CN104046671B

CN104046671B - 一种发酵生产唾液酸的方法

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Publication number: CN104046671B
Application number: CN201410285753.1A
Authority: CN
Inventors: 刘丽波; 谢凤英; 李春; 迟涛; 刘宁; 王敏; 梁婉婷; 祁昕
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: CN104046671A

Abstract

本发明公开了一种发酵生产唾液酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明是将种子液加入到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，通过补加流加液和过氧化氢溶液的方式连续发酵生产含有聚唾液酸的发酵液，再通过离心分离、乙醇沉淀、过滤的方式获取精制聚唾液酸，再对聚唾液酸进行酸解和结晶，最后洗涤冻干后获得唾液酸粉末。利用本发明所提供的方法生产聚唾液酸的产量可达12.96g/L，较目前已报道的聚唾液酸的最大含量提高了87.28％，聚唾液酸的水解率为95％，纯化后唾液酸的含量达到10.01g/L，纯度达到94.80％，适于产业化推广应用。

Description

一种发酵生产唾液酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产唾液酸的方法，属于生物工程技术领域。

技术背景

唾液酸(Sialic acids)是一族神经氨酸的衍生物，最常见的是N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，NANA)，通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸的主要食物来源是母乳，在牛奶、鸡蛋和奶酪中也存在唾液酸。近年来，唾液酸及其衍生物在食品、保健品和医药上的应用有着日益广阔的发展前景，尤其是在婴幼儿配方奶粉中的应用，研究发现，可以通过饮食补充外源性唾液酸以增加脑部唾液酸的含量。这也预示着在婴儿奶粉，特别是针对早产儿的婴儿奶粉中添加唾液酸将有效地促进他们的神经系统和大脑的发育，同时进一步影响他们在生长发育早期的智力发育，并且在抗炎、抗病毒、抗癌、抗识别等方面起着十分重要的作用。

近年来，科学家已经发现其具有许多重要的生物学功能，随着研究的深入，其应用领域也越来越广泛，但唾液酸的国际市场价格较高，国内也没有公开成型的大规模生产方法，因此生产高产量的唾液酸成为人们急需解决的问题。目前，除了微生物发酵法产唾液酸外，还有化学合成法、酶合成法、天然产物提取法，但化学合成法反应条件苛刻，收率低，酶法合成原料要求高，价格较为昂贵，而且唾液酸醛缩酶不易获得，限制了生产规模的扩大，唾液酸在天然原料中含量比较低，而且组成成分远比发酵液中复杂，分离提纯过程复杂。现有文献报道的微生物发酵法生产终产物唾液酸因所用的菌株不同，终产物的产量也不同，1990年，Camino等利用Escherichia coli K92发酵生产聚唾液酸，产量为0.45g/L；1998年，郭良栋等，用Escherichia coli C-8发酵生产聚唾液酸，产量为1.200g/L；2008年，Bastian等利用Escherichia coli K1进行分批补料发酵生产聚唾液酸的产量为1.600g/L；2009年，张琦等，用Escherichia coli K235-WXJ4合成聚唾液酸达到6.638g/L，纯度为99.71％；2011年，刘金龙等用Escherichia coli CCTCC M208088合成聚唾液酸量达到6.92g/L，纯度达到99.9％。

聚唾液酸经过酸水解后可得到唾液酸，再经过分离提纯才能得到纯度较高的唾液酸。目前已报道的相关文献几乎都是检测的聚唾液酸的含量，最大产量为6.92g/L，没有进一步的水解，或是水解后直接提纯唾液酸，并没有报道唾液酸的含量。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产唾液酸的方法，该方法显著提高了唾液酸的产量，所采取的技术方案如下：

一种发酵生产唾液酸的方法，是将种子液加入到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，通过补加流加液和过氧化氢溶液的方式连续发酵生产含有聚唾液酸的发酵液，再通过离心分离、乙醇沉淀、过滤的方式获取精制聚唾液酸，再对聚唾液酸进行酸解和结晶，最终洗涤冻干后获得唾液酸粉末。

