CN101892160A - 一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种海洋真菌裂殖壶菌LX0809，其具有高产二十二碳六烯酸(DHA)的能力。本发明所述的裂殖壶菌LX0809分离自辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3535，所述裂殖壶菌LX0809通过补料发酵，发酵液的细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L。LX0809菌体细胞及其提取物既可用作食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。菌体细胞中的饱和甘油三酯，经催化转酯化反应可制得生物柴油。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物的应用技术，具体讲是一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其在食品和饲料添加剂和生物柴油工业生产中的应用。其属于微生物应用技术领域。
背景技术
营养学和医学研究表明，DHA是一种重要的营养保健品，可有效增进健康和抵御疾病侵扰。DHA是人脑神经细胞膜中主要的脂质成分，也是大脑、神经和视觉细胞中重要的脂肪酸成分，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着重要作用，特别是在婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位。DHA参与婴儿大脑组织(如脑囊泡，髓磷脂和线粒体)发育。世界卫生组织强烈建议在婴儿食品中添加DHA。
DHA可以从海洋鱼油中提取，也可以通过海洋微生物发酵获得。鱼油DHA生产成本低，价格便宜，但是鱼油中常含有的滴滴涕、化学杀虫剂、多氯联苯类物质、二恶英和六氯苯等有害物质。纯种海洋微生物从纯种培养到精炼都需严格消毒，无菌操作，并可采用国际认可的食品安全生产及控制管理技术，所生产的油脂纯度高、无污染，可做到不含或仅含微量EPA，而且DHA稳定，不含鱼腥味。
到目前为止，已有上百个品种海洋微生物的脂肪酸组成中含有DHA。它们隶属于硅藻类、金藻类、绿藻类、甲藻类、隐甲藻类、蓝藻类和黄藻类。其中研究最多的菌种有三角褐指藻、小球藻、盐藻、中肋骨条藻、新月菱形藻、裂殖壶菌等。其中最有应用价值和发展潜力的海洋微生物是破囊壶菌科的(Thraustochytriaceae)的裂殖壶菌(Schizochytrium)。它具有生产周期短、培养简单、细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，被认为是一种具有潜力的DHA的新生资源，是目前进行工业化培养作为DHA来源最理想的物种之一。 裂殖壶菌的安全性已经得到美国食品和药品部(FDA)的认可，并开发了从医药、食品以及饲料等一系列产品。
授权公告号为CN1648233A的专利公开了一种以裂殖壶菌SR21的菌株为出发菌株，通过化学和物理诱变相结合而得到的一株突变株OUC88，通过优化菌株的培养条件下，培养后期补加碳源，发酵液的细胞干重达到25g/l，DHA含量达到8.27g/l。无论是发酵液的细胞干重，还是DHA含量菌株OUC88均显著低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株。
授权公告号为CN1916156A的专利公开了一种以裂殖壶菌WZU4771菌株及其在制备DHA粉末和DHA油脂中的应用。该菌株在优化的培养条件下培养5天，发酵液的细胞干重达到42.15g/l，DHA含量达到14.1g/l。发酵液的细胞干重明显低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株，DHA含量也略低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株，发酵培养时间也长于本发明，不利于规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种生产周期更短、菌体细胞生物量增加更快、易于规模化培养并高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株。在含有30～50g/L葡萄糖为碳源，1～10g/L的玉米浆为氮源，包括钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、硼化物、溴化物及其混合物的无机盐，pH为4.5～8.0的发酵培养基中20～30℃培养80～100小时，得到含有长链多不饱和脂肪酸的油脂，包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。
本发明所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)是以从辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里(东经122°01′，北纬41°11′)采集的腐土上分离的菌株裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809，该菌株已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.3535，其具体的筛选步骤如下：
1、初筛：取盘锦市沿海滩涂里的腐土接种在所述的初筛培养基(葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，蛋白胨1g/l，青霉素0.5g/l，链霉素0.5g/l，琼脂15g/l，用盘锦市海域海水稀释10倍后配制)平板上，30℃培养3天。挑取培养物转接到新的平板上进行培养，划线分离得到纯培养物。
