CN114774484A - 提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法和微生物油脂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法和微生物油脂的制备方法。提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法包括：将产油微生物接入添加有调控因子的培养基中进行培养；所述调控因子含有主调控剂，所述主调控剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。微生物油脂的制备方法包括：将产油微生物采用上述的方法进行培养得到培养液，将所述培养液进行破壁、提取。本发明提供的方法能够有效提高微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量，简单高效且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地，涉及一种提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法和微生物油脂的制备方法。
背景技术
日常生活中食用油脂的来源主要包括植物种子、动物脂肪以及微生物油脂。微生物油脂是真菌等微生物在生长过程中积累在细胞内的油脂，其主要成分与动植物油脂的不同在于，大多数微生物油脂含有长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。这些多不饱和脂肪酸不仅在维持正常生理代谢上发挥重要的作用，而且具有极其重要的生物医学功能，已成为医药和营养学研究的热点。DHA/EPA的主要医学保健功能有：调节细胞膜的结构、功能和流动性；对脂质代谢，神经和突触的生长发育、分化，炎症反应和氧化反应起调节作用；作为合成炎症因子的前体，对炎症反应起抑制作用；对心血管疾病、自身免疫性疾病和炎症、糖尿病、癌症和精神方面的疾病都有治疗作用。这一类微生物油脂产品已被广泛应用于成人和婴幼儿的营养添加剂。
发酵法是获得微生物油脂，特别是含多不饱和脂肪酸的微生物油脂的成熟工业方法。发酵法利用水相培养基使产油微生物菌株增殖得到有利用价值的生物量后，通过破坏微生物细胞壁使油脂游离，然后分离得到微生物油脂。但是，现有的产油微生物菌株发酵生产含多不饱和脂肪酸的油脂时，仍存在油脂中多不饱和脂肪酸的含量低、生产成本较高等缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量低、生产成本较高的问题，提供一种提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法和微生物油脂的制备方法，该方法能够有效提高微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量，简单高效且成本低。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种提高产油微生物的DHA产量的方法，该方法包括：将产油微生物接入添加有调控因子的培养基中进行培养；所述调控因子含有主调控剂，所述主调控剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
优选地，所述对羟基苯甲酸酯选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丙酯和对羟基苯甲酸异丙酯中的至少一种。
优选地，所述主调控剂为丁基羟基茴香醚和/或二丁基羟基甲苯。
优选地，所述调控因子还含有辅助调控剂，所述辅助调控剂为磷酸和/或柠檬酸。
优选地，所述培养基中调控因子的含量为0.1-0.5g/L。
优选地，所述调控因子含有丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸，所述丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸的重量比为1-4：1-4：1。
优选地，所述培养的过程包括：将所述产油微生物接种至第一培养基中进行种子培养后得到种子液，将所述种子液以体积比0.5-10％接种至第二培养基中进行发酵培养，其中，所述调控因子添加在第一培养基中和/或第二培养基中。
优选地，所述第一培养基含有：40-80g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、25-45g/LNa2SO4、2-6g/L MgSO4、0.5-2g/L KCl、2-8g/L(NH4)2SO4、15-25g/L谷氨酸钠和2-8g/L酵母粉；
所述第二培养基含有：60-100g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、4-12g/L Na2SO4、2-6g/LMgSO4、0.1-1g/L KCl、1-5g/L(NH4)2SO4、4-10g/L NaCl、0.01-0.2g/L CaCl2、15-25g/L谷氨酸钠、1-5g/L酵母粉和0.5-2.5g/L玉米浆干粉。
优选地，所述种子培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-30℃，时间为20-24h；
所述发酵培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为350-550rpm，温度为25-30℃，通气量为3-5vvm。
优选地，所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和微藻中的至少一种，更优选为裂殖壶菌。
本发明第二方面提供一种微生物油脂的制备方法，该制备方法包括：将产油微生物采用前述技术方案提供的方法进行培养得到培养液，将所述培养液进行破壁、提取。
优选地，所述破壁采用破壁酶酶解的方式，所述破壁酶选自纤维素酶和/或蛋白酶。
更优选地，相对于1L的所述培养液，所述破壁酶的用量为2-4g。
