CN102827892A

CN102827892A - 一种尼泊司他汀生产工艺

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Publication number: CN102827892A
Application number: CN2012103477117A
Authority: CN
Inventors: 李海霞; 朱善超
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明公开了一种尼泊司他汀生产工艺，包括如下流程：A、用发酵液培养基和去离子水配制发酵液；B、发酵；C、发酵产物纯化；所述发酵液培养基采用以下原料制成：甘油、黄豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸镁和碳酸钙；配制成的发酵液中，上述各原料的百分比含量分别为：甘油1％-4.5％、黄豆粉2％-6.5％、卵磷脂1.5％-4％、葵花油5％-12％、硫酸镁0.01％-0.15％、碳酸钙0.05％-0.4％。本发明以黄豆粉、葵花油、甘油等作为发酵培养基的主要氮源和碳源，并通过调控发酵工艺及培养基组份，采用毒三素链霉菌经过发酵、纯化、精制而获得高纯度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生产成本大大降低，发酵效价提高，解决了现有技术中存在的生产成本高、发酵效价低的缺点。

Description

一种尼泊司他汀生产工艺

技术领域

本发明涉及一种尼泊司他汀生产工艺。

背景技术

尼泊司他汀，英文名称：Lipstatin，白色油状物，是一种用于生产新型减肥药奥利司他的医药中间体。奥利司他是由发酵物尼泊司他汀经一步加氢还原制得。奥利司他目前是全球唯一的减肥类药品，是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。

毒三素链霉菌，拉丁学名：Streptomycestoxytricini，为链霉菌科、链霉菌属，孢子丝长，顶端2-3圈紧密大螺旋形。孢子椭圆形至柱形，表面光滑。抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母、颗粒青霉。

现有技术中，发酵生产尼泊司他汀的工艺存在的生产成本高、发酵效价低的缺点。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种生产成本低、发酵效价高的尼泊司他汀生产工艺。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：包括如下流程：

A、用发酵液培养基和去离子水配制发酵液

所述发酵液培养基采用以下原料制成：甘油、黄豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸镁和碳酸钙；配制成的发酵液中，上述各原料的百分比含量分别为：甘油1％-4.5％、黄豆粉2％-6.5％、卵磷脂1.5％-4％、葵花油5％-12％、硫酸镁0.01％-0.15％、碳酸钙0.05％-0.4％；

B、发酵

B1、在发酵液中接种毒三素链霉菌菌种，菌种的接种量为发酵液的2％-10％，菌种的细菌浓度为15％-25％；

B2、菌种发酵过程中，发酵液的温度控制在26℃-29℃，发酵时间为6-8天；

B3、菌种发酵过程中，采用酸碱自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在6.8～7.8之间；

B4、菌种发酵过程中，通过通气量和搅拌速度自动调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在35％以上，所述搅拌速度为60-160rpm；

C、发酵产物纯化，包括如下步骤：

C1、发酵结束后，酸化处理发酵液，使发酵液的pH值调节为1-6，并采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；

C2、将干菌丝体加入1-14倍体积的丙酮溶液中，浸泡4～12小时，半框过滤除去菌丝，收集滤液；

C3、在滤液补加纯水，制得丙酮浓度为35％～55％的丙酮稀释液；

C4、向丙酮稀释液中加入正庚烷，并进行萃取，萃取后收集正庚烷相；

C5、对正庚烷相进行减压浓缩，至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；

C6、向正庚烷浓缩液中加入乙腈，冷却后，分层除油；

C7、收集乙腈相，并对其减压浓缩，至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；

C8、用己烷稀释乙腈浓缩液，然后，上硅胶柱进行吸附；

C9、吸附完毕后，用己烷洗脱，收集洗脱液；

C10、对洗脱液进行减压浓缩，至无馏分析出；

C11、二次结晶，收集晶体，减压浓缩，制得高纯度尼泊司他汀。

进一步地说：

所述尼泊司他汀发酵液培养基中还包含有适量的微量元素。

所述B3步骤中，采用氢氧化钠和盐酸对发酵液的pH值进行自动平衡调节。

所述C1步骤中，采用25％-45％的硫酸对发酵液进行酸处理。

所述发酵产物纯化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均为工业级，含量均大于95％。

所述C8步骤中，所述硅胶柱采用的硅胶为80-120目。

与现有技术相比，本发明以黄豆粉、葵花油、甘油等作为发酵培养基的主要氮源和碳源，并通过调控发酵工艺及培养基组份，采用毒三素链霉菌经过发酵、纯化、精制而获得高纯度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生产成本大大降低，发酵效价提高，解决了现有技术中存在的生产成本高、发酵效价低的缺点。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。说明书附图

