CN103937843A

CN103937843A - 一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产dha的方法

Info

Publication number: CN103937843A
Application number: CN201410119673.9A
Authority: CN
Inventors: 常明; 李婧; 刘睿杰; 王兴国; 金青哲; 黄健花; 邹孝强; 王小三; 刘元法
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明公开了一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，其包括，利用种子培养基培养裂殖壶菌种子液的步骤；将裂殖壶菌接种到葡萄糖单一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的发酵培养基中的步骤；以及，当所述发酵培养基内的葡萄糖剩余量为原葡萄糖总量的1%～5%时，补加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步骤。本发明所示的葡萄糖和甘油混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法具有的有益效果是：既吸收了葡萄糖单一碳源发酵时菌体生长速度快、总脂含量高的优点，又具有甘油单一碳源发酵时DHA含量高的特征；提高了底物利用率，提高了DHA发酵水平，同时保证了较高的藻油品质，十分有利于促进裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化发展。

Description

一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸（22:6n-3）（DHA）是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3polyunsaturated fatty acids），具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效。深海鱼油是ω-3多不饱和脂肪酸的传统主要来源，但是存在着诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高等，鱼油中含有的EPA和胆固醇也使其不适于添加入孕婴食品中。相反，微生物油脂（single cell oils，SCO）不但容易实现大规模生产，同时还克服了传统鱼油普遍存在受地域和气候条件制约的问题，应用前景广阔。

裂殖壶菌（Schizochytrium）属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，是目前工业化生产DHA的理想物种之一。裂殖壶菌胞内可积累大量脂肪，且70%以甘油三酯形式存在，其中DHA可以占到总脂肪酸的35～45%。同时，裂殖壶菌油脂还含有许多生理活性物质，如色素（β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素等）、角鲨烯和甾醇等。Schizochytrium藻油的安全性已得到美国FDA认可，2012年3月我国卫生部出台了《食品营养强化剂使用标准》GB14880—2012，批准Schizochytrium藻油DHA可用于婴幼儿配方食品。

裂殖壶菌属于异养型微生物，葡萄糖、果糖和甘油是裂殖壶菌发酵生产DHA的良好碳源，其中葡萄糖为最适碳源。传统工业化生产藻油DHA主要应用葡萄糖，但是生产1吨DHA油脂大约需要消耗5吨葡萄糖，这种转化是低效率的，加之生产过程中需输入大量能量，设备投资与维护费用不菲，使得当前藻油DHA的生产成本非常高。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，提高藻油DHA的发酵水平和底物利用率，从而降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，包括，利用种子培养基培养裂殖壶菌种子液的步骤；将裂殖壶菌接种到葡萄糖单一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的发酵培养基中的步骤；以及，当所述发酵培养基内的葡萄糖剩余量为原葡萄糖总量的1%～5%时，补加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步骤。

作为本发明所述利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法的一种优选方案，其中：所述种子培养基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、VB₁、VB₆、VB₁₂。

作为本发明所述利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、VB₁、VB₆、VB₁₂。

作为本发明所述利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法的一种优选方案，其中：所述利用种子培养基培养裂殖壶菌种子液的步骤是将裂殖壶菌以5-10%的接种量接入种子培养基中，培养温度为20-30℃，pH值为4-8，转速为180-220rpm，振荡培养时间为4-6天。

本发明所示的葡萄糖和甘油混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法具有的有益效果是：既吸收了葡萄糖单一碳源发酵时菌体生长速度快、总脂含量高的优点，又具有甘油单一碳源发酵时DHA含量高的特征；提高了底物利用率，提高了DHA发酵水平，同时保证了较高的藻油品质，十分有利于促进裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化发展。

附图说明

图1是本发明中葡萄糖或甘油单一碳源发酵时裂殖壶菌生长情况示意图；

图2是本发明中葡萄糖或甘油单一碳源发酵时裂殖壶菌总脂积累情况示意图；

图3是本发明中葡萄糖或甘油单一碳源发酵时裂殖壶菌DHA含量变化示意图；

图4是本发明中葡萄糖或甘油单一碳源发酵时碳源消耗曲线示意图；

图5是本发明中实施例F组DHA含量变化情况示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：利用葡萄糖或甘油单一碳源发酵生产DHA

裂殖壶菌种子培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸钠5g/L、Na₂SO₄15g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O3g/L、K₂SO₄1g/L、VB₁0.005g/L、VB₆0.002g/L、VB₁₂0.005g/L。

裂殖壶菌发酵培养基：葡萄糖（或甘油）100g/L、酵母膏10g/L、谷氨酸钠15g/L、Na₂SO₄15g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O3g/L、K₂SO₄1g/L、VB₁0.008g/L、VB₆0.002g/L、VB₁₂0.008g/L。

种子培养两代，每代在装液量50mL/250mL三角瓶中进行，接种量8%（V/V），25℃、200rpm下摇床培养48h。第二代种子按8%（V/V）的接种量接入装液量50mL/250mL三角瓶中，发酵条件为25℃、200rpm。

实验结果如图1、图2、图3和图4所示：

结果表明：

100g/L葡萄糖单一碳源发酵，4天达最大生物量39.27g/L，总脂占干重66.58%，DHA占总脂肪酸41.23%，DHA产量10.78g/L；100g/L甘油单一碳源发酵，6天达最大生物量36.34g/L，总脂占干重62.40%，DHA占总脂肪酸47.37%，DHA产量10.74g/L。