进一步优选地，所述提取溶剂为正己烷和/或乙醇。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的技术方案通过在产油微生物的发酵培养基中外源添加一定比例的调控因子，以提高微生物细胞内NADPH的含量，从而增强细胞的脂质生物合成过程，不仅有效提高产油微生物发酵的生物量和油脂的含量，而且有效提高油脂中多不饱和脂肪酸的含量；尤其在采用丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯作为主调控剂、柠檬酸作为辅助调节剂，应用于裂殖壶菌发酵过程时，能够实现在明显提高油脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量的同时，进一步提高油脂中二十碳五烯酸(EPA)的含量，EPA和DHA的生产效率高，且该方法操作简单，生产成本低，具有显著的开发价值。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法，该方法包括：将产油微生物接入添加有调控因子的培养基中进行培养；所述调控因子含有主调控剂，所述主调控剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
本发明的发明人在研究过程中发现，将产油微生物接入添加有调控因子的培养基中进行培养，能够提高微生物细胞内NADPH的含量，从而增强细胞的脂质生物合成过程，不仅有效提高产油微生物发酵的生物量和油脂的含量，而且有效提高油脂中多不饱和脂肪酸的含量。
根据本发明，所述对羟基苯甲酸酯可以是对羟基苯甲酸与任意一种有机醇形成的酯类物质。为了能够进一步提高产油微生物形成的油脂中多不饱和脂肪酸的含量，优选地，所述对羟基苯甲酸酯选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丙酯和对羟基苯甲酸异丙酯中的至少一种。
根据本发明，优选地，所述主调控剂为丁基羟基茴香醚和/或二丁基羟基甲苯，进一步优选为丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，应用于裂殖壶菌发酵时，不仅能够有效提高产油微生物合成的油脂中DHA的含量，还能够提高油脂中EPA的含量。
根据本发明，优选地，所述调控因子还含有辅助调控剂，所述辅助调控剂为磷酸和/或柠檬酸。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，使得产油微生物的生长过程中，能够利用辅助调控剂进一步增强主调控剂促进细胞脂质生物合成的调控效果。进一步优选地，所述辅助调控剂为柠檬酸。
本发明中，柠檬酸、磷酸分别以固体粉末的形式添加至所述培养基中。
根据本发明，所述调控因子中含有主调控剂和辅助调控剂时，主调控剂与辅助调控剂的重量比可以是任意的比例，优选为1-10：1。
作为本发明中一种优选的实施方式，所述调控因子含有丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，应用于裂殖壶菌发酵时，不仅能够提高产油微生物的生物量和油脂含量，而且油脂中DHA和EPA的含量均显著提高。
根据本发明，所述培养基中调控因子的含量没有特别的限制，只要能够发挥调控作用，增强产油微生物在生长过程中的脂质合成即可。为了能够进一步提高产油微生物培养后的生物量和油脂含量，优选地，所述培养基中调控因子的含量为0.1-0.5g/L。所述培养基调控因子的含量具体可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。进一步优选地，所述培养基中调控因子的含量为0.2-0.3g/L。
根据本发明，所述调控因子含有丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸时，所述丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸的重量比为1-4：1-4：1。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，主调控剂能够更好地发挥促进微生物脂质合成的作用。
根据本发明，所述产油微生物可以选用任意一种能够经培养合成含有多不饱和脂肪酸的油脂的微生物。优选地，所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和微藻中的至少一种，更优选为裂殖壶菌。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，调控因子能够对裂殖壶菌的生长和脂质合成形成更优的增强作用。
本发明对产油微生物培养的方法没有特别的限制，只要通过该培养的方法可以使所述产油微生物大量增殖即可。优选情况下，所述培养的过程包括：将所述产油微生物接种至第一培养基中进行种子培养后得到种子液，将所述种子液以体积比0.5-10％接种至第二培养基中进行发酵培养，其中，所述调控因子添加在第一培养基中和/或第二培养基中。
根据本发明，调控因子可以添加在第一培养基中，也可以添加在第二培养基中，或者第一培养基和第二培养基中均添加。优选为在第二培养基(即发酵培养基中)添加调控因子，发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提升调控因子促进油脂中多不饱和脂肪酸(DHA和EPA)合成的效果。
根据本发明，产油微生物接种至第一培养基前，需要进行活化处理，具体地，活化处理可以是将产油微生物菌种接种至第一培养基中进行活化培养后得到活化培养液。
根据本发明，优选情况下，活化培养和培养培养时，第一培养基中产油微生物的接种量为0.5-10体积％；若以甘油管保藏的微生物菌种进行接种，则每个甘油管内的菌种接种至100mL的第一培养基中。活化培养和培养培养所采用的温度、pH、转速、时间等参数，可以是本领域内的常规设置。优选地，活化培养和培养培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-30℃，时间为20-24h。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于促进产油微生物的生长，提高发酵的生物量。
