CN104946691A - 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法 - Google Patents

利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104946691A
CN104946691A CN201510201809.5A CN201510201809A CN104946691A CN 104946691 A CN104946691 A CN 104946691A CN 201510201809 A CN201510201809 A CN 201510201809A CN 104946691 A CN104946691 A CN 104946691A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
vitamins
glucose
dha
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510201809.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王杰鹏
罗瑶
郗大兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JILIN XIMA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
JILIN XIMA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JILIN XIMA BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical JILIN XIMA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201510201809.5A priority Critical patent/CN104946691A/zh
Publication of CN104946691A publication Critical patent/CN104946691A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

利用本发明的方法进行DHA油脂的生产，生产菌株为专利菌株裂壶藻LX0809时，发酵96小时，生物量干重达到88g/L，总油脂产量达到52g/L，DHA占总油脂含量40.5%，DHA产量21.06g/L。发酵周期更短，总油脂和DHA产量更高，具有较强市场竞争优势。

Description

利用裂壶藻发酵生产含DHA油脂的方法
技术领域
本发明微生物发酵产油脂领域，特别涉及利用裂壶藻发酵生产DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，简称DHA)化学名称为二十二碳-4，7，10，13，16，19-六烯酸，属n-3系列长链多不饱和脂肪酸，是人体中的一种功能性脂肪酸。DHA大量存在于人脑细胞中，是大脑神经视觉细胞中重要的脂肪酸成分，占大脑脂肪酸的25-33％。在胎儿及婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位，对大脑活动、脂肪代谢、胎儿生长、婴幼儿智力发育及免疫功能都有极大的影响。同时，DHA还可以加速骨骼增长，防止骨质疏松，减少妇女产后神经衰弱及产后抑郁症的发生。提高机体免疫力，促进成年人外周血液单核细胞的增殖，阻止肿瘤细胞的异常增生。DHA在治疗心肌梗塞、动脉硬化、高血压等心血管疾病的临床试验和动物饲养研究中已先后被证明具有降低血脂总胆固醇、血液黏度、血小板凝聚力及增加HDL的生理功能，从而降低心血管疾病发生的概率。
国内外市场对DHA需求量巨大，其在孕妇、哺乳期妇女、婴儿和儿童食品和保健品中，可供开发多类产品。如，DHA可用做高纯度医药制品；可添加于奶粉、米粉、饮品(如牛奶、酸奶、果汁)、面包、饼干、面条、冰淇淋、糖果等食品与保健品中，从而达到增强大众身体健康和智力发展的目的。
1994年，联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)正式推荐在婴幼儿配方奶粉中添加DHA；2000年，美国著名的婴儿营养专家Birch教授证实ARA+DHA婴幼儿配方奶粉对婴幼儿智力发育具有显著促进作用；2001年，FDA在GRAS Notice No.000080批准了DHA在婴幼儿配方奶粉中应用。微藻油是唯一得到美国食品与药物管理局(FDA)认可的儿童DHA补充剂来源；2010年，中国卫生部《食品安全国家标准婴幼儿配方食品》中批准在婴幼儿奶粉中添加DHA，并要求添加DHA同时必须添加相同量的ARA；2011年，欧洲食品安全局宣布孕妇DHA日摄入大于200mg，婴儿DHA日摄入大于100mg，能促进婴幼儿视力发育。