所述方法的步骤如下：

1)发酵液的制备：将种子液和丙酮酸钠加入到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程中补加过氧化氢溶液和流加液，并不断搅拌，发酵结束后获得发酵液；

2)聚唾液酸的提取：离心分离步骤1)所得发酵液，收集上清液并用乙醇溶液沉淀，离心干燥沉淀物后，再用去离子水复溶，过滤除去不溶物，再次加入乙醇溶液沉淀，离心后冻干沉淀，获得精制聚唾液酸；

3)聚唾液酸的酸解：利用盐酸酸解步骤2)所得精致聚唾液酸，再向水解溶液中加入冰乙酸结晶，再用冰乙酸洗涤结晶后，真空干燥获得唾液酸。

所述方法步骤1)所述种子液制备方法是，从大肠杆菌K235甘油菌中，取100μL接种到5mL种子培养基中，37℃，恒温培养12h，按2％的接种量将培养好的菌液再接种到含100mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，250r/min摇床培养12h，按2％的接种量再次接到100mL种子培养基中培养8～10h，培养结束后获得发酵种子液；

所述种子培养基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，pH7.2-7.4；

所述发酵培养基的配方为25g/L山梨醇，2.5g/L硫酸铵，1.5g/L酵母提取物，2.5g/L磷酸氢二钾，0.9g/L无水硫酸镁，0.002g/L无水硫酸铜，pH7.6-8.0，其余成分为蒸馏水；

所述流加液含有307.17g/L山梨醇，30.65g/L硫酸铵，pH7.6-8.0。

所述方法步骤1)所述丙酮酸钠的添加量为4.14g/L发酵培养基；所述补加过氧化氢溶液是分别在发酵5、10、15、20h时按0.4015、0.8025、1.605、1.605mL/L发酵培养基的添加量补加；所述补加流加液是在发酵8h时按50ml/L发酵培养基的添加量补加。

所述方法步骤1)所述发酵，发酵温度为37℃，发酵时间40h，pH7.78，通气量1V/V·min；所搅拌发酵12h前，搅拌速度为400r/min，发酵12h后，搅拌速度为600r/min。

所述方法步骤2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇浓度为75％，添加量为3倍体积上清液，第二次沉淀乙醇溶液浓度为95％，添加量为3倍体积滤液；所述离心，离心发酵液转速为8000r/min，离心时间10min，离心乙醇沉淀液转速为10000r/min，离心时间10min。

所述方法步骤3)所述酸解是85℃下，用0.1M盐酸酸解2％的聚唾液酸溶液，酸解时间2h。

所述方法步骤3)所述冰乙酸结晶，冰乙酸添加量为5倍体积的唾液酸单体溶液，结晶温度为4℃，结晶时间3d。

所述方法的具体步骤为：

1)将67.6mL种子液加入到已灭菌的含有2L发酵培养基的发酵罐中，同时加入8.18g丙酮酸钠，并分别在发酵5、10、15、20h后补加0.803、1.605、3.210、3.210mL的过氧化氢溶液，在发酵8h后补加100mL灭菌流加液，发酵12h前搅拌速度为400r/min，12h后搅拌速度为600r/min，pH7.78，在37℃下发酵40h后，获得发酵液；

2)将步骤1)所得发酵液在8000r/min转速下离心10min，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入3倍体积的75％的乙醇，10000r/min下离心10min，分离沉淀物并真空干燥，再将干燥物溶于10倍质量的去离子水中，用1.5％硅藻土助滤剂过滤，向滤液中加入3倍体积的95％的乙醇溶液，10000r/min下离心10min，冻干沉淀物，获得精制聚唾液酸；

3)将步骤2)所得精制聚唾液酸配制成2％的溶液，用0.1mol/L盐酸，85℃下酸解2h，得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍体积的冰乙酸，4℃下静置，结晶3d，再将晶桨抽滤除去冰乙酸，得到唾液酸晶体，再用5倍质量的冰乙酸洗涤体积，最后将晶体在50℃下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。

