CN116622514B - 提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用 - Google Patents

提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用。该调控方法包括：将所述产油微生物进行发酵培养，在所述发酵培养的过程中添加调节剂，其中，所述调节剂选自替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍和乙莫克舍钠盐中的至少一种。本发明还提供微生物菌粉的制备方法以及微生物油脂的制备方法。本发明提供的调控方法能够促进微生物生长过程中甘油三酯的重排，提高油脂产量和油脂中多不饱和脂肪酸的含量。

Description

提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的 调控方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地，涉及一种提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用。
背景技术
Omega-3长链多不饱和脂肪酸，例如，二十二碳六烯酸（简称DHA）、二十碳四烯酸（简称ARA），广泛应用于婴幼儿配方奶粉、食品、药品、饲料等领域，市场需求量大。含有omega-3长链多不饱和脂肪酸的油脂传统来源于鱼油提取，存在资源有限、受季节等环境因素影响大、不可持续等缺陷。而采用化学合成法存在合成步骤繁琐、过程产率低、环境污染严重等问题。相比之下，利用微生物发酵生产系列脂质化合物具有环境污染小、原料来源广泛、所产油脂安全性好、产品质量好等优点。
裂殖壶菌是生产DHA的重要工业菌株，市售非鱼油型DHA大部分来自于裂殖壶菌发酵。近年来，随着DHA生理功能研究的进一步深入以及大健康背景的推动，高含量DHA被证明有更高的营养及药用价值，国标要求的DHA含量为35%的油脂已远不能满足市场需求。因此，需要通过生物技术手段提高裂殖壶菌中DHA含量，以满足市场需求。例如，CN101979623A通过添加外源调节因子乙酸、柠檬酸和辛伐他汀的一种或几种组合时，可促进裂殖壶菌合成DHA，使得油脂中DHA含量提高到40%左右；CN114525312A通过使用不额外补充钠、氯离子的发酵培养基进行发酵培养，油脂中DHA含量达到50%；CN115807052A通过利用深孔板发酵模拟摇瓶发酵，显著提高裂殖壶菌筛选通量和筛选效率，但是最终裂殖壶菌EU432菌株的油脂中DHA含量仅达到34.5%，且油脂产量偏低；CN114703238A通过控制碳源甘油补加时机解决了裂殖壶菌共同利用葡萄糖及甘油生产效率低的问题，油脂中DHA含量达到46.28%；专利申请CN112481189A开发了一种通过控制发酵液环境中碳源和氮源的浓度进而对裂殖壶菌进行驯化的方法，油脂中DHA含量达到55.1%。
由于提高DHA的含量与精制纯化的成本密切相关，如果油脂中DHA含量能够提高到70%左右，那么相较于油脂中DHA含量为50%，最终产品的利润率将提高30%左右。此外，高含量的DHA藻粉被逐步用于生产DHA原生奶、DHA鸡蛋以及水产等饲料领域，藻粉中DHA的含量对动物体内DHA的积累量，动物的产蛋率都有较大的益处。
因此，尽管以上现有技术能一定程度上提高裂殖壶菌中DHA的含量，但是DHA在藻粉或微生物油脂中的含量仍未达到预期，导致最终产品的成本较高，且在饲料领域的应用也受到限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用，该方法能够促进微生物生长过程中甘油三酯的重排，提高菌体和油脂中多不饱和脂肪酸的含量。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法，该调控方法包括：将所述产油微生物进行发酵培养，在所述发酵培养的过程中添加调节剂，其中，所述调节剂选自替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍和乙莫克舍钠盐中的至少一种。
优选地，所述调节剂在所述发酵培养的过程中的添加量为0.1-150μM。
优选地，所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和小球藻中的至少一种。
优选地，所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸中的至少一种。
本发明第二方面提供上述的调控方法在制备微生物菌粉和/或微生物油脂中的应用。
本发明第三方面提供一种微生物菌粉的制备方法，该方法包括：将产油微生物采用上述的调控方法进行发酵培养得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离得到菌体，将所述菌体进行干燥制粉，或者，将所述发酵液直接进行干燥制粉。
本发明第四方面提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将产油微生物采用上述的调控方法进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液进行破壁、提取。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法，在产油微生物发酵培养的过程中添加一类调节剂，该类调节剂能够有效促进产油微生物生长过程中甘油三酯的重排，使得甘油三酯更倾向于存储多不饱和脂肪酸，尤其有利于提高二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸的积累，进而能够提高微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量；此外，该类调节剂还能够促进产油微生物中油脂的积累，提高微生物菌体中油脂的含量，进而提高微生物油脂的产量。进一步地，将该调控方法应用于制备微生物菌粉或者微生物油脂，能够使得微生物菌粉或者微生物油脂富含多不饱和脂肪酸，有效降低多不饱和脂肪酸产品的成本，更加有利于其在生产原生奶、鸡蛋以及水产饲料领域的应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法及应用，该调控方法包括：将所述产油微生物进行发酵培养，在所述发酵培养的过程中添加调节剂，其中，所述调节剂选自替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍和乙莫克舍钠盐中的至少一种。
本发明的发明人在研究过程中，意外地发现，替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍和乙莫克舍钠盐这类调节物质，能够作为产油微生物发酵过程中的调节剂，有效促进产油微生物生长过程中甘油三酯的重排，使得甘油三酯更倾向于存储多不饱和脂肪酸，尤其有利于提高二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸的积累，进而能够提高微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量；此外，该类调节剂还能够促进产油微生物中油脂的积累，提高微生物菌体中油脂的含量，进而提高微生物油脂的产量。基于此，将该类调节物质应用于产油微生物中制备微生物菌粉或者微生物油脂，能够使得微生物菌粉或者微生物油脂富含多不饱和脂肪酸，有效降低多不饱和脂肪酸产品的成本，尤其裂殖壶菌的油脂中DHA含量可在60%以上，且油脂产量高、生产效率高，更加有利于其在原生奶、鸡蛋及水产饲料领域的应用。
此外，该类调节剂调控产油微生物的发酵过程后，微生物菌体经干燥后形成的菌粉以及从微生物菌体中分离出的油脂中均未检出明显的调节剂的残留，表明其添加不影响所得获得的微生物菌粉及油脂的安全性，符合食品领域的应用要求。
本发明中采用的调节剂均可以商购获得。
从更进一步提高产油微生物中多不饱和脂肪酸的含量来考虑，优选地，所述调节剂在所述发酵过程中的添加量为0.1-150μM，该添加量指的是在发酵过程中调节剂这一类物质的总添加量，即在调节剂选用多种调节物质和/或分多次进行添加时，所有调节物质的总摩尔量。具体地，所述调节剂的添加量具体可以为0.1μM、10μM、50μM、100μM、150μM或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。从更进一步提高微生物油脂的产量和油脂中多不饱和脂肪酸含量的角度来考虑，更优选地，所述调节剂在所述发酵过程中的添加量为50-150μmol。
