CN113832037A - 一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基及制备方法 - Google Patents

一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基及制备方法，按照质量比每1000g过滤海水中加入葡萄糖3～5％、细菌蛋白胨0.1～0.2％、酵母提取物0.08～0.12％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、甘油1.5～2.5％。本发明中的培养基配方通过提高培养基中的葡萄糖含量及添加甘油的方式来增加培养基中的碳源，确保菌种在发酵过程中养分充足。相比原有培养基，本发明中培养基的葡萄糖含量由20g/L提升至40g/L，甘油由0g/L提升至20g/L。

Description

一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基及制备方法
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，尤其是一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基及制备方法。
背景技术
现有技术中，菌种发酵的最优培养基配方探索是发酵工艺优化中必不可少的一部分。符合菌种生长周期规律和营养需求的培养基能够更为高效、经济的大规模获得目的菌种。目前实验室及发酵中所使用的培养基配方大多基于先期的实验室经验，没有针对后期诱变后的裂殖壶菌工程菌株的生长周期和营养需求进行更加细致的培养基配方优化。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明创造的实施例提供一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基，按照质量比每1000ml过滤海水中加入葡萄糖3～5％、细菌蛋白胨0.1～0.2％、酵母提取物0.08～0.12％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、甘油1.5～2.5％。
优选地，按照质量比每1000ml过滤海水中加入葡萄糖4％、细菌蛋白胨0.15％、酵母提取物0.1％、磷酸二氢钾0.025％、甘油2％。
具体地，海水盐度30～33，pH为8.0。
一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基的制备方法，包括：
将海水经抽滤去除杂质后通过0.22um滤膜过滤并按照质量比每1000g过滤海水中加入葡萄糖3～5％、细菌蛋白胨0.1～0.2％、酵母提取物0.08～0.12％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、甘油1.5～2.5％。
进一步地，还包括：
将配置好的液体培养基在高压灭菌锅中灭菌20～40min，温度设置为110～130摄氏度的条件下高压灭菌。
进一步地，还包括：
在超净操作台中无菌环境滴定调节pH至7.1。
进一步地，还包括：
将平板转接入装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，置于摇床培养箱中培养，作为接种液。
进一步地，还包括：
培养条件为温度20～25℃，转速150～200rpm。
进一步地，还包括：
在摇床中培养60h后，以5％(v/v)的接种比例转接至100ml新鲜的培养基中，并在温度20～25℃，转速150～200rpm的条件下培养。
进一步地，还包括：
培养条件为温度23℃，转速180rpm。
本发明实施例中的培养基配方通过提高培养基中的葡萄糖含量及添加甘油的方式来增加培养基中的碳源，确保菌种在发酵过程中养分充足。相比原有培养基，本发明中培养基的葡萄糖含量由20g/L提升至40g/L，甘油由0g/L提升至20g/L。本发明基于破囊壶菌生长性质，探索并改进了原有培养基配方，调整了原培养基中碳源的种类和比例，并通过梯度法选择到了最适合的碳源比例。在相同培养条件和时间下，本发明中的配方配制的培养基所培养的菌液所含生物量较原有配方最高提升了34.28％，菌液生物量绝对值提升了1.81g/L(52h，Group4/Group1)，大幅提升了发酵得到破囊壶菌的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的裂殖壶菌菌体干重(生物量)与OD660nm曲线示意图；
图2为本发明实施例提供的不同碳源配比培养基的破囊壶菌生长曲线示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1、本发明实施例提供的培养基配方
表1.培养基配方
Figure BDA0003267712530000031
本发明中的培养基配方通过提高培养基中的葡萄糖含量及添加甘油的方式来增加培养基中的碳源，确保菌种在发酵过程中养分充足。相比原有培养基，本发明中培养基的葡萄糖含量由20g/L提升至40g/L，甘油由0g/L提升至20g/L。
2.培养基制备及接种操作流程
裂殖壶菌是一种海洋微生物，培养裂殖壶菌需要使用海水培养基。培养基使用的海水是从深圳大鹏半岛运输而来，海水盐度30-33，pH为8.0。经过抽滤去除杂质后通过0.22um滤膜过滤，并按照一定的比例添加葡萄糖、甘油、细菌蛋白胨、酵母提取物、KH2PO4制成。将配置好的液体培养基在高压灭菌锅中灭菌30min，温度设置为121摄氏度。高压灭菌后在超净操作台中无菌环境滴定调节pH至7.1。将平板转接入装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，置于摇床培养箱中培养，作为接种液。培养条件为温度23℃,转速180rpm。在摇床中培养60h后，以5％(v/v)的接种比例转接至100ml新鲜的培养基中(250ml三角瓶)，培养条件同上。
3、实验步骤
1)、裂殖壶菌菌体干重(生物量)与OD660nm曲线绘制