本发明所用发酵的原始菌株为Escherichia coli K235(ATCC13027)。本发明的有益效果：

本发明利用原始菌株Escherichia coli K235(ATCC13027)生产聚唾液酸的产量为12.96g/L，较目前已报道的聚唾液酸的最大含量提高了87.28％，聚唾液酸的水解率为95％，纯化后唾液酸的含量达到10.01g/L，纯度达到94.80％。本发明所生产的聚唾液酸的产量具有明显的优势，为其在食品、保健、医药上日益广阔的应用前景提供了有利的条件。

附图说明

图1为实施例1碳源优化发酵过程中菌体的吸光度；

(A1，山梨醇浓度30g/L；A2，山梨醇浓度40g/L；A3，山梨醇浓度50g/L)。

图2为实施例1碳源优化发酵过程中残留山梨醇的质量浓度；

图3为实施例1碳源优化发酵过程中唾液酸的质量浓度；

图4为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中菌体的吸光度；

(B1，硫酸铵浓度3g/L；B2，硫酸铵浓度4g/L；B3，硫酸铵浓度5g/L)。

图5为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中硫酸铵的质量浓度；

图6为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中唾液酸的质量浓度；

图7为搅拌速度对菌体生长的影响；

(a，同搅拌速率对菌体生长的影响；b，不同搅拌速率下菌体的比生长速率)。

图8为搅拌速度对唾液酸产量的影响；

(a，不同搅拌速率对终产物唾液酸产量的影响；b，不同搅拌速率下终产物唾液酸的比合成速率)。

图9为各因素交互作用对菌体发酵产唾液酸的影响的响应面图和等高线图。

图10为唾液酸高效液相色谱检测图；

(a，唾液酸标准物质的高效液相色谱图；b，唾液酸样品的高效液相色谱图)。

图11为发酵液中提取并纯化后的唾液酸红外光谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵生产唾液酸的方法，该方法可大幅提高唾液酸的产量，为唾液酸在食品、保健、医药等方面的应用提供支持。下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1发酵培养基碳氮源的优化

1.发酵培养基碳源含量的确定

用单因素实验对碳源山梨醇的三种含量(30、40、50g/L)进行实验，确定合适的碳源含量，分别命名为A1、A2、A3，发酵培养基中其他成分及含量为：磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸铵5g/L、酵母提取物1.2g/L、硫酸镁0.9g/L、硫酸铜0.002g/L，pH8.0(121℃，15min灭菌)。

500mL三口烧瓶培养：将培养好的种子液按接种量4％(v/v)接入装有300mL发酵培养基的500mL三口烧瓶中培养，摇床转速250r/min，温度37℃，培养40h，定时取样，测得山梨醇的质量浓度和在425nm处的菌体吸光度及唾液酸的质量浓度，用便携式pH计实时监测，并用4mol/L的氢氧化钠调节发酵液中的pH，使之保持在7.6～8.0。

放大培养：3.7L发酵罐装液量为2L，接种量4％，发酵温度37℃，搅拌转速250r/min，pH8.0，通气量1(V/V·min)，培养40h。

实验结果如图1-3所示。图1为发酵过程中菌体的吸光度，图2为发酵过程中残山梨醇的质量浓度，图3为发酵过程中唾液酸的质量浓度。从图1-3可以看出，发酵结束时，A2组菌体吸光度最大，残山梨醇的含量约为15g/L，唾液酸的含量最高为1.35g/L，因此选择A2组山梨醇40g/L为发酵培养基碳源含量。

2.发酵培养基无机氮源含量的确定

在上步优化的碳源含量的基础上，对无机氮源硫酸铵的含量(3、4、5g/L)进行单因素实验，确定合适的氮源含量，分别命名为B1、B2、B3，发酵培养基中其他成分及含量为：山梨醇40g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、酵母提取物1.2g/L、硫酸镁0.9g/L、硫酸铜0.002g/L、pH8.0(121℃，15min灭菌)。