示例性地，调节剂的各类别和用量优选的范围为：Perhexiline maleate（马来酸哌克昔林）0.2-10μM、Malonyl Coenzyme A lithium（丙二酰辅酶A锂盐）0.1-40μM、McN3716（帕莫酸甲酯）1-100μM、Carbacyclin（卡巴环素）0.5-50μM、Perhexiline（哌克昔林）0.2-100μM、Teglicar（替格列卡）0.1-50μM、Etomoxir（乙莫克舍）0.5-40μM、Etomoxir sodiumsalt（乙莫克舍钠盐）0.1-50μM。本发明可以按照上述优选的范围添加单种调节物质，也可以按照上述优选的范围添加多种调节物质。
根据本发明，所述调控方法可以调控多种能够生成含多不饱和脂肪酸油脂的产油微生物的发酵培养过程，以提高相应的多不饱和脂肪酸的积累。优选地，所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和小球藻中的至少一种；其中，裂殖壶菌的油脂中通常富含二十二碳六烯酸（DHA）或者二十碳五烯酸（EPA），高山被孢霉的油脂中通常富含二十碳四烯酸（ARA），小球藻的油脂中通常富含EPA或者DHA等。基于此，优选地，所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸中的至少一种。
本发明中，裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）、高山被孢霉（Mortierella alpina）和小球藻（Chlorella）可以是任意一种可以用于生产多不饱和脂肪酸的菌株，可商购获得，也可以自行筛选获得。例如，裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）具体可以为Schizochytrium sp.HX-308、Schizochytrium sp.ATCC 20888；高山被孢霉（Mortierella alpina）具体可以为Mortierella alpinaACCC 31952、Mortierella alpinaACCC 32468、Mortierella alpinaACCC 31578；小球藻（Chlorella）具体可以为ChlorellaATCC 50258、ChlorellaATCC11469。
本发明中，调节剂可以采用上述调节物质中的一种，也可以采用上述调节物质中的多种；优选情况下，所述产油微生物为裂殖壶菌时，调节剂采用替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、哌克昔林、乙莫克舍和帕莫酸甲酯中的至少一种；所述产油微生物为高山被孢霉时，调节剂采用替格列卡、马来酸哌克昔林、卡巴环素、丙二酰辅酶A锂盐、哌克昔林和乙莫克舍中的至少一种；所述产油微生物为小球藻时，调节剂采用替格列卡、马来酸哌克昔林、帕莫酸甲酯、哌克昔林、乙莫克舍钠盐和乙莫克舍中的至少一种。
根据本发明，调节剂可以是在产油微生物发酵开始时添加，也可以在发酵开始后一段时间进行添加；可以一次性加入，也可以分多次进行加入。优选地，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述发酵培养的时间为120-150h，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后45-50h、发酵开始后58-62h、发酵开始后70-75h、发酵开始后82-86h、发酵开始后94-98h和发酵开始后105-110h中的至少一者。更加优选地，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后45-50h、发酵开始后70-75h和发酵开始后94-98h中的至少一者。
根据本发明，优选地，所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养的时间为10-14d，所述调节剂的添加时间可以选自发酵开始后3-4d、发酵开始后5-6d、发酵开始后7-8d和发酵开始后9-10h中的至少一者。更加优选地，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后3-4d、发酵开始后5-6d和发酵开始后7-8d中的至少一者。
根据本发明，优选地，所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养的时间为20-24d，所述调节剂的添加时间可以选自发酵开始后3-4d、发酵开始后5-6d、发酵开始后7-8d、发酵开始后9-10d、发酵开始后11-12d、发酵开始后13-14d、发酵开始后15-16d、发酵开始后17-18d和发酵开始后19-20d中的至少一者。更加优选地，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后5-6d、发酵开始后7-8d、发酵开始后9-10d、发酵开始后11-12d、发酵开始后13-14d和发酵开始后15-16d中的至少一者。
本发明对所述产油微生物的发酵培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述产油微生物大量增殖即可。优选地，所述发酵培养的过程包括：将所述产油微生物的菌种或者种子液接种至发酵培养基中进行液体培养；相应地，发酵培养基采用适于产油微生物生长的液体培养基。
本发明中发酵培养基能够提供所述产油微生物生长增殖所需的营养即可，优选情况下，所述产油微生物为裂殖壶菌时，发酵培养基含有碳源60-100g/L、氮源20-35g/L、无机盐12-30g/L和维生素6-15mg/L。其中，碳源、氮源、无机盐和维生素均可以采用微生物发酵常用的碳源、氮源、无机盐和维生素，进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源含有酵母浸粉和谷氨酸钠，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化锰和钼酸钠，所述维生素含有泛酸钙、维生素B6和维生素B12。
示例性地，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述发酵培养基含有：葡萄糖60-100g/L，酵母浸粉5-15g/L，硫酸钠5-12g/L，硫酸镁2-4g/L，硫酸铵4-8g/L，氯化钾1-2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，硫酸钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，谷氨酸钠15-20g/L，七水合硫酸锌1-5mg/L，六水合氯化钴0.01-0.1mg/L，五水合硫酸铜2-6mg/L，六水合硫酸镍1-2mg/L，七水合硫酸亚铁8-15mg/L，泛酸钙2-4mg/L，四水合氯化锰3-5mg/L，二水合钼酸钠0.02-0.06mg/L，维生素B64-10mg/L，维生素B120.1-0.5mg/L，pH为6.0-6.5。
优选情况下，所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养基含有碳源60-100g/L、氮源8-15g/L和无机盐15-60g/L。其中，碳源、氮源和无机盐均可以采用微生物发酵常用的碳源、氮源和无机盐，进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源选自酵母浸粉、酵母膏和蛋白胨中的至少一种，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾和硫酸镁。
示例性地，所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养基含有：葡萄糖60-100g/L，酵母浸粉8-15g/L，硫酸钠3-12g/L，硫酸钾2-4g/L，硫酸铵4-8g/L，氯化钾1-2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，磷酸二氢钾5-20g/L，硫酸镁2-10g/L，pH值为5.0-6.5。
