CN101979623B - 外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，将微生物接入发酵培养基中进行发酵合成二十二碳六烯酸，在进行发酵合成前向发酵培养基中加入外源添加因子，和/或在发酵合成中加入合成脂肪酸的前体物质；所述的微生物为破囊壶菌、裂殖壶菌和隐甲藻中的任意一种；所述的外源添加因子为乙酸、柠檬酸、和辛伐他汀中的任意一种或几种的组合；所述的合成脂肪酸的前体物质是乙酸。本发明通过简单有效的发酵调控，提高底物转化率，操作简单，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高目标产物合成浓度和生产强度，从而降低生产成本。且该方法不危害环境，不增加人力物力，并降低了成本，简单方便且具有经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的omega-3长链多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”，具有促进脑细胞生长发育、降血脂、降血糖、保护视力、抗癌及提高免疫能力等多种重要的生理功能，被誉为新一代功能保健因子，受到世人极大的关注。传统深海鱼油提取的DHA受鱼的品种、季节及地理位置的影响而不稳定，且胆固醇和其它不饱和脂肪酸含量高，导致DHA产量有限、分离纯化困难，成本较高等问题。随着鱼油原料来源日渐紧缺，难以实现DHA这种高附加值产品在食品和医药等行业中的广泛应用。微生物发酵法生产DHA可克服传统鱼油提取的不足，可用于大量生产DHA，不断满足人们的需求，具有广阔的应用前景，备受国内外学者关注。能够合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、隐甲藻(Crythecodinium cohnii)等。
合成脂肪酸的关键前体物质是乙酰-CoA。其含量的多少直接影响到多不饱和脂肪酸(如DHA、DPA)含量。由于另一条竞争途径---甲羟戊酸途径和脂肪酸合成途径共用相同的前体物质乙酰-CoA。因此通过添加前提物质和抑制甲羟戊酸途径，使更多的前体物质乙酰-CoA流向脂肪酸途径，从而有利于多不饱和脂肪酸的生物合成。
目前，关于对微生物发酵产DHA的研究，概括来说，国内已公开的相关专利主要集中在以下3个方面：
1、关于DHA生产菌株的诱变筛选方法，如中国海洋大学的《海洋真菌裂殖壶菌OUC88的工业应用》(200410075426.X)、南京工业大学的《一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用》(200910033493.8)等；
2、关于培养基的组成，如南京工业大学的《一种裂殖弧菌及利用其生产DHA油脂的方法》(200910033869.5)等；
3、关于油脂的提取精制，如南京工业大学的《一种从隐甲藻中提取并精制富含DHA脂肪酸的工艺》(200710025079.3)、内蒙古金达威药业有限公司等的《从双鞭甲藻发酵液中提取DHA不饱和脂肪酸的方法》(200910159368.1)等；
但是上述几种方法，虽然在某种程度上提高了DHA的合成能力，但是却没有从源头上提高微生物合成DHA的潜力，尤其是通过改善其代谢过程以促进微生物合成DHA，目前研究中还未有通过简单的添加外源物质了促进微生物合成DHA的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，该方法针对微生物生物合成脂肪酸过程与其竞争途径共用相同的前体物质，保证更多的前体物质流向脂肪酸合成，以提高对前体的利用率以及DHA的发酵水平，降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明的思路是：在生物体内(如裂殖壶菌、破囊壶菌和隐甲藻等)，长链多不饱和脂肪酸如DHA的合成是一个碳链延长和耗能的过程，需要关键前体物质乙酰-CoA，且乙酰-CoA是脂肪酸合成的起始物质。乙酰CoA的持续供应是保证微生物合成多不饱和脂肪酸必要前体。在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加因子如合成脂肪酸的前体物质和竞争途径关键酶的抑制剂；或者，在进行发酵后期为保证足够的前体物质流向脂肪酸合成，向培养基中添加合成脂肪酸的前提物质。
具体采用的技术方案如下：
