CN103710402A - 一种促进微藻油脂积累的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进微藻油脂积累的培养基，在微藻的培养基中添加丁基羟基茴香醚，丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为60nM-60μM。所述丁基羟基茴香醚先溶解到二甲基亚砜中制成储液，再加入到微藻的培养基中。本发明的培养基适用于大规模发酵培养，对微藻生长无不利影响而油脂积累的效果明显。

Description

一种促进微藻油脂积累的培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说就是一种促进微藻油脂积累的培养基。

背景技术

DHA即二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid,DHA）是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15%以上的速度增长。

截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。

而利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。

隐甲藻是一种原始的真核单细胞微藻，营异养生活，在甲藻门中处于较低等的地位。隐甲藻的细胞周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累DHA的主要阶段。目前工程培养隐甲藻细胞过程中，油脂产量较低，限制了该藻资源开发。怎样在不影响细胞自身生长速率的前提下，在单位产量内获得更多的油脂是开发隐甲藻生物资源的工作重点内容之一。如已有专利通过控制钠离子和钾离子水平在低氯培养基中生长海洋微生物增加高度不饱和的脂肪酸产量。目前，在不影响隐甲藻自身生长的前提下，在培养基中添加各类刺激隐甲藻油脂积累的物质是改善发酵培养的重要方向。

丁基羟基茴香醚（BHA）是一种很好的抗氧剂，作为食品抗氧剂，能阻碍油脂食品的氧化作用，延缓食品开始败坏的时间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种提高微藻油脂产量的促进油脂积累的培养基。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种促进微藻油脂积累的培养基，在微藻的培养基中添加丁基羟基茴香醚，丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为60nM-60μM。

所述丁基羟基茴香醚先溶解到二甲基亚砜中制成储液，再加入到微藻的培养基中。

所述丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为30nM-4μM。

所述微藻是隐甲藻属。

所述微藻是寇氏隐甲藻菌种。

所述丁基羟基茴香醚溶解到二甲基亚砜中制成的储液，每升储液中丁基羟基茴香醚为大于100nM。

所述培养基的组成为：葡萄糖1-60g/L,酵母浸粉0.1-20g/L,海盐5-60g/L，丁基羟基茴香醚60nM-60μM，二甲基亚砜的体积份数0.001%-10%。

所述培养基的组成为：葡萄糖9g/L,酵母浸粉2g/L,海盐25g/L，丁基羟基茴香醚60μM，二甲基亚砜的体积份数0.4%。

本发明的有益效果是：可有效提高微藻细胞油脂积累量，使细胞干重增加，能在提高生产效率的同时增加油脂产量。

附图说明

图1为添加BHA前40X寇氏隐甲藻显微图片。

图2为添加BHA后40X寇氏隐甲藻显微图片。

图3为添加不同浓度的BHA后寇氏隐甲藻生长曲线。

图4为添加不同浓度BHA培养后，使用油脂抽提的方法测定的寇氏隐甲藻油脂含量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的促进微藻油脂积累的培养基，在微藻的培养基中添加丁基羟基茴香醚，丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为60nM-60μM。

所述丁基羟基茴香醚先溶解到二甲基亚砜中制成储液，再加入到微藻的培养基中。

所述丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为30nM-4μM。

所述微藻是隐甲藻属。

所述微藻是寇氏隐甲藻菌种。

所述丁基羟基茴香醚溶解到二甲基亚砜中制成的储液，每升储液中丁基羟基茴香醚为大于100nM。

所述培养基的组成为：葡萄糖1-60g/L,酵母浸粉0.1-20g/L,海盐5-60g/L，丁基羟基茴香醚60nM-60μM，二甲基亚砜的体积份数0.001%-10%。

优选，所述培养基的组成为：葡萄糖9g/L,酵母浸粉2g/L,海盐25g/L，丁基羟基茴香醚60μM，二甲基亚砜的体积份数0.4%。

实施例1

将0.054克丁基羟基茴香醚（BHA）加入30mL二甲基亚砜充分溶解，经过过滤除菌，配成10mM的储液，即得到油脂积累促进剂。按照报导的培养基方案（葡萄糖9g/L,酵母浸粉2g/L,海盐25g/L）配制基础培养液，加入油脂积累促进剂，得到不同浓度的促进微藻油脂积累的培养基。分别接种处于旺盛对数生长期的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)株系（藻株来自美国菌种保藏中心ATCC30772）。将上述藻株分别接种后摇匀，每株均分数瓶，进行摇瓶实验。在250mL摇瓶中装入100mL培养基，每株准备相同数量的培养基，按0.4%（V/V）加入相同体积但浓度不同的促进剂，形成不同浓度梯度，设计只加相同体积的溶剂以及不做任何处理的菌株作为对照试验，每个处理3个重复。然后利用天津市欧诺仪器仪表有限公司HNY-202B摇床进行单因子实验，培养温度为25℃，随机排放各瓶在摇床内的位置，减少处理误差。培养期间每12h取样，用酶标仪测量藻液在490nm下的吸光度，表征细胞生长情况。每个处理有2个以上重复，以平均值±SD表示。并在末期镜检观察细胞大小有无明显变化。