优选情况下，所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养基含有：无机盐1.2-9g/L和维生素2-5.5mg/L；其中，无机盐和维生素均可以采用微生物发酵常用的无机盐和维生素，进一步优选地，所述无机盐含有硫酸钠、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化锰和钼酸钠，所述维生素含有泛酸钙、维生素B1、维生素B6和维生素B12。
示例性地，所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养基含有：硫酸钠0.1-4g/L，磷酸二氢钾0.2-4g/L，七水合硫酸锌1-5mg/L，六水合氯化钴0.01-0.1mg/L，五水合硫酸铜2-6mg/L，六水合硫酸镍1-2mg/L，七水合硫酸亚铁8-15mg/L，泛酸钙2-4mg/L，四水合氯化锰3-5mg/L，二水合钼酸钠0.02-0.06mg/L，维生素B10.02-0.4mg/L，维生素B60.04-0.5mg/L，维生素B120.01-0.2mg/L。
根据本发明，所述产油微生物的种子液可以通过将产油微生物的菌种进行平板活化后，稀释至液体培养基中获得，也可以通过将产油微生物的菌种接种至液体的种子培养基中培养获得。优选地，所述产油微生物的种子液的制备过程包括：将所述产油微生物的菌种接种至种子培养基中进行至少一次种子培养。进一步优选地，所述产油微生物的种子液的制备过程包括：将所述产油微生物的菌种接种至种子培养基中进行1-3次种子培养。
本发明中种子培养基能够提供所述产油微生物生长增殖所需的营养即可，优选情况下，所述产油微生物为裂殖壶菌时，种子培养基含有：碳源40-60g/L、氮源12-18g/L、无机盐12-26g/L和维生素2-4mg/L。其中，碳源、氮源、无机盐和维生素均可以采用微生物发酵常用的碳源、氮源、无机盐和维生素，进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源含有酵母浸粉和谷氨酸钠，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化锰和钼酸钠，所述维生素含有泛酸钙。
示例性地，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述种子培养基可以含有：葡萄糖40-60g/L，酵母浸粉4-6g/L，硫酸钠5-8g/L，硫酸镁2-4g/L，硫酸铵4-8g/L，氯化钾1-2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，硫酸钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，谷氨酸钠8-12g/L，七水合硫酸锌1-5mg/L，六水合氯化钴0.01-0.1mg/L，五水合硫酸铜2-6mg/L，六水合硫酸镍1-2mg/L，七水合硫酸亚铁8-15mg/L，泛酸钙2-4mg/L，四水合氯化锰3-5mg/L，二水合钼酸钠0.02-0.06mg/L，pH为4.0-6.5。
优选情况下，所述产油微生物为高山被孢霉时，所述种子培养基含有碳源20-40g/L、氮源4-8g/L和无机盐2-18g/L。其中，碳源、氮源和无机盐均可以采用微生物发酵常用的碳源、氮源和无机盐，进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源选自酵母浸粉、酵母膏和蛋白胨中的至少一种，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸镁和磷酸二氢钾。
示例性地，所述产油微生物为高山被孢霉时，所述种子培养基含有：葡萄糖20-40g/L，酵母浸粉4-8g/L，硫酸钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.5-4g/L，七水合硫酸镁0.1-5g/L，pH值为4.0-6.5。
根据本发明，为了能够进一步提高产油微生物生产的油脂中多不饱和脂肪酸含量的含量，优选地，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述种子培养的条件至少包括：接种量为0.5-2体积%，温度为20-30℃，转速为150-250rpm，时间为18-30h；所述发酵培养的条件至少包括：接种量为2-20体积%，温度为20-30℃，转速为150-550rpm。所述产油微生物为高山被孢霉时，所述种子培养的条件至少包括：接种量为0.5-2体积%，温度为10-30℃，转速为150-250rpm，时间为2-4d；所述发酵培养的条件至少包括：接种量为2-20体积%，温度为20-30℃，转速为100-450rpm。所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养的条件至少包括：接种量为0.5-10体积%，温度为20-30℃；所述发酵培养的过程包括：在光照强度为3000-5000lux条件下不间断光照处理20-28h后，每隔10-15h以振荡强度为50-250rpm进行振荡培养1-30min。
本发明中，裂殖壶菌和高山被孢霉的发酵培养可以采用摇瓶进行振摇培养，也可以采用发酵罐（例如3L发酵罐、5L发酵罐）进行搅拌培养；其中，所述裂殖壶菌振摇培养的条件为20-30℃，150-250rpm；所述裂殖壶菌发酵罐培养的条件为20-30℃，150-550rpm，并及时检测葡萄糖含量，使发酵罐内的发酵液中碳源浓度始终在20g/L以上；所述高山被孢霉振摇培养的条件为20-30℃，150-250rpm；所述裂殖壶菌发酵罐培养的条件为20-30℃，100-450rpm，并及时检测葡萄糖含量，使发酵罐内的发酵液中碳源浓度始终在20g/L以上。
本发明第二方面提供上述的调控方法在制备微生物菌粉和/或微生物油脂中的应用。基于该调控方法能够明显提高微生物菌粉或者微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量，有效降低多不饱和脂肪酸产品的成本，更加有利于其在生产原生奶、鸡蛋及水产饲料领域的应用。
本发明第三方面提供一种微生物菌粉的制备方法，该方法包括：将产油微生物采用上述的调控方法进行发酵培养得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离得到菌体，将所述菌体进行干燥制粉，或者，将所述发酵液直接进行干燥制粉。
本发明中，微生物菌粉可以是采用上述的裂殖壶菌、高山被孢霉和小球藻中的任意一种或多种，尤其是裂殖壶菌制成的菌粉一般作为DHA藻粉，应用于生产原生奶、鸡蛋及水产饲料领域。
根据本发明，所述发酵液进行固液分离可以采用离心、过滤等任意一种常规的分离方式，例如，离心的条件可以包括：转速为4000-6000rpm，时间为8-12min。所述干燥制粉可以是将菌体或者发酵液干燥后粉碎获得，也可以将菌体或者发酵液进行喷雾干燥获得。其中，所述干燥的温度可以为160-180℃。
本发明第四方面提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将产油微生物采用上述的调控方法进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液进行破壁、提取。
根据本发明，微生物的细胞破壁可以采用本领域常规的方式，优选地，采用破壁酶酶解方法进行所述破壁，以能够提高破壁效率，减小对微生物细胞中代谢产物的破坏。
根据本发明，优选地，所述破壁步骤的条件包括：所述破壁酶的用量为0.1-5g/L，具体可以为0.1g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；pH为10-14，具体可以为10、11、12、13、14，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；转速为100-200rpm，具体可以为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；温度为40-60℃，具体可以为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；时间为5-15h，具体可以为5h、7h、9h、11h、13h、15h，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。