长期以来，DHA主要来源于深海鱼油，但深海鱼油存在诸多不足：①鱼油资源有限，产量不稳定，远远不能满足市场需求。②鱼油质量随捕捞季节和地域变化，品质波动大。③鱼油中的DHA含量不高，仅占7-14％，且很难与大量的EPA和其它结构类似的高度不饱和脂肪酸分离。④纯化工艺复杂，生产成本高，产品得率低。在实际生产过程中，ω-3多不饱和脂肪酸被氢化饱和，降低了其在鱼油中含量，造成原料浪费，也损害了DHA和EPA的品质。⑤鱼油易于氧化，难以应用于食品添加剂行业。由于鱼油含有很重且难闻的鱼腥味，即使经过复杂的提纯工艺也难以去除，限制了这类DHA的应用范围。⑥基于DHA等ω-3多不饱和脂肪酸的市场需求不断增加，将会导致过量捕捞行为的出现，不利于环境资源的保护。因此，寻找DHA商业化生产的替代来源备受关注。
20世纪提出的“单细胞油脂”、“微藻油”是以微生物作为来源发酵得到的含多不饱和脂肪酸的油脂，已成为当前人们关注的热点。通过微生物发酵法制备DHA，与传统鱼油来源相比，具有微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，大于35％，甚至大于40％；不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；氧化稳定性较好等优点。因此，微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。能够代谢积累DHA的微生物有细菌、微藻、海洋真菌三大类。其中细菌的DHA生产能力差，条件苛刻，不适宜实际生产应用。大约有500种海洋微藻具有生产DHA的能力，已经证实的有88种，主要是较低级真菌中的藻状菌(硅藻类、甲藻类、隐藻类等)。
目前，发现产DHA的海洋真菌主要是一些较低级的藻状菌类，其中破囊壶菌(Traustochytrium)和裂壶藻(Schizochytrium)是研究最多，最有潜力成为DHA生产菌株的两种海洋真菌。裂壶藻是最早被用于工业化生产的海洋真菌。如中国专利申请CN 200910033869.5公开的技术方案中，在7吨发酵罐中，120小时生物量达到70.6g/L，总油脂31.5g/L，DHA占总油脂含量达到41.13％。虽然DHA含量较高，但是发酵周期太长，且总油脂含量及总DHA产量偏少，增加了染菌几率和单位DHA发酵成本，具有提升的空间。
影响裂壶藻发酵生产DHA的因素主要有：①高产DHA的优质菌种。②配套的DHA发酵生产工艺。发明人在已获得授权的专利《一种海洋真菌裂壶藻(Schizochytrium)LX0809及其工业应用》中报道了筛选得到了一株优良的生产菌株裂壶藻LX0809，其发酵96h细胞干重达到72.5g/L，DHA占总脂肪酸比例为37％，DHA产量15.3g/L。为了进一步提升裂壶藻产DHA的经济性，本发明将进一步提升利用发酵的综合指标。
从微观上来看，微生物体内DHA的合成过程可以分为2个阶段，第一阶段，从葡萄糖酵解开始，经三羧酸循环(TCA)和柠檬酸裂解途径生成乙酰CoA和NADPH；第二阶段是乙酰CoA和NADPH通过依赖氧的FAS途径或不依赖氧PKS途径合成DHA等长链多不饱和脂肪酸。Metz等人的研究结果证实Schizochytrium sp.的DHA合成途径与细菌的PKS途径类似。2006年，美国Market公司通过对Schizochytrium sp.研究表明其I型脂肪酸合成酶和长链多不饱和脂肪酸合成酶同时存在，DHA的合成只需长链多不饱和脂肪酸合成酶参与即可，I型脂肪酸合成酶主要用于短链饱和脂肪酸(C14:0和C16:0)的合成。Schizochytrium的PKS途径中存在一个和脂肪酸合酶相类似的多酶复合体-PKS合成酶，该酶是多亚基的复合酶，包括：β-酮酰合成酶(β-ketoacyl synthase,KS)、β-酮酰-ACP还原酶(β-ketoacyl-ACP reductase,KR)、烯脂酰-ACP还原酶(enoyl-ACP reducatase,ER)、脱水酶/异构酶(dehydrase/isomerase,D/I)、酰基转移酶(acyl carrier protein transacyla)和酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)。在PKS合成酶的作用下，以底物乙酰CoA和丙二酸单酰CoA作为基本的合成单位，经过缩合、还原、脱水、还原/异构的循环往复，最终合成DHA。
发明人认为，微生物发酵生产油脂的过程可以分为两个阶段：氮源未耗尽前的细胞增殖生长阶段和氮源耗尽后的油脂合成积累阶段。研究表明，细胞增殖阶段转向油脂合成积累阶段需要一个前提条件，即培养基中氮源耗尽而碳源充足。在此条件下，培养基中的碳源不再用于微生物胞内碳骨架的合成，而是转向油脂的积累。脂肪酸合成不仅需要细胞连续供应乙酰辅酶A用于脂肪酸碳链的延伸，还需要提供足够的NADPH用以补充还原力。一种生产菌株在给予充分营养和时间生长的情况下，其个体中总油脂含量占菌体自身重量的比例基本稳定，细胞个体繁殖的高密度，是获取高总油脂产量的基础。
总体上，DHA的发酵产量＝总油脂产量*DHA占总油脂的含量。想要获取高的DHA产量，一方面我们需要提高总油脂的产量，另一方面需要提高DHA占总油脂的含量。