2、复筛：将纯培养物接种到所述的复筛培养基(葡萄糖40g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨3g/l，用盘锦市海域海水稀释10倍后配制)中，在摇床上培养。离心分离得到培养物，真空干燥至恒重，称量细胞干重。索氏提取法检测细胞干重中的脂肪含量，气相色谱法检测脂肪中的DHA含量，以发酵液细胞干重和DHA产率为指标，筛选得到高产菌株，命名为LX0809。
本发明所述的LX0809在在扫描和透视电镜下观察所述的高产DHA的菌株的外部形态和超微结构，其特征为：营养菌体为椭圆球形，由不连续的细胞壁包裹着，单核。细胞壁由几层紧压在一起的致密鳞片构成，在细胞壁不连续处可分辨鳞片，鳞片厚约2～3纳米。形成放射状的、根状的外质网依附在底物上，外质网产生于外质网形成体，从细胞壁不连续出长出。行无性繁殖，由营养菌体转化为游动孢子囊，其内有许多游动孢子。在游动孢子生成过程中，细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行，并且形成四倍体细胞。游动孢子侧生着不等长的双鞭毛，前向鞭毛两边排列茸鞭茸毛，后向鞭毛较短。
存在由鳞片构成的细胞壁、外质网形成体和外质网是现行的鉴定破囊壶菌科的标准。破囊壶菌的游动孢子形成机制有两种：(1)分裂细胞核分裂完全完成后进行细胞质分裂的阶段性和(2)细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行的连续性分裂。连续性分裂可以形成四倍体细胞。以连续性分裂形成游动孢子，产生四倍体细胞，是裂殖壶菌的特征。因此，所述的高产DHA的诱变菌株鉴定为裂殖壶菌，命名为裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809。
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809在不同时间内的培养基中发酵所得细胞干重和DHA产量如图1所示。发酵液离心后真空干燥得到菌体 干粉，然后菌体干粉经过正己烷萃取，减压蒸馏的到含有DHA毛油。毛油经过脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱蜡等工艺过程，加入抗氧化剂，混匀得到应用于食品的DHA油脂。经过气相色谱检测，油脂含量为细胞干重重量百分含量的40～55％，其中饱和脂肪酸占油脂重量百分含量的40～45％，不饱和脂肪酸占油脂重量百分含量的45～55％，其中DHA占油脂重量百分含量的35～40％，DPA占油脂重量百分含量的10～12％。可用作儿童和妇女的多不饱和脂肪酸补充的保健品，也可作为食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。以棕榈酸酯为主的甘油三酯经过催化转酯化反应制得棕榈酸甲酯，可以作为生物柴油使用。
本发明的优点在于：所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809能够以普通碳源(葡萄糖)和普通氮源(玉米浆)进行细胞生长和DHA积累；所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809通过培养基和培养条件优化，经过100小时发酵培养可达到细胞干重为72.5g/l，DHA含量达到15.3g/l，高于已见报道的菌株；裂殖壶菌(Schizochytrium)的安全性已经得到美国食品和药品部(Food and Drug Administration)的认可，可开发从医药、食品(尤其是孕妇、哺乳期妇女和儿童食品)以及饲料等一系列产品；所述裂殖壶菌LX0809的氨基酸种类平衡，并富含甲硫氨酸和赖氨酸等必需氨基酸，适合作为食品和饲料的添加剂；所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的长链多不饱和脂肪酸谱简单，除DHA外，只含有少量的DPA，利于DHA分离和纯化。
附图说明
图1为裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809(CGMCC3535)的在不同发酵时间下的细胞干重和DHA产量。
具体实施方式
实施实例1.裂殖壶菌的筛选
取辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，接种在所述的初 筛培养基平板上，在30℃下富集培养5天。挑取培养物转接到新的平板上进行培养，直到得到纯培养物为止。将纯培养物接种到装有50ml所述的复筛培养基的250ml摇瓶中，在200rpm的摇床上培养3天，培养温度为30℃。培养液经过离心(8000rpm，5分钟)、水洗后再离心，然后真空干燥(温度为60～80℃，真空度为80干帕)3小时，称量细胞干重。采用索氏提取法萃取细胞干粉中的油脂，然后用气相色谱法检测油脂中的脂肪酸组成，以DHA的产率作为指标，筛选出高产DHA的裂殖壶菌菌株，命名为LX0809。采用离子色谱分析法得到所得裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株的氨基酸谱图见表1。
表1.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的氨基酸谱
| 氨基酸类型 | 占总氨基酸的重量百分比(％) |
| 天门冬氨酸 | 8.95 |
| 苏氨酸 | 4.80 |
| 丝氨酸 | 5.11 |
| 谷氨酸 | 15.97 |
| 脯氨酸 | 4.47 |
| 甘氨酸 | 4.79 |
| 丙氨酸 | 7.99 |
| 缬氨酸 | 7.35 |
| 甲硫氨酸 | 2.24 |
| 异亮氨酸 | 4.15 |
| 亮氨酸 | 7.67 |
| 酪氨酸 | 3.83 |
| 苯丙氨酸 | 4.15 |
| 组氨酸 | 1.92 |
| 赖氨酸 | 6.07 |
| 精氨酸 | 7.03 |
| 半胱氨酸 | 1.92 |
| 色氨酸 | 1.60 |
分析结果显示本发明所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的氨基酸种类及各种氨基酸的数量与营养需要量相符，并且富含甲硫氨酸(2.24％) 和赖氨酸(6.07％)等必需氨基酸。从氨基酸角度来看，裂殖壶菌LX0809也是作为食品膳食补充剂和饲料添加剂的理想来源。