根据本发明，为了提高对微生物油脂的提取效率，优选地，在提取前将所述破壁后的发酵液与无水乙醇混合，使得破壁酶失活；所述提取步骤采用的溶剂为正己烷，经溶剂提取后将该溶剂进行蒸发去除，以获得含多不饱和脂肪酸的微生物油脂。
根据本发明一种特别优选的实施方式，提供一种微生物油脂的制备方法，以产油微生物为裂殖壶菌为例，该方法包括：
S1、将产油微生物以0.5-2体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为20-30℃、转速为150-200rpm的条件下培养18-30h得到一级种子液，取一级种子液以0.5-2体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为20-30℃、转速为150-200rpm的条件下培养18-30h得到二级种子液，取二级种子液以0.5-2体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为20-30℃、转速为150-200rpm的条件下培养18-30h得到三级种子液；
S2、将三级种子液以2-20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为20-30℃、转速为150-550rpm的条件下进行发酵培养120-150h，并在发酵开始后45-50h、发酵开始后58-62h、发酵开始后70-75h、发酵开始后82-86h、发酵开始后94-98h和发酵开始后105-110h中的至少一个时间内向发酵液中添加调节剂，使得调节剂在发酵培养阶段的添加量为0.1-150μM，发酵结束后得到发酵液；
S3、将破壁酶以0.1-5g/L的添加量加入发酵液中，在pH为10-14、转速为100-200rpm、温度为40-60℃的条件下酶解5-15h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:0.8-1.2混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂；
所述调节剂选自替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍和乙莫克舍钠盐中的至少一种；
所述种子培养基含有：葡萄糖40-60g/L，酵母浸粉4-6g/L，硫酸钠5-8g/L，硫酸镁2-4g/L，硫酸铵4-8g/L，氯化钾1-2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，硫酸钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，谷氨酸钠8-12g/L，七水合硫酸锌1-5mg/L，六水合氯化钴0.01-0.1mg/L，五水合硫酸铜2-6mg/L，六水合硫酸镍1-2mg/L，七水合硫酸亚铁8-15mg/L，泛酸钙2-4mg/L，四水合氯化锰3-5mg/L，二水合钼酸钠0.02-0.06mg/L，pH为4.0-6.5；
所述发酵培养基含有：葡萄糖60-100g/L，酵母浸粉5-15g/L，硫酸钠5-12g/L，硫酸镁2-4g/L，硫酸铵4-8g/L，氯化钾1-2g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，硫酸钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，谷氨酸钠15-20g/L，七水合硫酸锌1-5mg/L，六水合氯化钴0.01-0.1mg/L，五水合硫酸铜2-6mg/L，六水合硫酸镍1-2mg/L，七水合硫酸亚铁8-15mg/L，泛酸钙2-4mg/L，四水合氯化锰3-5mg/L，二水合钼酸钠0.02-0.06mg/L，维生素B64-10mg/L，维生素B120.1-0.5mg/L，pH为6.0-6.5。
上述优选实施例提供的方法制备得到的微生物油脂中DHA的含量更高。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，裂殖壶菌Schizochytrium sp.HX-308现保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 209059，已在专利申请CN101575584A中公开；
裂殖壶菌Schizochytrium sp.购自美国典型微生物菌种保藏中心，编号为ATCC20888；
高山被孢霉Mortierella alpina购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 31952；
高山被孢霉Mortierella alpina购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 32468；
高山被孢霉Mortierella alpina购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC 31578；
小球藻Chlorella购自美国典型微生物菌种保藏中心，编号为ATCC 50258；
小球藻Chlorella购自美国典型微生物菌种保藏中心，编号为ATCC 11469；
替格列卡（Teglicar）购于Sigma试剂公司，其CAS号为250694-07-6；
马来酸哌克昔林（Perhexiline maleate）购于阿拉丁试剂公司，其CAS号6724-53-4；
丙二酰辅酶A锂盐（Malonyl Coenzyme A lithium）购于麦克林试剂公司，其CAS号为108347-84-8；
帕莫酸甲酯（McN3716）购于TargetMol试剂公司，其CAS号为130-85-8；
卡巴环素（Carbacyclin）购于Acmec试剂公司，其CAS号为69552-46-1；
哌克昔林（Perhexiline）购于阿拉丁试剂公司，其CAS号为6621-47-2；
乙莫克舍（Etomoxir）购于毕得试剂公司，其CAS号为124083-20-1；
乙莫克舍钠盐（Etomoxir sodium salt）购于毕得试剂公司，其CAS号为124083-20-1；
破壁酶购于夏盛试剂公司，其产品编号为FFY-0673；
其他原料和试剂均为常规的市售品。
以下实施例中，产油微生物的生物量检测方法为：取100mL发酵液在8000rpm条件下离心收集菌体，并用0.2M PBS缓冲液（pH 7.0）清洗菌体2遍，离心获得菌体沉淀；将菌体沉淀在-80℃冻存10h后，置于冻干机中冻干36h；用重量法计算细胞干重，换算出每升发酵液中产油微生物的生物量。
微生物油脂/DHA藻粉/牛奶/鸡蛋等样品中多不饱和脂肪酸组成测定的方法为：取20μL油脂/30mg藻粉/50mg牛奶/100mg鸡蛋进行脂肪酸甲酯化，加入到含有1mL 1M氢氧化钾-甲醇溶液的EP管中，在20℃和1000rpm条件下振荡6h，加入50μL浓硫酸终止反应，加入1mL正己烷在20℃和1000rpm条件下振荡0.5h萃取脂质；将萃取相装入液相小瓶中，进行气相检测，采用GC-2010 (Shimadzu，Japan)气相系统分析，配有DB-23毛细管柱(60m *0.22mm)和火焰离子化检测器(FID)，氮气被用作载气，注入量为1μL，注入温度为250℃，柱温按25℃/min的速度从100℃升高到200℃，再按4℃/min速度升高到230℃，并保持9min，FID检测器温度为280℃，通过与相关外部标准(Sigma，美国)的比较，鉴别出不同多不饱和脂肪酸组成，以非内源脂肪酸(C19:0)为内标，从色谱图上的峰面积计算出单个多不饱和脂肪酸的含量；
微生物油脂中是否含有添加的调节剂的检测方法：取20μL油脂用正己烷溶解，采用高效液相色谱(1260 Infinity II；安捷伦公司，美国)配备4.6mm × 150mm色谱柱(Eclipse XDBC18，美国安捷伦科技公司)，采用乙腈/水 (90/10，v/v)(溶剂A)和甲醇/异丙醇(60/40，v/v)(溶剂B)的梯度溶剂体系：先使用100%溶剂A和0%溶剂B，然后在15min内将溶剂A降至10%，将溶剂B增加到90%，并保留15-30min；以调节剂的标准品制作标准品浓度标曲，明确调节剂的出峰时间和峰面积对应的浓度；通过高效液相色谱的特征峰分析确认油脂中物质的组成，鉴定油脂中是否存在调节物质。