将裂殖壶菌接种液以5％(v/v)的接种比例转接至装有100ml M4液体培养基的250ml三角瓶中，培养36小时后，把菌液按梯度稀释成5个浓度，分别取1ml菌液，用台式钙流工作站于吸光度660nm处测定其在660nm处的吸光值，再取相应浓度的菌液10ml于已称重的50ml离心管中，在离心机中调节10000rpm离心5min，去除上清液收集菌体，用去离子水重悬洗涤沉淀，以上步骤重复三次，将收集好的菌体沉淀放置于80℃烘箱中烘烤至重量不再变化，最后将含有干燥菌体和50ml离心管的总重量减去离心管自身的重量，即可得到菌体干重(g/L)。以OD660nm值为横坐标，菌体干重为纵坐标，建立裂殖壶藻菌体干重和OD 660nm值之间的线性关系，即可以通过测量菌液的OD值来代入线性回归方程的计算出相应的菌体干重。结果如图1。实验拟合的线性回归方程为：y＝4.0199x-1.0995，R2＝0.9892。
2)、不同碳源配比培养基对破囊壶菌生长曲线及生物量的影响
生长曲线(growth curve)可以直观反映藻类的生长状态。通过实时监测在藻类的培养中，各个时间段的藻浓度，并由此产生出藻类在某个时间段的最快生长速度、最佳培养时间以及最大浓度，为以后的大规模培养裂殖壶藻提供实验理论支撑。
根据实验需要及碳源比例不同将培养基分为6组，其中原培养基作为对照组(Group1)，其余为实验组(Group2-6)，探索最适宜破囊壶菌生物量积累的培养基配方。不同组别培养基配方见表1
表1.不同碳源培养基配方
Figure BDA0003267712530000051
3)、不同碳源配比培养基对破囊壶菌生长曲线的影响结果
从图2裂殖壶菌的生长曲线可以看到，裂殖壶菌在60h培养过程中，菌液浓度曲线总体呈现一个S型曲线，分为迟缓期、对数增长期、稳定期。仔细观察可知裂殖壶藻菌液在培养前期0-12小时约为迟缓期，培养中期12-48小时约为对数期，培养后期48-60小时为稳定期。
在最开始培养的时候，裂殖壶菌菌液的吸光值为0.1左右，此时菌体暂未开始增殖，液体培养基内营养成分未被利用；随后菌液吸光值逐渐增加，培养基内的营养成分及氧气并非限制因素，菌液吸光值呈指数上涨，到培养时间为32h附近时吸光值为1.20左右，此时曲线斜率最大，菌体繁殖速率达到最快；在48h后的时间段内，培养基营养成分减少，养分及氧气成为限制因素，菌体吸光值上升速率逐渐下降，最终稳定，说明在一定的限制条件下，菌体繁殖速率逐渐降低，最终不再增长。
将32-48h的OD660nm数值带入裂殖壶菌菌体干重(生物量)与OD660nm曲线，得到不同配方培养基发酵得到的菌体干重。结果见表2.表2.不同碳源配比培养基的破囊壶菌生物量
Figure BDA0003267712530000061
通过对原有培养基的分析，结合破囊壶菌实验室生长条件下的生长性质及生长情况的总结，本发明创新性的摸索了更加适合破囊壶菌实验室发酵的培养基成份。根据梯度设置不同碳源比例和含量条件，确定了一种能够大幅提升破囊壶菌发酵所产生的菌液生物量的培养基配方。其中，裂殖壶菌富含多不饱和脂肪酸，能够在异养条件下培养，并且已经获得了美国食品药品监督管理局安全认证，是一种安全的食品添加剂。而其中富含的DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)、EPA(Eicosapentaenoic Acid,二十碳五烯酸)等多不饱和脂肪酸并且易于大规模商业化生产等优点，也使破囊壶菌逐渐替代鱼油、虾油成为水产养殖行业不饱和脂肪酸的重要来源。相较于鱼油虾油，破囊壶菌无异味，口感好，易于食用等诸多优点也使得以破囊壶菌为原材料的保健食品愈来愈能被人们接受。本发明中公开的破囊壶菌发酵培养基配方能够显著提高破囊壶菌的发酵产量，对更加高效、经济的大规模生产破囊壶菌及其副产品DHA、EPA有一定的指导意义。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高产不饱和脂肪酸的裂殖壶菌的培养基，其特征在于，按照质量比每1000ml过滤海水中加入葡萄糖3～5％、细菌蛋白胨0.1～0.2％、酵母提取物0.08～0.12％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、甘油1.5～2.5％。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，按照质量比每1000ml过滤海水中加入葡萄糖4％、细菌蛋白胨0.15％、酵母提取物0.1％、磷酸二氢钾0.025％、甘油2％。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，海水盐度30～33，pH为8.0。
4.一种制备如权利要求1～3任一项所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括：
将海水经抽滤去除杂质后通过0.22um滤膜过滤并按照质量比每1000g过滤海水中加入葡萄糖3～5％、细菌蛋白胨0.1～0.2％、酵母提取物0.08～0.12％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、甘油1.5～2.5％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括：
将配置好的液体培养基在高压灭菌锅中灭菌20～40min，温度设置为110～130摄氏度的条件下高压灭菌。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括：
在超净操作台中无菌环境滴定调节pH至7.1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括：
将平板转接入装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，置于摇床培养箱中培养，作为接种液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括：
培养条件为温度20～25℃，转速150～200rpm。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括：
在摇床中培养60h后，以5％(v/v)的接种比例转接至100ml新鲜的培养基中，并在温度20～25℃，转速150～200rpm的条件下培养。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括：
培养条件为温度23℃，转速180rpm。
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