实施实例2.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种接种至500ml摇瓶中。种子液和发酵培养基包括50g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。在30℃的摇床中以250rpm的转速培养至菌液的OD600达到1.0时完成第一代活化，然后取10ml菌液接种至上述新鲜培养基中，连续传三代(均以至菌液的OD600达到1.0时作为一代活化完成)，得到具有较高活力的种子液；再以1％的接种量将种子液接种至5L的发酵罐，搅拌转速300rpm，通气量3.0升/分钟，通过控制通气量和搅拌转速将发酵罐中溶解氧饱和度控制在40％(溶解氧饱和度(％)＝溶解氧实测含量/实测条件下溶解氧的饱和含量)，通过自动添加2.5M的硫酸或氢氧化钠维持pH在7.5。采用SBA-40C生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定发酵液中的葡萄糖含量，补料维持发酵液中的碳源和氮源浓度不变，90小时停止发酵。
发酵液经离心(贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机，8,000rpm，5分钟)弃上清，向离心管中加入与菌体相同体积的蒸馏水洗涤菌体细胞，然后再离心(贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机，10,000rpm，5分钟)弃上清。然后湿菌体经真空干燥(温度为60～80℃，真空度为80千帕)3小时，称量的干细胞72.3g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂36ml/L。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液，减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。气相色谱检测结果(表2)显示，所得的裂殖壶菌 LX0809的脂肪酸组成入表2所示。其中棕榈酸甘油三酯的含量最高，占油脂重量百分含量的40.4％；DHA(C22:6n3)含量较高，占油脂重量百分含量的38.0％，DPA(C22:5n6)含量次之，占油脂重量百分含量的10.5％，其它油脂总计仅占12％，易于提取纯化。
表2.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.91 |
| C 15:0 | 1.64 |
| C 16:0 | 40.4 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.48 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C22:5n6 | 10.0 |
| C22:5n3 | 0.60 |
| C22:6n3 | 38.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例3.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种按照实施例2的方法活化，然后5％的接种量接种至5L发酵罐中。发酵培养基为：30g/L葡萄糖、1g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。按照实施例2条件发酵80小时停止发酵，测得发酵液细胞干重为67.7g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂32ml/L。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液， 减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。菌体细胞油脂的脂肪酸谱如表3所示。其中棕榈酸甘油三酯的含量最高，占油脂重量百分含量的42.5％；DHA(C22:6n3)含量较高，占油脂重量百分含量的36.0％，DPA(C22:5n6)含量次之，占油脂重量百分含量的10.5％，其它油脂总计仅占11％，易于提取纯化和工业化生产。
表3.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.21 |
| C 15:0 | 1.34 |
| C 16:0 | 42.5 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.16 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C 22:5n6 | 10.5 |
| C 22:5n3 | 0.60 |
| C 22:6n3 | 36.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例4.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种按照实施例2的方法活化，然后5％的接种量接种至5L发酵罐中。发酵培养基为：40g/L葡萄糖、5g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。按照实施例2条件发酵90小时停止发酵，测得发酵液细胞干重为71.6g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂105ml。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml 正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液，减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。菌体细胞油脂的脂肪酸谱如表4所示。