葡萄糖为碳源菌体生长速度快、总脂含量高；甘油有助于DHA的积累，获得藻油品质较好。

实施例2：葡萄糖和甘油混合碳源进料发酵生产DHA

裂殖壶菌种子培养基如实施例1所述。

裂殖壶菌发酵培养基中，碳源为50g/L葡萄糖和50g/L甘油，其余组成如实施例1所述。

裂殖壶菌培养方法如实施例1所述。

结果表明：以1:1混合碳源一次进料，发酵时间为5天，生物量可达42.12g/L，即底物利用率有所提高，总脂占干菌含量61.84%，DHA占总脂肪酸45.67%，所得DHA产量为11.90g/L，比单一碳源发酵增加了约10%。

实施例3：葡萄糖进料甘油补料发酵生产DHA

裂殖壶菌种子培养基如实施例1所述。

裂殖壶菌发酵培养基中，除碳源外其余组成如实施例1所述。

裂殖壶菌培养方法如实施例1所述。

本实施例进行4组发酵实验，前两者是在残糖量在50%～70%时补加甘油，后两者是在葡萄糖残糖量在1%～5%时补加甘油：

实验序号A以50g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在50%时，补加50g/L甘油。

实验序号B以75g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在70%时，补加25g/L甘油。

实验序号C以25g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在1～5%时，补加75g/L甘油。

实验序号D以75g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在1～5%时，补加25g/L甘油。

实验结果如表1所示：

表1葡萄糖进料甘油补料发酵参数

结果表明：本实施例中的补料方式均提高了底物利用率，生物量比葡萄糖、甘油单一碳源发酵分别提高了2g/L和5g/L；发酵时长介于葡萄糖和甘油单一碳源发酵之间，除实验组B外DHA产量有不同程度的提升。DHA占总脂肪含量高于葡萄糖单一碳源发酵，与甘油发酵持平。

实施例4：葡萄糖和甘油混合碳源补料发酵生产DHA

裂殖壶菌种子培养基如实施例1所述。

裂殖壶菌发酵培养基中，除碳源外其余组成如实施例1所述。

裂殖壶菌培养方法如实施例1所述。

本实施例进行4组发酵实验，基本思路是菌体生长阶段主要消耗葡萄糖，氮源基本耗尽时开始添加少量甘油来调整代谢，发酵后期主要以甘油为碳源合成脂质：

实验序号E以30g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在1～5%时，补料45g/L葡萄糖和5g/L甘油，之后，当残糖量在15%时，补料20g/L甘油。

实验序号F以30g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在10%时，补料40g/L葡萄糖和10g/L甘油，之后，当残糖量在10%时，补料20g/L甘油。

实验序号G以30g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在1～5%时，补料45g/L葡萄糖和5g/L甘油，之后，当残糖量在5%时，补料5g/L葡萄糖和15g/L甘油。

实验序号H以30g/L葡萄糖为初始碳源，当残糖量在15%时，补料40g/L葡萄糖和10g/L甘油，之后，当残糖量在15%时，补料5g/L葡萄糖和15g/L甘油。

实验结果如表2所示：

表2葡萄糖和甘油混合碳源补料发酵参数

结果表明：本实施例中，经过5天发酵，生物量达到40g/L以上，与葡萄糖和甘油单一碳源相比提高了底物利用率；E与F补料措施下总脂含量达63%以上。F实验组DHA含量和产量最高（48.51%，12.93g/L），其中DHA产量比葡萄糖和甘油单一碳源发酵增加了19.94%和20.39%。这种混合碳源补料方式，与葡萄糖单一碳源相比，DHA占总脂肪酸比例由41.23%显著升高至48.51%，即藻油品质更佳；与甘油单一碳源发酵相比，DHA生产强度由1.79g/L/d显著提升至2.59g/L/d。

由此可见，本发明方法中，以葡萄糖单一碳源进料时，补加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的策略可以在发酵期间一次或多次实施；以葡萄糖和甘油混合碳源进料时，补加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的策略可以不实施或在发酵期间一次或多次实施。实验发现，以葡萄糖或甘油作为单一碳源发酵时，各自具有不同的优势：葡萄糖生长速度快，总脂含量高，适合用于发酵前期菌体扩增；甘油虽然生长周期长，但是DHA含量高，藻油品质好，适合发酵后期提高DHA积累。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于：包括，

利用种子培养基培养裂殖壶菌种子液的步骤；

将裂殖壶菌接种到葡萄糖单一碳源或葡萄糖和甘油混合碳源的发酵培养基中的步骤；以及，

当所述发酵培养基内的葡萄糖剩余量为原葡萄糖总量的1%～5%时，补加甘油或葡萄糖和甘油混合碳源的步骤。

2.根据权利要求1所述的利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于：所述种子培养基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、VB₁、VB₆、VB₁₂。

3.根据权利要求1所述的利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于：所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、VB₁、VB₆、VB₁₂。

4.根据权利要求1所述的利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于：所述利用种子培养基培养裂殖壶菌种子液的步骤是将裂殖壶菌以5-10%的接种量接入种子培养基中，培养温度为20-30℃，pH值为4-8，转速为180-220rpm，振荡培养时间为4-6天。