DHA藻粉中是否含有添加的调节剂的检测方法：取40mg藻粉，用正己烷溶解后用均质仪进行破碎，离心取上清，再采用高效液相色谱(1260 Infinity II；安捷伦公司，美国)配备4.6mm × 150mm色谱柱(Eclipse XDBC18，美国安捷伦科技公司)，采用乙腈/水 (90/10，v/v)(溶剂A)和甲醇/异丙醇(60/40，v/v)(溶剂B)的梯度溶剂体系：先使用100%溶剂A和0%溶剂B，然后在15min内将溶剂A降至10%，将溶剂B增加到90%，并保留15-30min；以调节剂的标准品制作标准品浓度标曲，明确调节剂的出峰时间和峰面积对应的浓度；通过高效液相色谱的特征峰分析确认DHA藻粉中物质的组成，鉴定藻粉中是否存在调节物质。
发酵过程中的葡萄糖浓度使用测糖仪（SBA-40ES）进行检测。
在无特殊说明的情况下，室温指的是25±5℃。
实施例1
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖50g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸钠6g/L，硫酸镁3g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾1.5g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸钾0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，谷氨酸钠10g/L，七水合硫酸锌3mg/L，六水合氯化钴0.05mg/L，五水合硫酸铜4mg/L，六水合硫酸镍1.5mg/L，七水合硫酸亚铁12mg/L，泛酸钙3mg/L，四水合氯化锰4mg/L，二水合钼酸钠0.04mg/L，pH为5，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖80g/L，酵母浸粉10g/L，硫酸钠8g/L，硫酸镁3g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾1.5g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸钾0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，谷氨酸钠18g/L，七水合硫酸锌3mg/L，六水合氯化钴0.05mg/L，五水合硫酸铜4mg/L，六水合硫酸镍1.5mg/L，七水合硫酸亚铁12mg/L，泛酸钙3mg/L，四水合氯化锰4mg/L，二水合钼酸钠0.04mg/L，维生素B67mg/L，维生素B120.3mg/L，pH为6.0，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.HX-308）菌株以1体积%的接种量接种于种子培养基中，在温度为25℃、转速为180rpm的条件下培养24h得到一级种子液，取一级种子液以1体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为25℃、转速为180rpm的条件下培养24h得到二级种子液，取二级种子液以1体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为25℃、转速为180rpm的条件下培养24h得到三级种子液；
S3、将三级种子液以体积比10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm的条件下进行发酵培养132h，并在发酵开始后60h向发酵液中添加25μM替格列卡，在发酵开始后96h向发酵液中添加50μM哌克昔林，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以3g/L的添加量加入发酵液中，在pH为12、转速为150rpm、温度为50℃的条件下酶解10h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例2
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖60g/L，酵母浸粉6g/L，硫酸钠8g/L，硫酸镁4g/L，硫酸铵8g/L，氯化钾2g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸钾1g/L，磷酸二氢钾2g/L，谷氨酸钠12g/L，七水合硫酸锌5mg/L，六水合氯化钴0.1mg/L，五水合硫酸铜6mg/L，六水合硫酸镍2mg/L，七水合硫酸亚铁15mg/L，泛酸钙4mg/L，四水合氯化锰5mg/L，二水合钼酸钠0.06mg/L，pH为6.5，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖100g/L，酵母浸粉15g/L，硫酸钠12g/L，硫酸镁4g/L，硫酸铵8g/L，氯化钾2g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸钾1g/L，磷酸二氢钾2g/L，谷氨酸钠20g/L，七水合硫酸锌5mg/L，六水合氯化钴0.1mg/L，五水合硫酸铜6mg/L，六水合硫酸镍2mg/L，七水合硫酸亚铁15mg/L，泛酸钙4mg/L，四水合氯化锰5mg/L，二水合钼酸钠0.06mg/L，维生素B610mg/L，维生素B120.5mg/L，pH为6.5，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.HX-308）菌株以1体积%的接种量接种于种子培养基中，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下培养30h得到一级种子液，取一级种子液以2体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下培养30h得到二级种子液，取二级种子液以2体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下培养30h得到三级种子液；
S3、将三级种子液以2体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为20℃、转速为250rpm的条件下进行发酵培养120h，并在发酵开始后48h向发酵液中添加20μM丙二酰辅酶A锂盐，在发酵开始后84h向发酵液中添加30μM卡巴环素，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以0.1g/L的添加量加入发酵液中，在pH为14、转速为200rpm、温度为60℃的条件下酶解15h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:0.8混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例3
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉4g/L，硫酸钠5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵4g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.1g/L，硫酸钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，谷氨酸钠8g/L，七水合硫酸锌1mg/L，六水合氯化钴0.01mg/L，五水合硫酸铜2mg/L，六水合硫酸镍1mg/L，七水合硫酸亚铁8mg/L，泛酸钙2mg/L，四水合氯化锰3mg/L，二水合钼酸钠0.02mg/L，pH为4，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖60g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸钠5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵4g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.1g/L，硫酸钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，谷氨酸钠15g/L，七水合硫酸锌1mg/L，六水合氯化钴0.01mg/L，五水合硫酸铜2mg/L，六水合硫酸镍1mg/L，七水合硫酸亚铁8mg/L，泛酸钙2mg/L，四水合氯化锰3mg/L，二水合钼酸钠0.02mg/L，维生素B64mg/L，维生素B120.1mg/L，pH为6.5，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.HX-308）以1体积%的接种量接种于种子培养基中，在温度为30℃、转速为200rpm的条件下培养20h得到一级种子液，取一级种子液以0.5体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为30℃、转速为200rpm的条件下培养20h得到二级种子液，取二级种子液以0.5体积%的接种量接种至种子培养基中，在温度为30℃、转速为200rpm的条件下培养20h得到三级种子液；