表4.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.11 |
| C 15:0 | 1.64 |
| C 16:0 | 41.5 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.48 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C 22:5n6 | 10.0 |
| C 22:5n3 | 0.60 |
| C 22:6n3 | 37.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例5.裂殖壶菌菌体细胞油脂的提取和精炼
取实施实例2所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的干燥细胞200g，用滤纸包裹后置于索氏提取器，用500ml正己烷浸出24小时，然后在减压蒸馏分离除去正己烷得到96ml毛油。毛油在搅拌下加入1ml浓度为95％的磷酸，再加入300ml热水混合均匀后。静置分层后取出上层毛油，用热水反复洗涤至pH值中性。然后在强烈的搅拌下，加入1ml浓度为8％的氢氧化钠溶液。加热至90℃，静置沉降，除去皂脚。再用50ml的90℃去离子水洗涤，然后真空干燥，干燥温度为60～80℃，真空度为80.0千帕。向干燥油脂中加入2.5g活性白土吸附脱色，脱色温度为90℃，脱色时间为20分钟。过滤除去活性白土。然后对油脂采用水蒸气气提脱臭，脱臭温度为180℃，脱臭时间为2小时。脱臭后油脂在慢速搅拌下，冷却至4～6℃左右，约24小时，使固 体脂肪生成较大结晶，沉淀析出。过滤分离得到39ml DHA含量80％以上液体油和43g固体脂肪。向液体油中加入抗氧化剂，得到富含DHA的成品油脂。
实施实例6.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的规模化生产
按照实施实例4所述的方法，得到具有较高活力的种子液；然后将裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌液以5％的接种量将种子液接种至20吨发酵罐中，搅拌转速300rpm，通气量1.0vvm，通过控制通气量和搅拌转速将发酵罐中溶解氧饱和度控制在5～55％(溶解氧饱和度(％)＝溶解氧实测含量/实测条件下溶解氧的饱和含量)，通过自动添加2.5M的硫酸或氢氧化钠维持pH在5.5～7.5之间。采用SBA-40C生物传感分析仪测定发酵液中的葡萄糖含量，通过补料维持发酵液中葡萄糖浓度为40g/L，100小时停止发酵。用碟片离心机分离出菌体细胞，然后在气流干燥机中干燥得到1604kg菌体细胞(含水量低于8％)，然后干燥细胞在萃取罐中用正己烷萃取，萃取温度为40～50℃，板框过滤去除菌体碎片，然后在减压蒸馏分离正己烷得到748kg毛油。取374kg毛油按照实施实例4所述的方法对毛油进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭和冬化处理，得到DHA含量80％以上液体油156kg和171kg固体脂肪。将固体脂肪171kg，置于酯交换反应器，加入4275kg甲醇和17kg的氢氧化钾，在65℃下反应1小时，沉降分层，取上层脂肪酸甲酯经分子蒸馏得到157kg生物柴油，产率达到92％。所得生物柴油以棕榈酸甲酯为主符合2#矿物柴油和相关国家制定的生物柴油的标准，可以作为矿物柴油的替代燃料使用。
实施实例7.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809在食品和饲料中的应用
将上述实施实例6方法所得的发酵液经过121℃杀菌20分钟，经过碟式离心机脱水后送入旋转闪蒸干燥机中干燥得到含水量为5％的菌体干粉，可直接作为食品和饲料添加剂。将菌体干粉用正己烷萃取后得到毛油，减压蒸馏除去正己烷，然后将毛油通过脱胶、脱酸、脱色、脱臭处理得到含DHA重量百分含量为65％，可直接食用或与其它食用油一起食用。
Claims (5)
1.一株海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809，该菌种保藏号为CGMCC No.3535，在含有碳源、氮源和无机盐的发酵培养基中20～30℃培养80～100小时，得到含有长链多不饱和脂肪酸的油脂，包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)，可应用于食品和饲料添加剂。
2.权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵培养基以浓度为30～50g/L葡萄糖为碳源；以1～10g/L的玉米浆为氮源；所述发酵培养基的无机盐包括钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、硼化物、溴化物及其混合物；所述发酵培养基的pH为4.5～8.0。
3.权利要求1所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809细胞的油脂重量为菌体细胞干重的40～55％，其中饱和脂肪酸甘油三酯占油脂重量百分含量的40～45wt.％，不饱和脂肪酸甘油三酯占油脂重量百分含量的45～55％，其中二十二碳六烯酸(DHA)甘油三酯占油脂重量百分含量的35～40％，二十二碳五烯酸(DPA)甘油三酯占油脂重量百分含量的10～12％。
4.权利要求1所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌体细胞中的DHA可用作儿童和妇女的多不饱和脂肪酸来源补充的保健品，也可作为食用油、乳制品和谷物制品等领域的食品添加剂和水产和畜牧养殖等领域的饲料添加剂。
5.权利要求1所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌体细胞中以棕榈酸酯为主的饱和脂肪酸甘油三酯，经过催化转酯化反应制得棕榈酸甲酯，可以作为矿物柴油的替代燃料使用。
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