外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，将微生物接入发酵培养基中进行发酵合成二十二碳六烯酸，在进行发酵合成前向发酵培养基中加入外源添加因子，和/或在发酵合成中加入合成脂肪酸的前体物质；其中，所述的微生物为破囊壶菌、裂殖壶菌和隐甲藻中的任意一种；所述的外源添加因子为乙酸、柠檬酸、和辛伐他汀中的任意一种或几种的组合；所述的合成脂肪酸的前体物质是乙酸。
其中，发酵前期外源添加因子乙酸的添加量为3～6mM。
其中，外源添加因子柠檬酸的添加量为2～8mM。
其中，外源添加因子辛伐他汀的添加量为0.5～4μM。
其中，合成脂肪酸的前体物质乙酸的添加量为3～9mM。
其中，优选的是，外源添加因子采用乙酸和柠檬酸组合的形式，乙酸的添加量为6mM，柠檬酸的添加量优选为2～4mM。
其中，优选的是，外源添加因子采用乙酸和辛伐他汀组合的形式，乙酸的添加量为6mM，辛伐他汀的添加量为1μM。
其中，优选的是，在发酵前期向培养基加入乙酸，添加量为6mM，并且在发酵后期，即发酵培养基中葡萄糖浓度降低至20～25g/L时，加入乙酸，添加量为6mM。
有益效果：本发明通过添加脂肪酸合成前体物质和竞争途径关键酶的抑制剂改善DHA生产菌株的代谢过程。实现代谢向DHA生物合成支路的定向调控，从而提高DHA的生物合成水平，提高DHA占总脂肪酸的百分含量。这种方法的益处在于提高底物的转化率，显著提高DHA浓度和强度；且本发明操作简单，不需要额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高底物的转化率和目标产物DHA的浓度，从而降低生产成本。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中所用的菌种为：
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)HX-308，CCTCC No：M 209059；
破囊壶菌(thraustochytrium sp.)ATCC No：26185；
隐甲藻(C.cohnni)：ATCC 30556。
裂殖壶菌和破囊壶菌种子培养基：D-葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、CaCl2·2H2O 1g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、FeCl3 0.1g/L。(参考《一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法》，申请号200910033869.5)。
裂殖壶菌和破囊壶菌发酵培养基：D-葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、(NH4)2SO4 6g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、FeCl3 0.1g/L。(参考《一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法》，申请号200910033869.5)。
隐甲藻种子和发酵培养基：D-葡萄糖25g/L、酵母膏4g/L，NaCl 16g/L，MgSO4·7H2O10g/L，KH2PO4 11g/L，KNO35g/L，(NH4)2SO4 12g/L，VH 6mg/L，VB121μg/L。(参见《利用Crypthecodinium cohnii高密度发酵生产DHA的流加策略研究》，食品与发酵工业，2007 Vol.33 No.1.PP：25-27).
以下实施例所用的发酵培养方法如下：
种子培养三代，前两代种子在250mL三角瓶中进行，装液量为50mL，第三代种子在500mL进行，装液量为100mL，每代都按5％(v/v)的接种量，将第三代种子按9％(v/v)的接种量接入装液量为100mL发酵培养基的三角瓶中(500mL)；在25℃、150r条件下培养。
实施例1：
在发酵前，分别向裂殖壶菌和破囊壶菌的发酵培养基中添加一定量的乙酸。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。
实验结果如表1和2所示：
表1外源乙酸对裂殖壶菌发酵的影响
表2外源乙酸对破囊壶菌发酵的影响
乙酸是乙酰-CoA的直接来源，乙酰-CoA的多少直接关系到脂肪酸合成能力。由表1和2可知，各个参数随着乙酸浓度的升高，都呈现先升高后减低的趋势。在乙酸浓度为3mM～6mM时，有利于DHA的生物合成。尤其是在乙酸浓度为6mM时，DHA产量，DHA占细胞细胞干重含量和DHA占总脂肪酸百分含量最高。
实施例2：