实验结果如图4-6所示，图4为发酵过程中菌体的吸光度，图5为发酵过程中硫酸铵的质量浓度，图6为发酵过程中唾液酸的质量浓度。从图4可知，B2组菌体吸光度较大，表明菌体生长较其它两组快，图5中B2组残硫酸铵的含量约为1.3g/L，图6中B2组唾液酸的含量较高，因此选择B2组硫酸铵4g/L为发酵培养基氮源含量。

3.响应面实验确定碳、氮源的最佳含量

将获得的山梨醇和硫酸铵的含量分别为40g/L和4g/L及有机氮源酵母提取物1.2g/L，利用Design-Expert7.0软件对山梨醇40～45g/L、硫酸铵3.8～4.3g/L及有机氮源酵母提取物1～1.5g/L，三因素进行响应面实验，发酵40h后，分别测唾液酸的含量，选择能使唾液酸含量较高的碳、氮源含量作为发酵培养基的碳、氮源，实验设计及结果为下表：

表1Design-Expert软件设计的17组实验及实验结果

实验结果：用Design-Expert7.0软件分析最佳碳氮源为：山梨醇40g/L，硫酸铵3.75g/L，酵母提取物：1.5g/L，用三口烧瓶及发酵罐验证，唾液酸的含量分别为：1.81g/L和2.18g/L。因此，大肠杆菌K235的发酵培养基成分及含量为：固体山梨醇40g/L，硫酸铵3.75g/L，酵母提取物1.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，无水硫酸镁0.9g/L，无水硫酸铜0.002g/L，pH7.6～8.0(121℃灭菌，15min)。

实施例2过氧化氢胁迫对菌体发酵能力的影响

1.过氧化氢的添加时间和添加量对终产物唾液酸产量的影响

进行以下单因素实验分别为，在发酵到5h时，分别添加1、2、4、8mmoL/L的H₂O₂，分别命名为C1、C2、C3、C4；在发酵到10h时，分别添加2、4、8、16mmoL/L的H₂O₂，分别命名为D1、D2、D3、D4；在发酵到15h时，分别添加4、8、16、32mmoL/L的H₂O₂，分别命名为E1、E2、E3、E4。

500mL三口烧瓶培养：将培养好的种子液按接种量4％(v/v)接入装有300mL发酵培养基的500mL三口烧瓶中培养，摇床转速250r/min，温度37℃，pH7.6～8.0，培养40h，发酵结束时测定唾液酸的含量，同时做空白对照。

实验结果如表2所示：

表2发酵结束时唾液酸的含量及菌体干重

实验结果证明，从C1～C4和D1～D4四组中唾液酸含量最高的为C2和D2，菌体干重低于空白样，而唾液酸的含量反而高于空白样；从E1～E4四组中E2组中的唾液酸的含量最高，说明双氧水对菌体生长有一定的影响，进一步验证，在大量氧自由基形成的高氧胁迫下，菌体在适当条件下能够对氧化胁迫做出应激响应，通过自身的抗氧化防御体系降低活性氧的危害，而且能提高代谢产物的产量。

因此，在5、10、15h时，分别选择添加2、4、8mmoL/L的H₂O₂。

2.过氧化氢添加方式对终产物唾液酸产量的影响

进一步从确定最佳H₂O₂的添加量，设计三点同时添加H₂O₂，及第20h添加8mmoL/L和16mmoL/L，分别编号为F1、F2、F3三组进行实验，确定最佳方案。实验结果如表3所示：

表3在不同时间添加H₂O₂的量(mmol/L)及发酵结束时SA含量和菌体干重

由上表可知F2组，发酵结束时唾液酸的含量最高，产量为：3.86g/L，3.7L发酵罐发酵检测结果为4.48g/L，因此选择四点同时添加H₂O₂，即在5h添加2mmol/L H₂O₂；10h添加4mmol/L H₂O₂；15h添加8mmol/L H₂O₂；20h添加8mmol/L H₂O₂。