发明人发现，一种生产菌株在给予充分营养和时间生长的情况下，其个体细胞中总油脂含量占菌体自身重量的比例基本稳定，但是由于培养工艺条件的区别会导致细胞内蛋白、油脂、维生素等组分含量发生变化。以油脂中脂肪酸组分为例，研究表明Schizochytrium sp.其依赖氧气供应的I型脂肪酸合成酶和不依赖氧气供应的长链多不饱和脂肪酸合成酶同时存在，且Schizochytrium sp.合成DHA只需不依赖氧气供应的长链多不饱和脂肪酸合成酶(PKS)参与即可，I型脂肪酸合成酶主要用于短链饱和脂肪酸(C14:0和C16:0)的合成。因此，当培养条件发生变化的时候，特别是改变溶氧指标的时候，短链饱和脂肪酸(C14:0和C16:0)和长链多不饱和脂肪酸(C22:5和C22:6等)组分在总油脂中的比例将会发生强烈的响应。而且，发酵液中的总油脂产量也与溶氧密切相关，过于限制溶氧会明显降低菌体的生长代谢水平，从而导致干重和总油脂产量减少。
发明人还发现，尽管可以优化总油脂产量和DHA占总油脂的含量得到最好的DHA发酵产量，但是大多数情况下同一DHA的发酵产量，可能会存在着多种总油脂产量和DHA占总油脂的含量的组合，其对应的生产成本也不相同。同时鉴于同一株菌的含油脂比例基本稳定，因此发酵液中的总油脂产量基本关联高生物量干重，高生物量干重指标是获取高DHA的发酵产量的重要条件。
综上所述，目前提高Schizochytrium sp.发酵合成DHA产量主要存在的两个矛盾：第一个为FAS和PKS路径合成产物比例此消彼长的矛盾，FAS路径合成产物短链饱和脂肪酸占总油脂比例越大，PKS合成路径产物DHA所占总油脂的比例就越小；第二个是DHA占总油脂含量和总油脂产量此消彼长的矛盾。由于DHA的发酵产量＝总油脂产量*DHA占总油脂的含量，所以能够处理好上述两个矛盾，使两个矛盾之间达到平衡，在获得目标DHA含量的同时获取最高DHA的发酵产量的方法和技术创新将可以指导实际的生产。
发明内容
本发明为了解决上述问题，发明人提供了相应的培养方法以及培养基。
在本发明中，菌株为裂壶藻，优选的菌株为裂壶藻(Schizochytrium sp.)LX0809，菌种保藏编号为CGMCC No.3535，该菌可代谢生产长链多不饱和脂肪酸。
冻存的原始菌种在PDA平板上进行活化培养，经活化的菌株接入摇瓶进行传代培养。传代后的菌液用于接种种子培养基。
在本发明中，采用一级或者多级扩培的方式进行菌种种子培养。
在一级扩培方案中，一级培养为种子培养，一级扩培的种子直接进行发酵培养。
在多级扩培方案中，发酵培养前的种子液采用多级培养的方式得到，如，经过三级培养获得扩培的种子液。在多级培养方案中，罐体大小的设计以及培养的级数根据最终产能的大小来决定。一般多级扩培的级数为2-4级培养。例如，在本发明中的一个方案中，选用1m3罐进行一级种子培养，10m3的罐进行二级种子培养，100m3的罐进行发酵培养。
在本发明中，首先将甘油管冻存的菌种采用涂布法将含菌菌液接种至固体PDA培养基进行培养，并挑取固体PDA上的单菌落置于传代培养基中进行摇瓶传代培养3至5代。传代后的菌液接种至种子培养基中进行培养即得到种子培养基接种液，用于接种一级种子培养液，一级种子培养基与二级种子培养基分别在1m3和10m3的罐中进行。
二级培养后的种子液接入发酵罐中，发酵罐中采用基于溶氧流加培养基的培养方案。
其中，固体PDA培养基配方为常规PDA配方。
固体PDA培养基配制方法用常规方法制备。
传代培养基配方组成为，葡萄糖，10.0-30.0g/L；酵母粉，1.0-10.0g/L；玉米浆1.0-20.0g/L；Na2SO4，5.0-12.0g/L；CaCl2.2H2O，1.0-2.0g/L；KCl，1.0-6.0g/L；KH2PO4，1.0-4.0g/L；MnCl20.5-1.0g/L，MgSO4.7H2O，2.0-3.0g/L；硼酸1-20mg/L；溴化钾，1-20mg/L；维生素B1，5-10mg/L；维生素B12，0.15-0.3mg/L，维生素B6，0.3-0.5mg/L。
传代培养基配制及其灭菌方法为：
葡萄糖单独灭菌，酵母粉与玉米浆分别灭菌，灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，经过0.22μm无菌过滤膜过滤，然后加入培养基中。
将传代培养基装在含有挡板的250ml摇瓶中，保证最终装液量为50ml，自然pH值。
种子培养基配方组成为，单位g/L：葡萄糖40.0-50.0；酵母膏1.0-5.0；蛋白胨，1.0-5.0；乙酸铵，1.0-5.0；谷氨酸钠1.0-10.0；KH2PO41-4；Na2SO4，5-12.0；MgSO4·7H2O2-3；KCl2-3；MgCl21-3；CaCl2·2H2O1-2；FeCl30.1；维生素B1，5-10mg/L；维生素B12，0.15-0.3mg/L，维生素B6，0.3-0.5mg/L。
葡萄糖单独灭菌，酵母粉与玉米浆分别灭菌，灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，经过0.22μm无菌过滤膜过滤，然后加入培养基中。