根据本发明，所述第一培养基含有碳源、氮源、无机盐离子和微量元素，碳源、氮源、无机盐离子和微量元素可以是相应的物质种类中任意一种用于微生物发酵的物质；示例性地，碳源可以为葡萄糖，氮源可以为酵母提取物和/或玉米浆干粉，无机盐离子可以为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和磷酸盐中的任意一种或多种，微量元素可以为Mn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。为了能够进一步提高产油微生物生产的油脂中多不饱和脂肪酸的含量，优选地，所述第一培养基含有葡萄糖、KH2PO4、Na2SO4、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、谷氨酸钠和酵母粉，进一步优选地，所述第一培养基含有：40-80g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、25-45g/L Na2SO4、2-6g/L MgSO4、0.5-2g/LKCl、2-8g/L(NH4)2SO4、15-25g/L谷氨酸钠和2-8g/L酵母粉。
根据本发明，所述第而培养基含有碳源、氮源、无机盐离子和微量元素，碳源、氮源、无机盐离子和微量元素可以是相应的物质种类中任意一种用于微生物发酵的物质；示例性地，碳源可以为葡萄糖，氮源可以为酵母提取物和/或玉米浆干粉，无机盐离子可以为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和磷酸盐中的任意一种或多种，微量元素可以为Mn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。为了能够进一步提高产油微生物生产的油脂中多不饱和脂肪酸的含量，优选地，所述第二培养基含有葡萄糖、KH2PO4、Na2SO4、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、NaCl、CaCl2、谷氨酸钠、酵母粉和玉米浆干粉。进一步优选地，所述第二培养基含有：60-100g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、4-12g/LNa2SO4、2-6g/L MgSO4、0.1-1g/L KCl、1-5g/L(NH4)2SO4、4-10g/L NaCl、0.01-0.2g/L CaCl2、15-25g/L谷氨酸钠、1-5g/L酵母粉和0.5-2.5g/L玉米浆干粉。
根据本发明，发酵培养所采用的接种量、温度、pH、转速、时间等参数，可以是本领域内的常规设置。优选地，发酵培养的条件包括：接种量为0.5-10体积％，通气量大于1vvm，搅拌速度大于300rpm，培养温度为25-35℃。进一步优选地，发酵培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为350-550rpm，温度为25-30℃，通气量为3-5vvm。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于促进产油微生物的生长，提高发酵的生物量。
根据本发明，发酵培养可以采用摇瓶进行，也可以采用发酵罐进行，优选为采用体积不小于5L的发酵罐进行。进一步地，为了提高发酵罐的发酵效果，采用发酵罐进行发酵培养时进行碳源流加，以更好地提升微生物的生物量和油脂产量。优选地，发酵培养过程中，发酵罐的溶氧量维持在0％-50％，pH值维持在6.5左右，不断流加浓度为500g/L以上的碳源溶液(例如葡萄糖溶液)，在发酵完成前，停止流加，继续培养至碳源消耗完全，发酵周期大于120h。
基于上述提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法，本发明第二方面提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将产油微生物采用上述技术方案提供的方法进行培养得到培养液，将所述培养液进行破壁、提取。
根据本发明，产油微生物的细胞破壁可以采用本领域常规的方式，优选地，采用破壁酶酶解方法进行所述破壁，以能够提高破壁效率，减小对微生物细胞中代谢产物的破坏。
根据本发明，优选地，所述破壁酶选自纤维素酶和/或蛋白酶。进一步优选地，相对于1L的所述培养液，所述破壁酶的用量为2-4g，具体可以为2g/L、3g/L、4g/L，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。
根据本发明，优选地，所述破壁的条件包括：pH为10-12，具体可以为10、11、12，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；转速为150-200rpm，具体可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；温度为25-30℃，具体可以为25℃、30℃、35℃，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；时间为3-6h，具体可以为3h、4h、5h、6h，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。
根据本发明，为了提高对微生物油脂的提取效率，优选地，所述提取溶剂为正己烷和/或乙醇，优选为正己烷，以实现高效提取培养液的菌体中的油脂。
根据本发明一种特别优选的实施方式，提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：
(1)将裂殖壶菌的菌种以接种量为0.5-10体积％接种至第一培养基中，在初始pH为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-30℃的条件下进行活化培养20-24h后得到活化培养液；
(2)将步骤(1)得到的活化培养液以接种量为0.5-10体积％接种至第一培养基中，在初始pH为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-30℃的条件下进行种子培养20-24h后得到种子培养液；
(3)将步骤(2)得到的种子培养液以接种量为0.5-10体积％接种至装有添加调控因子的第二培养基的发酵罐中，在初始pH为5.5-7，转速为350-550rpm，温度为25-30℃，通气量为3-5vvm的条件下进行发酵培养，发酵罐溶氧量维持在0％-50％，pH值维持在6.5左右，不断流加浓度为500g/L以上的葡萄糖溶液，在发酵完成前，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期大于120h，得到发酵培养液；