S3、将三级种子液以20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下进行发酵培养144h，并在发酵开始后72h向发酵液中添加45μM乙莫克舍钠盐，在发酵开始后96h向发酵液中添加5μM马来酸哌克昔林，在发酵开始后108h向发酵液中添加100μM帕莫酸甲酯，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以5g/L的添加量加入发酵液中，在pH为10、转速为100rpm、温度为40℃的条件下酶解5h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1.2混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例4-12
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌的发酵获得微生物油脂，不同的是，调节剂的类别和用量如表1和表2所示。
表1
表2
对比例1
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
对比例2
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌的发酵获得微生物油脂，不同的是，将步骤S3替换为：将三级种子液以体积比10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm的条件下进行发酵培养132h，并在发酵开始后60h向发酵液中添加25μM柠檬酸，在发酵开始后96h向发酵液中添加50μM恩西地平，发酵结束后得到发酵液。
实施例13
按照实施例3的方法进行裂殖壶菌的发酵获得微生物油脂，不同的是，将裂殖壶菌（Schizochytriumsp. HX-308）替换为裂殖壶菌（Schizochytriumsp. ATCC 20888），并将步骤S3替换为：
S3、将三级种子液以20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下进行发酵培养144h，并在发酵开始后60h向发酵液中添加25μM替格列卡，在发酵开始后90h向发酵液中添加50μM哌克昔林，发酵结束后得到发酵液。
对比例3
按照实施例13的方法进行裂殖壶菌的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
测试例1
检测实施例1-实施例13和对比例1-对比例3得到的发酵液的生物量、微生物油脂的含量以及微生物油脂中DHA和EPA的含量，结果见表3。
测定实施例1-实施例13和对比例1-对比例3得到的微生物油脂中是否含有添加的调节剂，结果见表3。
取实施例2、实施例3、实施例6和对比例1-对比例2中步骤S3获得的发酵液，在170℃条件下进行喷雾干燥，得到裂殖壶菌DHA藻粉。检测各裂殖壶菌DHA藻粉中DHA的含量以及调节剂的残留量，结果见表4。
表3
表4
测试例2
将实施例3对应的裂殖壶菌DHA藻粉与奶牛饲料按5g藻粉/kg饲料的比例混匀，连续喂养奶牛并收集牛奶，以正常饲料连续喂养的奶牛所产牛奶作为比对，检测产奶中DHA的含量，结果如表5所示。
表5
表5的结果显示，当使用含有实施例3对应的裂殖壶菌DHA藻粉的饲料连续喂养奶牛30天后，牛奶中的DHA含量达到并稳定维持在300mg/kg附近。
将实施例3对应的裂殖壶菌DHA藻粉与鸡饲料按100g藻粉/kg鸡饲料比例混匀，连续喂养鸡，并收集鸡蛋，以正常饲料连续喂养的鸡所产鸡蛋作为比对，检测鸡蛋中DHA的含量，结果如表6所示。
表6
表6的结果显示，当使用含有裂殖壶菌DHA藻粉的饲料连续喂养鸡13天后，鸡蛋中的DHA含量就能稳定保持在250mg/100g以上。
实施例14
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，硫酸钠6g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸镁3g/L，pH为5，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖80g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸钠8g/L，硫酸钾3g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾1.5g/L，氯化钙0.15g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水合硫酸镁6g/L，pH为6.0，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC 31952）的少量菌丝接种于种子培养基中，在温度为25℃、转速为180rpm的条件下培养3d得到种子液；
S3、将种子液以体积比10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm的条件下进行发酵培养12d，并在发酵开始后4d向发酵液中添加25μM替格列卡，在发酵开始后7d向发酵液中添加50μM哌克昔林，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以3g/L的添加量加入发酵液中，在pH为12、转速为150rpm、温度为50℃的条件下酶解10h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例15
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉8g/L，硫酸钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水合硫酸镁0.1g/L，pH为6.5，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖100g/L，酵母浸粉8g/L，硫酸钠3g/L，硫酸钾2g/L，硫酸铵4g/L，氯化钾2g/L，氯化钙0.2g/L，磷酸二氢钾20g/L，七水合硫酸镁2g/L，pH为6.5，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC 31952）的少量菌丝接种于种子培养基中，在温度为10℃、转速为150rpm的条件下培养4d得到种子液；
S3、将种子液以2体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为20℃、转速为250rpm的条件下进行发酵培养10d，并在发酵开始后5d向发酵液中添加20μM丙二酰辅酶A锂盐，在发酵开始后8d向发酵液中添加30μM卡巴环素，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以0.1g/L的添加量加入发酵液中，在pH为14、转速为200rpm、温度为60℃的条件下酶解15h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:0.8混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例16