将培养基装在含有挡板的250ml摇瓶中，保证最终装液量为50ml，自然pH值。
发酵培养基初始配方组成为，单位g/L：
葡萄糖，10.0-30.0，发酵开始后，经过流加策略控制浓度；
酵母粉，1.0-10.0；玉米浆1.0-20.0；
Na2SO4，5；CaCl2.2H2O，1；KCl，1；KH2PO4，1.0；MnCl20.5，MgSO4.7H2O，2；硼酸1mg/L；溴化钾，1mg/L；
维生素B1，5mg/L；维生素B12，0.15mg/L，维生素B6，0.3mg/L。
灭菌方法以及配制方法：配置浓度为600g/L的葡萄糖溶液，于密封补料容器中单独灭菌；酵母粉、玉米浆于密封补料容器中单独灭菌；其他成分于发酵罐中配置完成后灭菌。灭菌条件为121℃、30min。培养基pH值用灭菌后酸和碱控制为5-7。选用的酸为有机酸，如柠檬酸；或者为稀盐酸与硫酸，选用的碱为氢氧化钠以及其他碱性物如氨水。
发酵培养方法：
菌体干物质浓度低于45g/L，溶氧在50％以上时，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度在20-40g/l范围；溶氧在50％以下时，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于20g/l。
菌体干物质浓度高于45g/L，溶氧在10％以上，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度不高于30g/l范围；溶氧在10％以下，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于10g/l。
其中，对于加快或减慢葡萄糖流加速率的理解应理解为，在当时已有糖流加速率的基础上进行葡萄糖流加速率的增减或减慢，例如，已有糖流加速率为20g/L.h，加快糖流加速率即把糖流加速率增加，例如为25g/L.h，但具体流加的速率根据最终葡萄糖浓度来限定。
其中，对于培养基中配方的含量组成可以理解为：在保证所述培养基种类的基础上，适当调整其浓度均可实现本发明。在实施例中，培养基配方的浓度调整是可以实现本发明的效果的，所以上述公开的配方均在本发明的权利要求范围之内。
具体实施方式
以下利用实施例进一步详细说明本发明，但不能认为是限定发明的范围。
实施例1本实施例说明菌种活化及传代培养的详细步骤
菌种：取用裂壶藻(Schizochytrium sp.)LX0809(该菌种保藏编号为CGMCCNo.3535)，该菌种为本申请发明人筛选获得。
培养基：
固体PDA培养基配方为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、自来水1000毫升、自然pH。
固体PDA培养基配制方法为：马铃薯洗净去皮,再称取200g切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加入20克琼脂，混匀。待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀后分装。121℃灭菌20分钟，冷却备用。
传代培养基配方为单位g/L：葡萄糖，30.0；酵母粉，1.0；玉米浆10；Na2SO4，5；CaCl2.2H2O，1；KCl，1；KH2PO4，1.0；MnCl20.5，MgSO4.7H2O，2；硼酸1mg/L；溴化钾，1mg/L；维生素B1，5mg/L；维生素B12，0.15mg/L，维生素B6，0.3mg/L。
传代培养基配制及其灭菌方法为：
葡萄糖单独灭菌，酵母粉与玉米浆分别灭菌。灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，经过0.22μm无菌过滤膜过滤，然后加入培养基中。活化培养基分装情况为，在250ml的带有挡板的摇瓶中装入50ml的活化培养基。
培养方法：
取PDA固体培养基制作的平板，用涂布法将原始菌种接种于固体平板上，在培养箱中于25℃条件下，培养至产生单菌落。
挑取单菌落，并接入传代培养基中，将摇瓶置于摇床中在25℃，200rpm条件下培养至菌液OD600值为5。取用第一代菌液1ml，接入下一代培养基中，至菌液OD600值为5；重复传代菌种3-5代，获得培养的菌液。
传代后的菌液优选直接接入进行扩培。
实施例2-3说明二级扩培发酵的方法
实施例2本实施例说明菌种二级扩培的详细步骤
一级种子培养基配方组成为，单位g/L：葡萄糖40.0；酵母膏1.0；蛋白胨，5.0；乙酸铵，1.0；谷氨酸钠10.0；KH2PO41；Na2SO4，5；MgSO4·7H2O2；KCl2；MgCl21；CaCl2·2H2O1；FeCl30.1；维生素B1，5mg/L；维生素B12，0.15mg/L，维生素B6，0.3mg/L。
二级种子培养基配方组成为，单位g/L：葡萄糖50.0；酵母膏5.0；蛋白胨，5.0；乙酸铵，5.0；谷氨酸钠10.0；KH2PO44；Na2SO4，12.0；MgSO4·7H2O3；KCl3；MgCl23；CaCl2·2H2O2；FeCl30.1；维生素B1，10mg/L；维生素B12，0.3mg/L，维生素B6，0.5mg/L。