(4)将破壁酶以2-4g/L的添加量加入步骤(3)得到的发酵培养液中，在pH为10-12、转速为150-200rpm、温度为25-30℃的条件下酶解3-6h得到破壁液，将破壁液与正己烷混合提取得到水相、正己烷相和固形物，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂；
其中，调控因子为丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸，丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸的重量比为1-4：1-4：1，第二培养基中调控因子的添加量为0.2-0.3g/L；
所述第一培养基含有：40-80g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、25-45g/L Na2SO4、2-6g/LMgSO4、0.5-2g/L KCl、2-8g/L(NH4)2SO4、15-25g/L谷氨酸钠和2-8g/L酵母粉；所述第二培养基含有：60-100g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、4-12g/L Na2SO4、2-6g/L MgSO4、0.1-1g/L KCl、1-5g/L(NH4)2SO4、4-10g/L NaCl、0.01-0.2g/L CaCl2、15-25g/L谷氨酸钠、1-5g/L酵母粉和0.5-2.5g/L玉米浆干粉。
上述优选实施例提供的方法制备得到的微生物油脂中，DHA和EPA的含量明显提高。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中，裂殖壶菌为Schizochytrium sp.HX-308，由本实验室自主从沿海区域分离筛选获得，现保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC M 209059，已在公开号为CN106947706A的专利申请中记载。
丁基羟基茴香醚(CAS号为25013-16-5)、二丁基羟基甲苯(CAS号为128-37-0)、特丁基对苯二酚(CAS号为1948-33-0)、对羟基苯甲酸甲酯(CAS号为99-76-3)、对羟基苯甲酸乙酯(CAS号为120-47-8)、柠檬酸(CAS号为5949-29-1)、磷酸(CAS号为7664-38-2)均购于上海阿拉丁试剂公司；其他原料和试剂均为常规的市售品。
生物量的测量方法为：取5mL的发酵培养液于已称重的离心管中，离心去上清后，于烘箱干燥至恒重，进行称重计算。
微生物油脂中的DHA和EPA含量的测试方法为：
取0.5g微生物油脂，用正己烷定容至10mL；然后移取1mL至容器中，加入3mL0.5mol/L的KOH-甲醇溶液，于65℃水浴15-20min，冷却；再加入2mL BF3-乙醚-甲醇溶液(BF3-乙醚:甲醇＝3:7，v/v)，水浴65℃5-10min，冷却；再加饱和NaCl溶液、正己烷各2mL，振荡后静置、分层，取上层至另一个容器中，取1mL正己烷相上气相进行脂肪酸分析。
气相分析条件：色谱柱：DB-23(60m*0.25mm*0.25μm)；检测器：FID；载气：氮气；分流比：30/1；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；进样量：1μL；升温程序：初始柱温为100℃，先以25℃/min的速度升至196℃，再以2℃/min的速度升至220℃，保持12min；柱流速：3.0mL/min；尾吹流速：30mL/min；氢气流速：40mL/min；空气流速：400mL/min。
气相色谱仪购于日本岛津，仪器型号为QP2010 SE。
实施例1
(1)第一培养基的配方为：葡萄糖60g/L、KH2PO4 3g/L、Na2SO4 35g/L、MgSO4 4g/L、KCl 1g/L、(NH4)2SO4 5g/L、谷氨酸钠20g/L、酵母粉4g/L，121℃高温灭菌20min后备用；第二培养基的配方为：葡萄糖80g/L、KH2PO4 3g/L、Na2SO4 8g/L、MgSO4 4g/L、KCl 0.3g/L、(NH4)2SO4 3g/L、NaCl 6.6g/L、CaCl2 0.06g/L、谷氨酸钠20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆干粉1.5g/L，然后添加调控因子(添加量为0.25g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比为2:2:1组成)，121℃高温灭菌20min后备用；
(2)将裂殖壶菌的菌种以接种量为1体积％接种至第一培养基中，在初始pH为6.5，转速为170rpm、温度为28℃的条件下进行活化培养24h后得到活化培养液；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液以接种量为2体积％接种至第一培养基中，在初始pH为6.5，转速为170rpm、温度为28℃的条件下进行种子培养24h后得到种子培养液；
(4)步骤(3)得到的种子培养液以接种量为5体积％接种至装有第二培养基的发酵罐(不小于5L)中，在初始pH为6.5，转速为450rpm，温度为28℃，通气量为4vvm的条件下进行发酵培养，发酵罐溶氧量维持在5％以下，pH值维持在6.5左右，不断流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液，在发酵完成前，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期为168h，得到发酵培养液；
(5)将破壁酶以3g/L的添加量加入步骤(4)得到的发酵培养液中，在pH为11、转速为180rpm、温度为30℃的条件下酶解4h得到破壁液，将破壁液与正己烷以体积比1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例2