实施例3转速对菌体发酵能力的影响

发酵过程中设置不同的转速分别为300、400、500、600r/min，分别进行单因素实验。

500mL三口烧瓶培养：将培养好的种子液按接种量4％(v/v)接入装有300mL发酵培养基中，转速250r/min，温度37℃，pH7.6～8.0，培养40h，定时取样，测发酵液中唾液酸的含量和菌体干重，通过分析不同搅拌转速对菌体细胞比生长速率和唾液酸比合成速率的影响，确定最佳分段搅拌的转速及分段搅拌的时间点。

实验结果如图7和图8所示。从图7可知，在恒定的单一转速条件下，菌体的最大干重为7.10g/L和最大比生长速率(μ)0.62^h-1的最大值同时出现在转速为400r/min时，而其相应的最小值6.25g/L和0.41^h-1则同时出现在300r/min，这说明较小的转速不利于菌体的生长，这一方面可能由于低搅拌转速不能达到菌体生长所需的溶氧量，并且在400-600r/min范围内，其相应的最小值6.75g/L和0.50^h-1则同时出现在转速为600r/min，这说明在此范围内，菌体生长能力随着搅拌速率的增加而下降，这一方面可能是高搅拌速率产生的高剪切力抑制了菌体的生长。另一方面，随着搅拌速率的升高，溶氧浓度增大，由此衍生的氧自由基浓度随之升高，对菌体生长的毒害组作用加剧，导致菌体生长随着搅拌速率的增加而下降。

从图8可知，与菌体生长过程相比，唾液酸产量和比合成速率(qp)的最大值2.67g/L和0.061^h-1，出现在700r/min，而其相应的最小值1.92g/L和0.040^h-1则同时出现在转速为300r/min，这说明在300～600r/min范围内，菌体合成终产物唾液酸的能力随着搅拌速率的增加而增加，菌体在较高搅拌速率的环境中合成终产物唾液酸，这一方面可能是由于高搅拌产生的高剪切力加速了荚膜的脱落，促进其更新速度，另一方面，可能是高搅拌衍生的氧自由基，强化了菌体合成荚膜的效率，导致胞内代谢流的迁移，使更多的前体物质向合成唾液酸的方向进行。

如图7和图8所示，在不同搅拌速率下，菌体的最大比生长速率都出现在发酵前期，而产物的最大比合成速率则出现在发酵中期，因此考虑引入分段调控策略，在发酵前期(12h之前)采用低搅拌转速400r/min，保证菌体的最适生长状态。而在发酵中期开始(12h之后)采用高搅拌速率600r/min，保证产物合成速率。用发酵罐验证，唾液酸的产量达到3.22g/L。实施例4发酵条件的优化

对前体物质丙酮酸钠3～5g/L、发酵液pH7.6～8.0、补料量35～45g/L及接种量2％～5％四种因素进行响应面实验，发酵40h后测定发酵液的唾液酸含量，并通过Design-Expert7.0软件分析实验结果。

500mL三口烧瓶培养：将培养好的种子液按接种量4％(v/v)接入装有300mL发酵培养基的500mL三口烧瓶中培养，摇床转速250r/min，温度37℃，培养40h，发酵结束时测定唾液酸的含量，pH7.6～8.0。

Design-Expert软件设计及结果如表4所示。

表4Design-Expert软件设计的29组实验及其结果

通过Design-Expert7.0软件对表4中的实验数据进行多元回归拟合，得到唾液酸含量Y)对编码自变量丙酮酸钠(A)、pH(B)及补料量(C)、接种量(D)的二次回归方程：

Y＝9.54-0.15A-0.23B-0.18C-0.053D-0.49AB-0.42AC-0.44AD-0.43BC-0.44BD-0.09CD-1.18A²-0.92B²-0.67C²-0.89D²

发酵响应面回归模型方差分析如表5所示。

表5大肠杆菌K235发酵响应面回归模型方差分析

注：*表示显著(P＜0.05)；**表示极显著(P＜0.01)