两级种子培养基配制方法与灭菌方法，葡萄糖单独灭菌，酵母粉、蛋白胨、乙酸铵、谷氨酸钠分别灭菌，灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，经过0.22μm无菌过滤膜过滤，然后加入培养基中。
一级种子培养液培养方法，按照体积占比为种子液占一级种子培养基培养液体积的4％接入传代后的种子培养液。在25℃条件下培养12-24h左右，其中通风量为0.3-0.5vvm，搅拌转速为200-600转/min。一级种子培养液培养结束时，控制培养液的OD600值为15。
二级种子培养液按照体积占比为一级种子液占二级种子培养基培养液体积的8％接入一级种子培养液，在25℃条件下培养12-24h左右，其中通风量为0.1-0.4vvm，搅拌转速为200-600转/min。二级种子培养液培养结束时，控制培养液的OD600值为20。
二级种子培养液培养结束后，种子培养液待用。
实施例3本实施例说明菌种二级扩培发酵的详细步骤
发酵培养基初始配方组成为，单位g/L：葡萄糖，10.0-30.0，发酵开始后，经过流加策略控制浓度；酵母粉，10.0；玉米浆1.0；Na2SO4，12.0；CaCl2.2H2O，2；KCl，6；KH2PO4，4；MnCl21，MgSO4.7H2O，3；硼酸20mg/L；溴化钾，20mg/L；维生素B1，10mg/L；维生素B12，0.3mg/L，维生素B6，0.5mg/L。
培养基配制方法与灭菌方法，葡萄糖单独灭菌，酵母粉、蛋白胨、乙酸铵、谷氨酸钠分别灭菌，灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，加入培养基中。
发酵培养方法：按照体积占比为二级种子液占培养基培养液体积的10％接入实施例2培养所得的种子培养液。
在发酵过程中按照下述培养方式进行发酵：
菌体干物质浓度低于45g/L，溶氧在50％以上时，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度在20-40g/l范围；溶氧在50％以下时，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于20g/l。
菌体干物质浓度高于45g/L，溶氧在10％以上，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度不高于30g/l范围；溶氧在10％以下，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于10g/l。
培养基pH值用灭菌后酸和碱控制为5-7，选用的酸为稀硫酸，选用的碱为氢氧化钠。
发酵96小时后，提取生物油脂进行分析。
实施例4-5说明三级扩培发酵的方法
实施例4本实施例说明三级扩培的详细步骤
在三级扩培的方案中，采用实施例1所述的方法进行活化以及传代培养，采用实施例2所述的方法进行菌种的二级括大培养。二级扩大培养后的菌种待用，三级种子培养液按照体积占比为三级种子液占二级种子培养基培养液体积的10％接入二级种子培养液，在25℃条件下培养12-24h左右，其中通风量为0.05-0.2vvm，搅拌转速为200-400转/min。三级种子培养液培养结束时，控制培养液的OD600值为25。
实施例5本实施例说明菌种三级扩培发酵的详细步骤
发酵培养基初始配方组成为，单位g/L：葡萄糖，10.0-30.0，发酵开始后，经过流加策略控制浓度；酵母粉，10.0；玉米浆5.0；Na2SO4，12.0；CaCl2.2H2O，2；KCl，6；KH2PO4，4；MnCl21，MgSO4.7H2O，3；硼酸20mg/L；溴化钾，20mg/L；维生素B1，10mg/L；维生素B12，0.3mg/L，维生素B6，0.5mg/L。
培养基配制方法与灭菌方法，葡萄糖单独灭菌，酵母粉、蛋白胨、乙酸铵、谷氨酸钠分别灭菌，灭菌条件为121℃、30min，灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下配制为所述培养基配方浓度即可；维生素配制为溶液后，经过0.22μm无菌过滤膜过滤，然后加入培养基中。
发酵培养方法：按照体积占比为二级种子液占培养基培养液体积的10％接入实施例4培养所得的种子培养液。
在发酵过程中按照下述培养方式进行发酵：
菌体干物质浓度低于45g/L，溶氧在50％以上时，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度在20-40g/l范围；溶氧在50％以下时，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于20g/l。
菌体干物质浓度高于45g/L，溶氧在10％以上，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度不高于30g/l范围；溶氧在10％以下，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于10g/l。
