭菌培养基。
B、接种，发酵培养
在发酵培养基中接种毒三素链霉菌菌液，接种量为发酵液的5%(V/V)，菌液的菌种浓度为15%；27℃±1℃发酵8天；采用氢氧化钠和盐酸自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在7.0；发酵过程中，通过通气量和搅拌速度调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在50%，在该实施例中，搅拌速度为90rpm；
C、纯化发酵产物
(1) 发酵结束后，用25%-45%的硫酸酸处理发酵液，使发酵液的pH值为4，采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；
(2) 将干菌丝体加入8倍体积的丙酮溶液中，浸泡10小时，板框过滤除去菌丝，收集滤液；
(3) 在滤液中加入纯水，得到浓度为35%的丙酮溶液；加入15倍体积正庚烷，进行萃取，收集正庚烷相；
(4) 减压浓缩正庚烷相至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；加入20倍体积乙腈，冷却后，分层除油；
(5) 收集乙腈相，减压浓缩至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；加入10倍体积己烷，上80-120目硅胶柱进行吸附；吸附完毕后，己烷洗脱，收集洗脱液；
(6) 减压浓缩洗脱液至无馏分析出；二次结晶，收集晶体，减压浓缩，即得利普司他汀。
经步骤B发酵培养后，测定菌体得率，结果为300克（菌体湿重）/升（发酵液）；经步骤C纯化发酵产物后，HPLC测定利普司他汀的效价，结果为11800mg/L。
如图1所示，为本实施例制备得到的利普司他汀的HPLC图谱，从图1可以得出，本实施例的利普司他汀的纯度为96.4%。
实施例2 一种利普司他汀生产工艺
包括如下步骤：
A、配制发酵培养基
按质量百分含量计，20L发酵培养基的配方为：甘油3%、黄豆粉4.5%、卵磷脂2%、葵花油8%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.2%，微量元素适量(氯化锰：0.001%，氯化锌0.0015%)，余量为去离子水。常规方法灭菌培养基。
B、接种，发酵培养
在发酵培养基中接种毒三素链霉菌菌液，接种量为发酵液的8%(V/V)，菌液的菌种浓度为20%；27℃±1℃发酵7天；采用氢氧化钠和盐酸自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在7.0；发酵过程中，通过通气量和搅拌速度调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在45%，在该实施例中，搅拌速度为100rpm；
C、纯化发酵产物
(1) 发酵结束后，用25%-45%的硫酸酸处理发酵液，使发酵液的pH值为4，采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；
(2) 将干菌丝体加入10倍体积的丙酮溶液中，浸泡8小时，板框过滤除去菌丝，收集滤液；
(3) 在滤液中加入纯水，得到浓度为45%的丙酮溶液；加入15倍体积正庚烷，进行萃取，收集正庚烷相；
(4) 减压浓缩正庚烷相至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；加入20倍体积乙腈，冷却后，分层除油；
(5) 收集乙腈相，减压浓缩至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；加入10倍体积己烷，上80-120目硅胶柱进行吸附；吸附完毕后，己烷洗脱，收集洗脱液；
(6) 减压浓缩洗脱液至无馏分析出；二次结晶，收集晶体，减压浓缩，即得利普司他汀。
经步骤B发酵培养后，测定菌体得率，结果为320克（菌体湿重）/升（发酵液）；经步骤C纯化发酵产物后，HPLC测定利普司他汀的效价，结果为12400mg/L。
如图2所示，为本实施例制备得到的利普司他汀的HPLC图谱，从图1可以得出，本实施例的利普司他汀的纯度为97.7%。
实施例3 一种利普司他汀生产工艺
包括如下步骤：
A、配制发酵培养基
按质量百分含量计，20L发酵培养基的配方为：甘油4.5%、黄豆粉6.5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸镁0.15%、碳酸钙0.4%，微量元素适量(氯化锰：0.001%，氯化锌0.0015%)，余量为去离子水。常规方法灭菌培养基。
B、接种，发酵培养
在发酵培养基中接种毒三素链霉菌菌液，接种量为发酵液的10%(V/V)，菌液的菌种浓度为20%；27℃±1℃发酵8天；采用氢氧化钠和盐酸自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在7.0；发酵过程中，通过通气量和搅拌速度调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在50%，在该实施例中，搅拌速度为120rpm；
C、纯化发酵产物
(1) 发酵结束后，用25%-45%的硫酸酸处理发酵液，使发酵液的pH值为2，采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；
(2) 将干菌丝体加入14倍体积的丙酮溶液中，浸泡12小时，板框过滤除去菌丝，收集滤液；
(3) 在滤液中加入纯水，得到浓度为55%的丙酮溶液；加入15倍体积正庚烷，进行萃取，收集正庚烷相；
(4) 减压浓缩正庚烷相至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；加入20倍体积乙腈，冷却后，分层除油；
(5) 收集乙腈相，减压浓缩至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；加入10倍体积己烷，上80-120目硅胶柱进行吸附；吸附完毕后，己烷洗脱，收集洗脱液；
(6) 减压浓缩洗脱液至无馏分析出；二次结晶，收集晶体，减压浓缩，即得利普司他汀。
经步骤B发酵培养后，测定菌体得率，结果为350克（菌体湿重）/升（发酵液）；经步骤C纯化发酵产物后，HPLC测定利普司他汀的效价，结果为14300mg/L。
如图3所示，为本实施例制备得到的利普司他汀的HPLC图谱，从图1可以得出，本实施例的利普司他汀的纯度为98.2%。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种利普司他汀生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 按2%-10%的接种量，在发酵培养基中接种毒三素链霉菌菌液，26℃~30℃发酵140~198小时，控制发酵液pH值为6.8~7.8，搅拌速度为60-160rpm；所述菌液中菌种浓度为15%-25%；
以质量百分含量计，所述发酵培养基包括：甘油2.5%-6.5%、黄豆粉3%-8.5%、卵磷脂0.5%-2%、葵花油3%-10%、硫酸镁0.01%-0.15%、碳酸钙0.05%-0.4%；
(2) 发酵结束后，酸处理，使发酵液的pH值为2-7，喷雾干燥获得干菌丝体；
(3) 将干菌丝体加入1-14倍体积的丙酮中，浸泡8~24小时，板框过滤除去菌丝，收集滤液；
(4) 在滤液中加入纯水，得到浓度为35%~55%的丙酮溶液；加入12-18倍体积的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；
(5) 减压浓缩至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；加入15-25倍体积的乙腈，冷却后，分层除油，收集乙腈相；
(6) 减压浓缩至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；加入8-12倍体积的己烷，上硅胶柱进行吸附；吸附完毕后，己烷洗脱，收集洗脱液；
(7) 减压浓缩洗脱液至无馏分析出；二次结晶，收集晶体，减压浓缩，即得。
2.根据权利要求1所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基包括：甘油4.5%、黄豆粉6.5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸镁0.15%、碳酸钙0.4%。
3.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，所述发酵培养基还包括适量微量元素。
4.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(1)中发酵温度为27±1℃，发酵时间为140-192小时。
5.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(2)中采用25%-45%的硫酸进行酸处理，使发酵液的pH为4。
6.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(3)中加入10-14倍体积的丙酮中，浸泡12-16小时。
7.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(4)中丙酮溶液的浓度为45-55%。
8.根据权利要求1或2所述的利普司他汀生产工艺，其特征在于，步骤(6)中所述硅胶柱中的硅胶为80-120目。
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