图1是本发明的实施例1所述生产工艺的产物尼泊司他汀含量HPLC图；

图2是本发明的实施例2所述生产工艺的产物尼泊司他汀含量HPLC图；

图3是本发明的实施例3所述生产工艺的产物尼泊司他汀含量HPLC图。

具体实施方式

以20L发酵罐为例，对本发明所述的尼泊司他汀生产工艺作进一步描述。

实施例1：

一种尼泊司他汀生产工艺，包括如下流程：

A、把发酵液培养基和去离子水投入20L发酵罐配制20L发酵液

所述发酵液培养基采用以下原料制成：甘油、黄豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸镁、碳酸钙和微量元素；配制成的发酵液中，上述各原料的百分比含量分别为：甘油1％、黄豆粉2％、卵磷脂1.5％、葵花油5％、硫酸镁0.01％、碳酸钙0.05％，微量元素适量，余量为去离子水。

B、发酵

B1、对配制好发酵液进行灭菌，然后在发酵液中接种毒三素链霉菌菌种，菌种的接种量为发酵液的5％，菌种的细菌浓度为15％；

B2、菌种发酵过程中，发酵液的温度控制在27℃±1℃，发酵时间为8天；

B3、菌种发酵过程中，采用氢氧化钠和盐酸自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在7.0之间；

B4、菌种发酵过程中，通过通气量和搅拌速度自动调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在50％，所述搅拌速度为90rpm；

C、发酵产物纯化，包括如下步骤：

C1、发酵结束后，用25％-45％的硫酸酸化处理发酵液，使发酵液的pH值调节为4，并采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；

C2、将干菌丝体加入8倍体积的丙酮溶液中，浸泡10小时，半框过滤除去菌丝，收集滤液；

C3、在滤液补加纯水，制得丙酮浓度为35％的丙酮稀释液；

C6、向正庚烷浓缩液中加入乙腈，冷却后，分层除油；

C8、用己烷稀释乙腈浓缩液，然后，上硅胶柱进行吸附；

C9、吸附完毕后，用己烷洗脱，收集洗脱液；

C10、对洗脱液进行减压浓缩，至无馏分析出；

C11、二次结晶，收集晶体，减压浓缩，制得高纯度尼泊司他汀，菌体得率为300克(菌体湿重)/升(发酵液)，尼泊司他汀效价为11800mg/升，纯度为96.4％，如图1所示。

实施例2：

一种尼泊司他汀生产工艺，包括如下流程：

A、把发酵液培养基和去离子水投入20L发酵罐配制20L发酵液

所述发酵液培养基采用以下原料制成：甘油、黄豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸镁、碳酸钙和微量元素；配制成的发酵液中，上述各原料的百分比含量分别为：甘油3％、黄豆粉4.5％、卵磷脂3％、葵花油8％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.2％，微量元素适量，余量为去离子水。

B、发酵

B1、对配制好发酵液进行灭菌，然后在发酵液中接种毒三素链霉菌菌种，菌种的接种量为发酵液的8％，菌种的细菌浓度为20％；

B2、菌种发酵过程中，发酵液的温度控制在27℃±1℃，发酵时间为7天；

B4、菌种发酵过程中，通过通气量和搅拌速度自动调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在45％，所述搅拌速度为100rpm；

C、发酵产物纯化，包括如下步骤：

C2、将干菌丝体加入10倍体积的丙酮溶液中，浸泡8小时，半框过滤除去菌丝，收集滤液；

C3、在滤液补加纯水，制得丙酮浓度为45％的丙酮稀释液；

C6、向正庚烷浓缩液中加入乙腈，冷却后，分层除油；

C8、用己烷稀释乙腈浓缩液，然后，上硅胶柱进行吸附；

C9、吸附完毕后，用己烷洗脱，收集洗脱液；

C10、对洗脱液进行减压浓缩，至无馏分析出；

C11、二次结晶，收集晶体，减压浓缩，制得高纯度尼泊司他汀，菌体得率为320克(菌体湿重)/升(发酵液)，尼泊司他汀效价为12400mg/升，纯度为97.7％，如图2所示。

实施例3：

一种尼泊司他汀生产工艺，包括如下流程：

A、把发酵液培养基和去离子水投入20L发酵罐配制20L发酵液

所述发酵液培养基采用以下原料制成：甘油、黄豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸镁、碳酸钙和微量元素；配制成的发酵液中，上述各原料的百分比含量分别为：甘油4.5％、黄豆粉6.5％、卵磷脂4％、葵花油12％、硫酸镁0.15％、碳酸钙0.4％，微量元素适量，余量为去离子水。