培养基pH值用灭菌后酸和碱控制为5-7，选用的酸为稀硫酸，选用的碱为氢氧化钠。
发酵96小时后，提取生物油脂进行分析。
对比实施例1-3对比说明二级或者三级括陪发酵的实施效果
对比实施例1本实施例说明现有技术的实施步骤及效果
对比实施例1采用中国专利申请CN 200910033869.5公开的培养基与间歇式培养方式进行培养。
对比实施例2本实施例说明二级扩大培养的实施步骤及效果
对比实施例2采用实施例2所述的方法进行活化培养，活化后的菌株按照实施例2所述的方法进行扩大培养，扩大培养后的菌株进行发酵培养。在本实施例的发酵培养中，发酵培养基配方与发酵培养方式采用中国专利申请CN200910033869.5培养基与间歇式培养方式进行培养。
对比实施例3采用实施例2所述的方法进行活化培养，实施例4所述方法进行扩大培养，扩大培养后的菌株进行发酵培养。在本实施例的发酵培养中，发酵培养基配方与培养方式采用中国专利申请CN 200910033869.5培养基与间歇式培养方式进行培养。
发酵结束以后测定菌株的生物量干重。
对比实施例发酵结束后，进行油脂的检测与DHA的测定。
对比实施例4对比说明传代培养的实施例效果
对比实施例4采用实施例1所述的方法进行培养，与实施例1的区别在于不对菌体进行传代培养，培养出的菌体直接按照实施例3所述的方法进行种子与发酵培养。
优选实施例1-3说明该本发明的优选实施方案
优选实施例1本实施例说明传代培养的优选实施方案
在本优选实施方案中，采用与实施例1所述的方法进行活化与传代培养，与实施例1不同之处在于优选实施方案的培养基配方不同。
其中，优选的传代培养基为：
葡萄糖，10.0g/L；酵母粉，10.0g/L；玉米浆1.0g/L；Na2SO4，12.0g/L；CaCl2.2H2O，2.0g/L；KCl，6.0g/L；KH2PO4，4.0g/L；MnCl21.0g/L，MgSO4.7H2O，3.0g/L；硼酸20mg/L；溴化钾，20mg/L；维生素B1，10mg/L；维生素B12,0.3mg/L，维生素B6，0.5mg/L。
优选实施例2本实施例说明扩大培养的优选实施方案
本优选实施方案中，采用与实施例2所述的方法进行扩大培养，与实施例2不同之处在于优选实施方案与培养基配方不同。
其中，优选的扩大培养培养基为，单位g/L：
葡萄糖45；酵母膏3；蛋白胨，1.0；乙酸铵，3；谷氨酸钠1；KH2PO42；Na2SO4，10；MgSO4·7H2O2.5；KCl2.5；MgCl22；CaCl2·2H2O1.5；FeCl30.1；维生素B1，8mg/L；维生素B12，0.2mg/L，维生素B6，0.4mg/L。
优选实施例3本实施例说明发酵培养的优选实施方案
本优选实施方案中，采用与实施例3所述的方法进行扩大培养，与实施例3不同之处在于优选实施方案与培养基配方不同。
其中，优选的扩大培养培养基为：
葡萄糖，10.0-30.0，发酵开始后，经过流加策略控制浓度；
酵母粉，1.0；玉米浆20.0；Na2SO4，5；CaCl2.2H2O，1；KCl，1；KH2PO4，1.0；MnCl20.5，MgSO4.7H2O，2；硼酸1mg/L；溴化钾，1mg/L；维生素B1，5mg/L；维生素B12，0.15mg/L，维生素B6，0.3mg/L。
实施结果如表1所示：
表1 实施例结果表

Claims (10)

1.一种利用裂壶藻发酵生产含DHA油脂的方法，其特征在于，该方法步骤依次为：菌种活化培养，菌种传代培养，菌种扩大培养，菌种发酵培养，其中，菌种扩大培养方式为一级培养、二级扩大培养或者三级扩大培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种传代培养的传代次数为3-5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种传代培养的培养基组成至少包括：葡萄糖，10.0-30.0 g/L；酵母粉，1.0-10.0 g/L；玉米浆1.0-20.0 g/L； Na2SO4，5.0-12.0 g/L；CaCl2.2H2O，1.0-2.0 g/L；KCl，1.0-6.0 g/L；KH2PO4，1.0- 4.0 g/L；MnCl2 0.5- 1.0 g/L，MgSO4 .7H2O，2.0-3.0 g/L; 硼酸1-20 mg/L；溴化钾，1-20 mg/L；维生素B1，5-10  mg/L；维生素B12，0.15-0.3  mg/L，维生素B6，0.3-0.5  mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种扩大培养的培养方式包括为，一级培养、二级扩大培养或者三级扩大培养，其中，二级扩大培养或三级扩大培养中的每一级扩大培养培养方式不同。