S1、种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉4g/L，硫酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水合硫酸镁5g/L，pH为4.0，121℃高温灭菌20min后备用；
发酵培养基的配方为：葡萄糖60g/L，酵母浸粉15g/L，硫酸钠12g/L，硫酸钾4g/L，硫酸铵8g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水合硫酸镁10g/L，pH为5.0，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC 31952）的少量菌丝接种于种子培养基中，在温度为35℃、转速为250rpm的条件下培养2d得到种子液；
S3、将种子液以20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下进行发酵培养14d，并在发酵开始后3d向发酵液中添加45μM乙莫克舍钠盐，在发酵开始后5d向发酵液中添加5μM马来酸哌克昔林，在发酵开始后8d向发酵液中添加100μM帕莫酸甲酯，发酵结束后得到发酵液；
S4、将破壁酶以5g/L的添加量加入发酵液中，在pH为10、转速为100rpm、温度为40℃的条件下酶解5h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1.2混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例17-25
按照实施例14的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，调节剂的类别和用量如表7和表8所示。
表7
表8
对比例4
按照实施例14的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
对比例5
按照实施例14的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，将步骤S3替换为：将种子液以体积比10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm的条件下进行发酵培养12d，并在发酵开始后4d向发酵液中添加25μM柠檬酸，在发酵开始后7d向发酵液中添加50μM恩西地平，发酵结束后得到发酵液。
实施例26
按照实施例16的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，将高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC 31952）替换为高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC32468），并将步骤S3替换为：
S3、将种子液以20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下进行发酵培养14d，并在发酵开始后4d向发酵液中添加25μM替格列卡，在发酵开始后7d向发酵液中添加50μM哌克昔林，发酵结束后得到发酵液。
对比例6
按照实施例26的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
实施例27
按照实施例16的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，将高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC 31952）替换为高山被孢霉（Mortierella alpinaACCC31578），并将步骤S3替换为：
S3、将种子液以20体积%的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下进行发酵培养14d，并在发酵开始后2d向发酵液中添加15μM替格列卡，在发酵开始后4d向发酵液中添加10酵液乙莫克舍，在发酵开始后5d向发酵液中添加50酵液哌克昔林，发酵结束后得到发酵液。
对比例7
按照实施例27的方法进行高山被孢霉的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
测试例3
检测实施例14-实施例27和对比例4-对比例7得到的发酵液的生物量、微生物油脂的含量以及微生物油脂中ARA的含量，结果见表9。
按照测试例1中所述的方法测定实施例14-实施例27和对比例4-对比例7得到的微生物油脂中添加的调节剂的残留量，结果见表9。
表9
实施例28
S1、发酵培养基的配方为：硫酸钠2g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸锌3mg/L，六水合氯化钴0.05mg/L，五水合硫酸铜4mg/L，六水合硫酸镍1.5mg/L，七水合硫酸亚铁12mg/L，泛酸钙3mg/L，四水合氯化锰4mg/L，二水合钼酸钠0.04mg/L，维生素B10.3mg/L，维生素B60.3mg/L，维生素B120.1mg/L，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的小球藻（ChlorellaATCC 50258）以接种量5体积%接种于发酵培养基中，在温度为25℃的条件下，先以光照强度为4000lux不间断光照处理24h，然后每隔12h对摇瓶进行振荡培养，每次振荡培养的振荡强度为150rpm、振荡时间为20min，共培养22d，并在发酵开始后6d向发酵液中添加20μM替格列卡，在发酵开始后12d向发酵液中添加25μM哌克昔林，发酵结束后得到发酵液；
S3、将破壁酶以3g/L的添加量加入发酵液中，在pH为12、转速为150rpm、温度为50℃的条件下酶解10h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例29
S1、发酵培养基的配方为：硫酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水合硫酸锌5mg/L，六水合氯化钴0.01mg/L，五水合硫酸铜2mg/L，六水合硫酸镍1mg/L，七水合硫酸亚铁8mg/L，泛酸钙4mg/L，四水合氯化锰5mg/L，二水合钼酸钠0.06mg/L，维生素B10.02mg/L，维生素B60.5mg/L，维生素B120.2mg/L，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的小球藻（ChlorellaATCC 50258）以接种量10体积%接种于发酵培养基中，在温度为20℃的条件下，先以光照强度为5000lux不间断光照处理28h，然后每隔15h对摇瓶进行振荡培养，每次振荡培养的振荡强度为50rpm、振荡时间为30min，共培养24d，并在发酵开始后7d向发酵液中添加20μM丙二酰辅酶A锂盐，在发酵开始后15d向发酵液中添加30μM卡巴环素，发酵结束后得到发酵液；
S3、将破壁酶以0.1g/L的添加量加入发酵液中，在pH为14、转速为200rpm、温度为60℃的条件下酶解15h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:0.8混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例30
S1、发酵培养基的配方为：硫酸钠4g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水合硫酸锌1mg/L，六水合氯化钴0.1mg/L，五水合硫酸铜6mg/L，六水合硫酸镍2mg/L，七水合硫酸亚铁15mg/L，泛酸钙2mg/L，四水合氯化锰3mg/L，二水合钼酸钠0.02mg/L，维生素B10.4mg/L，维生素B60.04mg/L，维生素B120.01mg/L，121℃高温灭菌20min后备用；
S2、将-80℃保存的小球藻（ChlorellaATCC 50258）以接种量0.5体积%接种于发酵培养基中，在温度为30℃的条件下，先以光照强度为3000lux不间断光照处理20h，然后每隔10h对摇瓶进行振荡培养，每次振荡培养的振荡强度为250rpm、振荡时间为3min，共培养20d，并在发酵开始后5d向发酵液中添加45μM乙莫克舍钠盐，在发酵开始后10d向发酵液中添加5μM马来酸哌克昔林，在发酵开始后15d向发酵液中添加100μM帕莫酸甲酯，发酵结束后得到发酵液；