B、发酵

B1、对配制好发酵液进行灭菌，然后在发酵液中接种毒三素链霉菌菌种，菌种的接种量为发酵液的10％，菌种的细菌浓度为20％：

B2、菌种发酵过程中，发酵液的温度控制在27℃±1℃，发酵时间为8天：

B4、菌种发酵过程中，通过通气量和搅拌速度自动调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在50％，所述搅拌速度为120rpm；

C、发酵产物纯化，包括如下步骤：

C1、发酵结束后，用25％-45％的硫酸酸化处理发酵液，使发酵液的pH值调节为1，并采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；

C2、将干菌丝体加入14倍体积的丙酮溶液中，浸泡12小时，半框过滤除去菌丝，收集滤液；

C3、在滤液补加纯水，制得丙酮浓度为55％的丙酮稀释液；

C6、向正庚烷浓缩液中加入乙腈，冷却后，分层除油；

C8、用己烷稀释乙腈浓缩液，然后，上硅胶柱进行吸附；

C9、吸附完毕后，用己烷洗脱，收集洗脱液；

C10、对洗脱液进行减压浓缩，至无馏分析出；

C11、二次结晶，收集晶体，减压浓缩，制得高纯度尼泊司他汀，菌体得率为350克(菌体湿重)/升(发酵液)，尼泊司他汀效价为14300mg/升，纯度为98.2％，如图3所示。

本发明所述发酵液培养基的筛选，是在首先了解单个因素对毒三素链霉菌生长及尼泊司他汀表达的影响后，再通过正交实验综合考虑各因素之间的交互作用，经统计学分析后确定发酵配方，同时进行发酵工艺检验和优选，从而选定发酵工艺，通过一系列纯化工艺检验与优化，从而确定了最终的纯化工艺。

综上所述，本发明具有如下特点：

1、菌体得率高，可达到250～350克(菌体湿重)/升(发酵液)；

2、尼泊司他汀表达量高(包括相对含量和绝对含量)，其表达量可达到8000mg/升到14000mg/升；

3、发酵时间短，一般6天即可达到最大发酵产量的90％；

4、发酵成本低，比当前成本低15％；

5、分离工艺精密，获得产物纯度高，获得的尼泊司他汀含量可以达到98％。

Claims

1.一种尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：包括如下流程：

(A)用发酵液培养基和去离子水配制发酵液

(B)发酵

(B1)在发酵液中接种毒三素链霉菌菌种，菌种的接种量为发酵液的2％-10％，菌种的细菌浓度为15％-25％；

(B2)菌种发酵过程中，发酵液的温度控制在26℃-29℃，发酵时间为6-8天；

(B3)菌种发酵过程中，采用酸碱自动平衡来调节发酵液的pH值，使pH值维持在6.8～7.8之间；

(B4)菌种发酵过程中，通过通气量和搅拌速度自动调节发酵液的溶氧水平，使溶氧水平维持在35％以上，所述搅拌速度为60-160rpm；

(C)发酵产物纯化，包括如下步骤：

(C1)发酵结束后，酸化处理发酵液，使发酵液的pH值调节为1-6，并采用喷雾干燥的方法获得干菌丝体；

(C2)将干菌丝体加入1-14倍体积的丙酮溶液中，浸泡4～12小时，半框过滤除去菌丝，收集滤液；

(C3)在滤液补加纯水，制得丙酮浓度为35％～55％的丙酮稀释液；

(C4)向丙酮稀释液中加入正庚烷，并进行萃取，萃取后收集正庚烷相；

(C5)对正庚烷相进行减压浓缩，至无馏分析出，制得正庚烷浓缩液；

(C6)向正庚烷浓缩液中加入乙腈，冷却后，分层除油；

(C7)收集乙腈相，并对其减压浓缩，至无馏分析出，制得乙腈浓缩液；

(C8)用己烷稀释乙腈浓缩液，然后，上硅胶柱进行吸附；

(C9)吸附完毕后，用己烷洗脱，收集洗脱液；

(C10)对洗脱液进行减压浓缩，至无馏分析出；

(C11)二次结晶，收集晶体，减压浓缩，制得高纯度尼泊司他汀。

2.根据权利要求1所述的尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：所述尼泊司他汀发酵液培养基中还包含有适量的微量元素。

3.根据权利要求1所述的尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：所述(B3)步骤中，采用氢氧化钠和盐酸对发酵液的pH值进行自动平衡调节。

4.根据权利要求1所述的尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：所述(C1)步骤中，采用25％-45％的硫酸对发酵液进行酸处理。

5.根据权利要求1所述的尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：所述发酵产物纯化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均为工业级，含量均大于95％。

6.根据权利要求1所述的尼泊司他汀生产工艺，其特征在于：所述(C8)步骤中，所述硅胶柱采用的硅胶为80-120目。