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种扩大培养的培养基组成至少包括：葡萄糖 40.0-50.0 g/L；酵母膏 1.0-5.0 g/L；蛋白胨 1.0-5.0 g/L；乙酸铵，1.0-5.0 g/L；谷氨酸钠 1.0-10.0 g/L；KH2PO4 1.0-4.0 g/L；Na2SO4，5.0-12.0 g/L；MgSO4·7H2O 2.0-3.0 g/L；KCl 2.0-3.0 g/L；MgCl2 1.0-3.0 g/L； CaCl2·2H2O 1.0-2.0 g/L； FeCl3 0.1-0.2 g/L；维生素B1，5-10 mg/L；维生素B12，0.15-0.3  mg/L，维生素B6，0.3-0.5 mg/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基组成至少包括：葡萄糖，10.0-30.0 g/L；酵母粉，1.0-10.0 g/L；玉米浆1.0-20.0 g/L；Na2SO4，5.0-12.0 g/L；CaCl2.2H2O，1.0-1.5 g/L；KCl，1.0-6.0 g/L；KH2PO4，1.0- 4.0 g/L；MnCl2 0.5- 1.0 g/L，MgSO4 .7H2O，2.0-3.0 g/L; 硼酸1-20 mg/L；溴化钾，1-20 mg/L；维生素B1，5-10  mg/L；维生素B12，0.15-0.3  mg/L，维生素B6，0.3-0.5 mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养补料方式为流加培养方式。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，菌体干物质浓度低于45 g/L，溶氧在50 %以上时，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度在20-40 g/l 范围；溶氧在50 %以下时，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于20 g/l。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，菌体干物质浓度高于45g/L，溶氧在10%以上，加快葡萄糖流加速度，保持葡萄糖浓度不高于30 g/l 范围；溶氧在10%以下，减慢葡萄糖流加速率，保持葡萄糖浓度不低于10 g/l。
10.上述任一权利所述的方法，其特征在于，所用菌种为裂壶藻（Schizochytrium sp.）LX0809，该菌种保藏编号为CGMCC No.3535。
CN201510201809.5A 2015-04-24 2015-04-24 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法 Pending CN104946691A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510201809.5A CN104946691A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510201809.5A CN104946691A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104946691A true CN104946691A (zh) 2015-09-30

Family

ID=54161754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510201809.5A Pending CN104946691A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104946691A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949580A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 武汉藻优生物科技有限公司 一种高dha含量的裂壶藻及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101519676A (zh) * 2009-04-03 2009-09-02 湖北福星生物科技有限公司 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN101575584A (zh) * 2009-06-18 2009-11-11 南京工业大学 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
CN101812484A (zh) * 2009-03-20 2010-08-25 厦门汇盛生物有限公司 高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法