S3、将破壁酶以5g/L的添加量加入发酵液中，在pH为10、转速为100rpm、温度为40℃的条件下酶解5h得到破壁液，将破壁液冷却后与乙醇以体积比为1:1.2混合，再与正己烷混合进行提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
实施例31-39
按照实施例28的方法进行小球藻的发酵获得微生物油脂，不同的是，调节剂的类别和用量如表10和表11所示。
表10
表11
对比例8
按照实施例28的方法进行小球藻的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
对比例9
按照实施例28的方法进行小球藻的发酵获得微生物油脂，不同的是，将步骤S2替换为：将-80℃保存的小球藻（ChlorellaATCC 50258）以接种量5体积%接种于发酵培养基中，在温度为25℃的条件下，先以光照强度为4000lux不间断光照处理24h，然后每隔12h对摇瓶进行振荡培养，每次振荡培养的振荡强度为150rpm、振荡时间为20 min，共培养22d，并在发酵开始后6d向发酵液中添加25μM柠檬酸，在发酵开始后12d向发酵液中添加50μM恩西地平，发酵结束后得到发酵液。
实施例40
按照实施例30的方法进行小球藻的发酵获得微生物油脂，不同的是，将小球藻（替换为小球藻（ChlorellaATCC 11469），并将步骤S2替换为：
S2、将-80℃保存的小球藻（ChlorellaATCC 50258）以接种量0.5体积%接种于发酵培养基中，在温度为30℃的条件下，先以光照强度为3000lux不间断光照处理20h，然后每隔10h对摇瓶进行振荡培养，每次振荡培养的振荡强度为250rpm、振荡时间为3min，共培养20d，并在发酵开始后6d向发酵液中添加20酵液替格列卡，在发酵开始后12d向发酵液中添加25酵液哌克昔林，发酵结束后得到发酵液。
对比例10
按照实施例40的方法进行小球藻的发酵获得微生物油脂，不同的是，步骤S3中不添加调节剂。
测试例4
检测实施例28-实施例40和对比例8-对比例10得到的发酵液的生物量、微生物油脂的含量以及微生物油脂中EPA和DHA的含量，结果见表12。
按照测试例1中所述的方法测定实施例28-实施例40和对比例8-对比例10得到的微生物油脂中添加的调节剂的残留量，结果见表12。
表12
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种提高微生物菌体和/或微生物油脂中多不饱和脂肪酸含量的调控方法，其特征在于，该调控方法包括：将产油微生物进行发酵培养，在所述发酵培养的过程中添加调节剂，其中，所述调节剂选自替格列卡、马来酸哌克昔林、丙二酰辅酶A锂盐、帕莫酸甲酯、卡巴环素、哌克昔林、乙莫克舍中的至少一种；或者，所述调节剂为马来酸哌克昔林、帕莫酸甲酯和乙莫克舍钠盐；
所述产油微生物选自裂殖壶菌、高山被孢霉和小球藻中的至少一种；
所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于，所述调节剂在所述发酵培养的过程中的添加量为0.1-150μM。
3.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述发酵培养的时间为120-150h，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后45-50h、发酵开始后58-62h、发酵开始后70-75h、发酵开始后82-86h、发酵开始后94-98h和发酵开始后105-110h中的至少一者；
所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养的时间为10-14d，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后3-4d、发酵开始后5-6d和发酵开始后7-8d中的至少一者；
所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养的时间为20-24d，所述调节剂的添加时间选自发酵开始后5-6d、发酵开始后7-8d、发酵开始后9-10d、发酵开始后11-12d、发酵开始后13-14d和发酵开始后15-16d中的至少一者。
4.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于，所述发酵培养的过程包括：将所述产油微生物的菌种或者种子液接种至发酵培养基中进行液体培养；
所述产油微生物的种子液的制备过程包括：将所述产油微生物的菌种接种至种子培养基中进行至少一次种子培养；
所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述种子培养的条件至少包括：接种量为0.5-2体积%，温度为20-30℃，转速为150-250rpm，时间为18-30h；
所述产油微生物为高山被孢霉时，所述种子培养的条件至少包括：接种量为0.5-2体积%，温度为10-30℃，转速为150-250rpm，时间为2-4d。
5.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述发酵培养基含有碳源60-100g/L、氮源20-35g/L、无机盐12-30g/L和维生素6-15mg/L；所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源含有酵母浸粉和谷氨酸钠，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化锰和钼酸钠，所述维生素含有泛酸钙、维生素B6和维生素B12；
所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养基含有碳源60-100g/L、氮源8-15g/L和无机盐15-60g/L；所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的至少一种，所述氮源选自酵母浸粉、酵母膏和蛋白胨中的至少一种，所述无机盐含有硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾和硫酸镁；
所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养基含有无机盐1.2-9g/L和维生素2-5.5mg/L；所述无机盐含有硫酸钠、磷酸二氢钾、硫酸锌、氯化钴、硫酸铜、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化锰和钼酸钠，所述维生素含有泛酸钙、维生素B1、维生素B6和维生素B12。
6.根据权利要求5所述的调控方法，其特征在于，所述产油微生物为裂殖壶菌时，所述发酵培养的条件至少包括：接种量为2-20体积%，温度为20-30℃，转速为150-550rpm；
所述产油微生物为高山被孢霉时，所述发酵培养的条件至少包括：接种量为2-20体积%，温度为20-30℃，转速为100-450rpm；
所述产油微生物为小球藻时，所述发酵培养的条件至少包括：接种量为0.5-10体积%，温度为20-30℃；所述发酵培养的过程包括：在光照强度为3000-5000lux条件下不间断光照处理20-28h后，每隔10-15h以振荡强度为50-250rpm进行振荡培养1-30min。
7.权利要求1至6中任意一项所述的调控方法在制备微生物菌粉和/或微生物油脂中的应用。
8.一种微生物菌粉的制备方法，其特征在于，该方法包括：将产油微生物采用权利要求1至6中任意一项所述的调控方法进行发酵培养得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离得到菌体，将所述菌体进行干燥制粉，或者，将所述发酵液直接进行干燥制粉。
9.一种微生物油脂的制备方法，其特征在于，该方法包括：将产油微生物采用权利要求1至6中任意一项所述的调控方法进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液进行破壁、提取。
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