在细胞生长到72h时，收集一定量细胞，根据文献叙述的尼罗红染色方法改进后进行尼罗红染色，利用荧光分光光度计进行荧光信号检测；同时取适量细胞进行镜检，观察细胞大小和状态变化；另取少量细胞进行干重测量。在实验过程中，不同浓度的油脂积累促进剂对不同株系的作用存在一定差异，但在一定浓度下都明显促进细胞油脂积累，而对细胞大小没有产生明显影响。根据均匀实验的结果，选择出对藻株积累都有明显作用的BHA用量，其中BHA的浓度范围为40μM,30μM,4μM,400nM,40nM，其最适浓度为30nM-4μM。

最后通过论证，添加的油脂积累促进剂是否经过灭菌处理，对增加油脂积累的效果没有差异，且具有广谱性。与空白对照组相比，添加不同浓度促进剂的细胞生长速率没有明显变化，细胞大小均匀，也没有发生破裂，聚团等，生长状态正常（图1-3），但油脂量与空白对照组相比有大幅度提高，一般比没有使用油脂积累促进剂的对照提高10%-25%，促油脂积累效果明显（表1）。

表1添加不同浓度BHA后，使用尼龙红染色的方法测定的寇氏隐甲藻油脂的提高

实施例2

对寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)藻株ATCC30772进行扩大培养实验，将处于旺盛对数生长期的ATCC30772藻株接种7.5升发酵罐进行扩大培养，开展油脂积累促进剂对细胞生长和油脂积累的放大论证检验。验证利用New Brunswick的BIOFLO&CELLIGEN310发酵罐进行补料发酵试验验证，通气量、搅拌速度、和溶氧级联，使溶氧维持在30%，培养温度为25℃。

经过对比分析，细胞生长促进剂不仅可以提高藻株细胞的油脂积累量，而且不会对藻株细胞生长产生影响。其中各个浓度梯度的促进剂对油脂积累增加效果分别比对照组高5%-15%（图4）。每次细胞培养周期不会延长，细胞生长不受影响，在相同的培养时间内可以获得更多的油脂积累量。

本发明可以采用将丁基羟基茴香醚（BHA）溶解到二甲基亚砜中制成储液，其中每升溶液中丁基羟基茴香醚为大于100nM。制备所得储液经过滤除菌置于-20℃保存。

使用时，将上述所得促进剂加入到隐甲藻细胞的异养培养基中使用。使用范围为丁基羟基茴香醚（BHA）在培养基中的添加浓度为60nM-60μM。

本发明的培养基有明显的促进藻油的积累的作用，并且对细胞大小以及生长没有产生明显影响；其溶剂二甲基亚砜的单独使用还会促进细胞的生长，使细胞干重增加，二者联合使用可以更大程度的增加油脂产量。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (8)

1.一种促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，在微藻的培养基中添加丁基羟基茴香醚，丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为60nM-60μM。

2.根据权利要求1所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述丁基羟基茴香醚先溶解到二甲基亚砜中制成储液，再加入到微藻的培养基中。

3.根据权利要求1或2所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述丁基羟基茴香醚在培养基中浓度为30nM-4μM。

4.根据权利要求1或2所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述微藻是隐甲藻属。

5.根据权利要求4所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述微藻是寇氏隐甲藻菌种。

6.根据权利要求2所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述丁基羟基茴香醚溶解到二甲基亚砜中制成的储液，每升储液中丁基羟基茴香醚为大于100nM。

7.根据权利要求2所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述培养基的组成为：葡萄糖1-60g/L,酵母浸粉0.1-20g/L,海盐5-60g/L，丁基羟基茴香醚60nM-60μM，二甲基亚砜的体积份数0.001%-10%。

8.根据权利要求7所述的促进微藻油脂积累的培养基，其特征在于，所述培养基的组成为：葡萄糖9g/L,酵母浸粉2g/L,海盐25g/L，丁基羟基茴香醚60μM，二甲基亚砜的体积份数0.4%。

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