(1)第一培养基的配方为：葡萄糖40g/L、KH2PO4 1g/L、Na2SO4 45g/L、MgSO4 2g/L、KCl 2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、谷氨酸钠15g/L、酵母粉2g/L，121℃高温灭菌20min后备用；第二培养基的配方为：葡萄糖60g/L、KH2PO4 1g/L、Na2SO4 4g/L、MgSO4 6g/L、KCl 1g/L、(NH4)2SO45g/L、NaCl 4g/L、CaCl2 0.01g/L、谷氨酸钠15g/L、酵母膏5g/L、玉米浆干粉0.5g/L，然后添加调控因子(添加量为0.21g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比为1:1:1组成)，121℃高温灭菌20min后备用；
(2)将裂殖壶菌的菌种以接种量为1体积％接种至第一培养基中，在初始pH为5.5、转速为200rpm、温度为25℃的条件下进行活化培养24h后得到活化培养液；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液以接种量为2体积％接种至第一培养基中，在初始pH为5.5、转速为200rpm、温度为25℃的条件下进行种子培养24h后得到种子培养液；
(4)步骤(3)得到的种子培养液以接种量为5体积％接种至装有第二培养基的发酵罐(不小于5L)中，在初始pH为5.5，转速为550rpm，温度为25℃，通气量为3vvm的条件下进行发酵培养，发酵罐溶氧量维持在5％以下，pH值维持在6.5左右，不断流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液，在发酵完成前，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期为168h，得到发酵培养液；
(5)将破壁酶以2g/L的添加量加入步骤(4)得到的发酵培养液中，在pH为10、转速为150rpm、温度为25℃的条件下酶解6h得到破壁液，将破壁液与正己烷以体积比1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例3
(1)第一培养基的配方为：葡萄糖80g/L、KH2PO4 5g/L、Na2SO4 25g/L、MgSO4 6g/L、KCl 0.5g/L、(NH4)2SO4 8g/L、谷氨酸钠25g/L、酵母粉8g/L，121℃高温灭菌20min后备用；第二培养基的配方为：葡萄糖100g/L、KH2PO4 5g/L、Na2SO4 12g/L、MgSO4 2g/L、KCl 0.1g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 10g/L、CaCl2 2g/L、谷氨酸钠25g/L、酵母膏1g/L、玉米浆干粉2.5g/L，然后添加调控因子(添加量为0.27g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比为4:4:1组成)，121℃高温灭菌20min后备用；
(2)将裂殖壶菌的菌种以接种量为1体积％接种至第一培养基中，在初始pH为7、转速为150rpm、温度为30℃的条件下进行活化培养24h后得到活化培养液；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液以接种量为2体积％接种至第一培养基中，在初始pH为7、转速为150rpm、温度为30℃的条件下进行种子培养24h后得到种子培养液；
(4)步骤(3)得到的种子培养液以接种量为5体积％接种至装有第二培养基的发酵罐(不小于5L)中，在初始pH为7，转速为350rpm，温度为30℃，通气量为5vvm的条件下进行发酵培养，发酵罐溶氧量维持在8％以下，pH值维持在7左右，不断流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液，在发酵完成前，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期为168h，得到发酵培养液；
(5)将破壁酶以4g/L的添加量加入步骤(4)得到的发酵培养液中，在pH为12、转速为160rpm、温度为30℃的条件下酶解6h得到破壁液，将破壁液与正己烷以体积比1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例4
按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.2g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯以重量比为1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例5
按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.2g/L，调控因子为丁基羟基茴香醚。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例6
按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.2g/L，调控因子为二丁基羟基甲苯。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例7
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中添加的调控因子替换为由特丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚和柠檬酸以重量比1:1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例8
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中添加的调控因子替换为由对羟基苯甲酸甲酯、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比1:1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例9
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中添加的调控因子替换为由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和磷酸以重量比1：1：1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例10