由表5方差分析结果可以看出，本实验选用的二次多项模型极显著(P<0.0001)，方程失拟项不显著(P>0.05)，相关系数R2＝0.9623，表明拟合度良好，可以用此模型表示唾液酸含量与各自变量之间的关系.由F检验得各因子的贡献率依次为：B＞C＞A＞D即pH＞补料量＞丙酮酸＞接种量.根据显著性分析可知，B、AB、AC、AD、BC、BD、A²、B²、C²、D²项达到了极显著的水平，其中AB、AC、AD、BC、BD,即丙酮酸和pH、丙酮酸和补料量、丙酮酸和接种量、pH和补料量、pH和补料量之间存在交互作用，具体见图9。

应用响应面法对回归模型进行分析，确定菌体发酵的最优化条件为：丙酮酸钠为4.09g/L，pH为7.78，补料量为39.32g/L，接种量为3.38％。在最优条件下对响应面法优化的结果用摇瓶进行验证，3平行实验的唾液酸含量的平均值为9.54g/L，接近且略低于Design-Expert7.0软件得到的预测值9.57g/L，由此证明该响应面实验参数准确，实验模式合理。

进而，用发酵罐进行验证，聚唾液酸的产量为12.96g/L，唾液酸的回收率为80.97％，三次重复实验的唾液酸含量的平均值为12.37g/L，发酵液经分离纯化后唾液酸的含量达到10.01g/L，纯度约为94.80％，高效液相色谱检测结果如图10所示。

将纯化得到的粉末经红外光谱鉴定，确定含有唾液酸的特征基团，实验结果与文献报道一致(图11)。

Claims

1.一种发酵生产唾液酸的方法，其特征在于，步骤如下：

1)发酵液的制备：将种子液和丙酮酸钠加入到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，发酵过程中补加过氧化氢溶液和流加液，并不断搅拌，发酵结束后获得发酵液；所用发酵的原始菌株为大肠杆菌K235，发酵条件为：丙酮酸钠的添加量为4.09g/L，pH为7.78，流加液的补料量为39.32g/L，接种量为3.38％；所述补加过氧化氢溶液是在发酵5、10、15、20h时按0.4015、0.8025、1.605、1.605mL/L发酵培养基的添加量补加；所述流加液的补加时间为发酵后8h，所述流加液含有307.17g/L山梨醇，30.65g/L硫酸铵，pH7.6-8.0；

3)聚唾液酸的酸解：利用盐酸酸解步骤2)所得精制聚唾液酸，再向水解溶液中加入冰乙酸结晶，再用冰乙酸洗涤结晶后，真空干燥获得唾液酸。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述种子液，制备方法是从大肠杆菌K235甘油菌中，取100μL接种到5mL种子培养基中，37℃，恒温培养12h，按2％的接种量将培养好的菌液再接种到含100mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，250r/min摇床培养12h，按2％的接种量再次接到100mL种子培养基中培养8～10h，培养结束后获得发酵种子液；

所述种子培养基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，pH 7.2-7.4；

所述流加液含有307.17g/L山梨醇，30.65g/L硫酸铵，pH7.6-8.0。

3.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述发酵，发酵温度为37℃，发酵时间40h，pH7.78，通气量1V/V·min；所述搅拌，在发酵12h前，搅拌速度为400r/min，发酵12h后，搅拌速度为600r/min。

4.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇浓度为75％，添加量为3倍体积上清液，第二次沉淀乙醇溶液浓度为95％，添加量为3倍体积滤液；所述离心，离心发酵液转速为8000r/min，离心时间10min，离心乙醇沉淀液转速为10000r/min，离心时间10min。

5.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述酸解是85℃下，用0.1M盐酸酸解2％的聚唾液酸溶液，酸解时间2h。

6.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述冰乙酸结晶，冰乙酸添加量为5倍体积的唾液酸单体溶液，结晶温度为4℃，结晶时间3d。

7.权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤为：

3)将步骤2)所得精制聚唾液酸配制成2％的溶液，用0.1mol/L盐酸，85℃下酸解2h，得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍体积的冰乙酸，4℃下静置，结晶3d，再将晶浆抽滤除去冰乙酸，得到唾液酸晶体，再用5倍质量的冰乙酸洗涤晶体，最后将晶体在50℃下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。