考虑到随着葡萄糖的消耗，脂肪酸合成前体物质也随之降低，为了进一步提高DHA的产量，因此在发酵初始不添加乙酸或者添加了最优浓度的前提物质乙酸下，在发酵后期，主要是指葡萄糖浓度为20～25g/L时向发酵液中添加乙酸，利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。结果如下表3、4所示：
表3发酵后期前体物质乙酸对裂殖壶菌发酵的影响
表4前体物质乙酸对裂殖壶菌发酵的影响
注：a表示在发酵前加入；b表示发酵后期加入
在发酵前期不加前体物质的情况下，在后期添加乙酸，如表3，结果发现当添加乙酸浓度为3～9mM时，有利于DHA的合成。考虑到实施1中，发酵前乙酸浓度为6mM时，或仅仅在发酵后期添加乙酸浓度为6mM时，DHA产量和占总脂肪酸及总干重的百分含量都最高，在此基础上，本次实施例在发酵前期和后期同时添加6mM乙酸，DHA产量及占总脂肪酸百分含量都有所提高，尤其是DHA占总脂肪酸百分含量显著提高(如表4所示)。
实施例3：
在发酵前，分别向裂殖壶菌和隐甲藻的发酵培养基中添加一定量的辛伐他汀。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。结果如表5、6所示。
表5外源辛伐他汀对裂殖壶菌发酵影响
表6外源辛伐他汀对隐甲藻发酵的影响
乙酰-CoA是甲羟戊酸途径和脂肪酸合成途径共有前体物质，辛伐他汀是甲羟戊酸途径关键酶HMG-COA还原酶的抑制剂，当添加适量的辛伐他汀，甲羟戊酸途径受到抑制从而使更多的乙酰-CoA流向脂肪酸的合成，进而更有利于DHA的合成。由表5和6所示，0.5～4μM的辛伐他汀有利于DHA的生物合成，当辛伐他汀浓度为1μM时，DHA产量分别最高。
实施例4：
考虑到更多的前体物质乙酰-CoA流向脂肪酸的合成，因此发酵前向培养基中添加最优的乙酸和辛伐他汀浓度。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。结果如表7所示。
表7外源乙酸和辛伐他汀对裂殖壶菌发酵的影响
注：c表示添加乙酸；d表示添加辛伐他汀
由表7可知，同时添加6mM的乙酸和1μM的辛伐他汀，DHA产量和DHA占细胞干重含量相对不添加二者或者仅仅添加二者之一，都有所提高，但是DHA占总脂肪酸百分含量相对于脂添加1μM的辛伐他汀有所减低。
实施例5：
在发酵前，分别向裂殖壶菌的发酵培养基中添加一定量的柠檬酸。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。结果如表7所示。
表8外源柠檬酸对裂殖壶菌发酵的影响
乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸合成的关键限速酶，柠檬酸是乙酰-CoA羧化酶激活剂，也是甲羟戊酸5-焦磷酸脱梭酶的抑制剂。该酶是甲羟戊酸途径中的重要酶。适量的柠檬酸的添加不仅能够抑制甲羟戊酸途径，使更多的乙酰-CoA流向脂肪酸合成，还能够提高乙酰-CoA羧化酶的活性，提高发酵周期。由表7可知，柠檬酸浓度为2～8mM有利于DHA的生物合成。当浓度为2mM时，DHA产量和DHA占细胞干重最高，当浓度为4mM时，DHA占总脂肪酸百分含量最高。
实施例6：
考虑到更多的前体物质乙酰-CoA流向脂肪酸的合成，因此发酵前向培养基中添加最优的乙酸和较优的柠檬酸浓度。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中残留葡萄糖浓度为0g/L停止发酵。结果如表9所示。
表9外源乙酸和柠檬酸对裂殖壶菌发酵的影响
注：c表示添加乙酸；e表示添加柠檬酸
由表9可知，当添加6mM的乙酸和2mM的柠檬酸，DHA含量相对于两者都不添加和仅添加其中一种都有所提高。但DHA占总脂肪酸百分含量仅比二者都不添加时高，当添加6mM的乙酸和4mM柠檬酸时，DHA占总脂肪酸百分含量相对于仅添加4mM的柠檬酸有所减低，但相对于其它的都提高。
Claims (2)
1.外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，将微生物接入发酵培养基中进行发酵合成二十二碳六烯酸，其特征在于在进行发酵合成前向发酵培养基中加入外源添加因子；其中，所述的微生物为破囊壶菌、裂殖壶菌和隐甲藻中的任意一种；所述的外源添加因子为辛伐他汀。
2.根据权利要求1所述的外源添加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其特征在于外源添加因子辛伐他汀的添加量为0.5～4μM。
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