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中添加的调控因子替换为由特丁基对苯二酚、对羟基苯甲酸乙酯和柠檬酸以重量比1:1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例11
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.26g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比6:6:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例12
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.12g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比1:1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
实施例13
按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，将第二培养基中调控因子的添加量替换为0.48g/L，调控因子由丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸以重量比1:1:1组成。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
对比例1
按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤(1)中，第二培养基中不添加调控因子。
对步骤(4)得到的发酵培养液进行生物量测定，步骤(5)得到的微生物油脂进行油脂含量计算，并测定微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表1。
通过表1的结果可以看出，实施例采用本发明提供的方法进行裂殖壶菌发酵，不仅生物量和油脂含量有明显的提高，油脂中DHA和EPA的含量相比于对比例也得到了显著的提高，说明发酵培养基中调控因子的添加，能够提高微生物细胞内NADPH的含量，从而增强细胞的脂质生物合成过程，不仅有效提高产油微生物发酵的生物量和油脂的含量，而且有效提高油脂中多不饱和脂肪酸的含量。
表1
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高油脂中多不饱和脂肪酸含量的方法，其特征在于，该方法包括：将产油微生物接入添加有调控因子的培养基中进行培养；
所述调控因子含有主调控剂，所述主调控剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对羟基苯甲酸酯选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丙酯和对羟基苯甲酸异丙酯中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述主调控剂为丁基羟基茴香醚和/或二丁基羟基甲苯。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述调控因子还含有辅助调控剂，所述辅助调控剂为磷酸和/或柠檬酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基中调控因子的含量为0.1-0.5g/L；
所述调控因子含有丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸，所述丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和柠檬酸的重量比为1-4：1-4：1。
6.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述培养的过程包括：将所述产油微生物接种至第一培养基中进行种子培养后得到种子液，将所述种子液以0.5-10体积％的接种量接种至第二培养基中进行发酵培养，其中，所述调控因子添加在第一培养基中和/或第二培养基中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一培养基含有：40-80g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、25-45g/L Na2SO4、2-6g/L MgSO4、0.5-2g/L KCl、2-8g/L(NH4)2SO4、15-25g/L谷氨酸钠和2-8g/L酵母粉；
所述第二培养基含有：60-100g/L葡萄糖、1-5g/L KH2PO4、4-12g/L Na2SO4、2-6g/LMgSO4、0.1-1g/L KCl、1-5g/L(NH4)2SO4、4-10g/L NaCl、0.01-0.2g/L CaCl2、15-25g/L谷氨酸钠、1-5g/L酵母粉和0.5-2.5g/L玉米浆干粉；
所述种子培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-30℃，时间为20-24h；
所述发酵培养的条件包括：初始pH为5.5-7，转速为350-550rpm，温度为25-30℃，通气量为3-5vvm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和微藻中的至少一种。
9.一种微生物油脂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将产油微生物采用权利要求1至8中任意一项所述的方法进行培养得到培养液，将所述培养液进行破壁、提取。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述破壁采用破壁酶酶解的方式，所述破壁酶选自纤维素酶和/或蛋白酶；
相对于1L的所述培养液，所述破壁酶的用量为2-4g；
所述提取溶剂为正己烷和/或乙醇。
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