CN101892160A (zh) * 2010-01-06 2010-11-24 吉林省希玛生物科技有限公司 一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101812484A (zh) * 2009-03-20 2010-08-25 厦门汇盛生物有限公司 高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法
CN101519676A (zh) * 2009-04-03 2009-09-02 湖北福星生物科技有限公司 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN101575584A (zh) * 2009-06-18 2009-11-11 南京工业大学 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
CN101892160A (zh) * 2010-01-06 2010-11-24 吉林省希玛生物科技有限公司 一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949580A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 武汉藻优生物科技有限公司 一种高dha含量的裂壶藻及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102888348B (zh) 一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法
CN101519676B (zh) 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN100491519C (zh) 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生
CN103146584B (zh) 一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产dha的方法
KR20220088912A (ko) 스키조키트리움 및 그 응용, Sn-2 DHA가 풍부한 미생물 유지 및 그것의 제조 방법과 응용
CN102864111B (zh) 一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株
CN104031843B (zh) 一种裂殖壶菌及其应用
CN105018539A (zh) 一种培养裂殖壶菌高产dha的方法
CN105331572B (zh) 一种发酵高产dha的方法
CN1986822A (zh) 用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法
CA2959860C (en) Semi-continuous culture methods
JP2017502680A (ja) 微細藻類バイオマスのタンパク質を富化するための方法
CN104860756A (zh) 一种蛹虫草发酵液体培养基及其制备方法与应用
US20210340582A1 (en) Mortierellaalpina strain and use thereof, microbial oil containing ara at sn-2 position and preparation and uses thereof
CN101979623B (zh) 外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法
CN110157748A (zh) 一种裂殖壶菌发酵产多不饱和脂肪酸的调控方法
CN106244468A (zh) 一种调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸的制备方法
CN101538592A (zh) 用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN106010970B (zh) 一种寇氏隐甲藻及其应用
CN104946691A (zh) 利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法
CN102373244B (zh) 一种花生四烯酸的微生物发酵方法
JP2017532022A (ja) 反復フェドバッチ培養方法
CN105331670B (zh) 裂壶藻与寇氏隐甲藻混合发酵的方法
CN103484385B (zh) 一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株及发酵方法和应用
CA2980679A1 (en) High density production of biomass and oil using crude glycerol

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150930