CN114940947B - 一株产dha的裂壶藻gt-d1及其应用、富含dha油脂及其制备方法 - Google Patents

一株产dha的裂壶藻gt-d1及其应用、富含dha油脂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产DHA的裂壶藻GT‑D1及其应用、富含DHA油脂及其制备方法，其中，一株产DHA的裂壶藻GT‑D1(Schizochytrium limacinum)，保藏编号为CCTCC NO:M20211573，已于2021年12月15日在中国典型培养物保藏中心保藏。该裂壶藻GT‑D1在30℃下可以实现DHA的大量产生与富集，提高发酵了温度，降低了发酵过程的冷却成本。同时其发酵获得的油脂中DHA的比例达55％～62％，而油脂中DHA的含量提高意义很大，可以减少提纯的成本，具备生产高纯度DHA的优势。

Description

一株产DHA的裂壶藻GT-D1及其应用、富含DHA油脂及其制备 方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产DHA的裂壶藻GT-D1及其 应用、富含DHA油脂及其制备方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(22:6n-3,docosahexaenoic acid,DHA)是一种重要的 ω-3系列多不饱和脂肪酸(ω-3polyunsaturated fatty acids)，其既能够 促进婴幼儿智力和视力发育，又具有预防老年人心血管疾病、抗癌、抗炎、 增强免疫力等功效。
传统的提取多不饱和脂肪酸的方法是从深海鱼油获取，但随着环境污染 以及海洋渔业资源的逐渐匮乏，从深海鱼中提取不饱和脂肪酸显露出存诸多 问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高等，鱼油中含 有的EPA和胆固醇也使其不适于添加入孕婴食品中。
裂殖壶菌(Schizochytrium)是目前工业化生产DHA的理想菌种之一，其 属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，通过高密度发酵培养，其体内可积累大量 脂肪，且70％以甘油三酯形式存在，其中DHA可以占到总脂肪酸的45％～ 55％。如公告号为CN105018539B(公告日为2019年2月12日)的专利文 件公开了一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，具体将通过药瓶培养达到细胞 干重为18～22g/L裂殖壶菌种子液接种到种子罐，培养至转接水平后，再 接种到发酵罐中，采用前期高温22～33℃进行高密度培养，后期进行低温 18～22℃胁迫的方式进行诱导培养110～130小时，期间通过流加葡糖糖溶 液、氮源溶液和碱溶液维持发酵过程中葡萄糖、总氮含量保持一定浓度和pH在5.5～6.5区间。该方法得到的发酵液中细胞干重达到120～150g/L， DHA达到40～50g/L。
又如论文《高产DHA裂壶藻突变株的选育与发酵工艺研究》(发表时间 为2016年5月1日)提到的其裂壶藻ATCC20888的摇瓶产DHA的最佳发酵 条件为选择接种量为10.5％，温度为26.5℃，初始pH为6.5，在此培养条 件下，裂壶藻DHA产量平均达6.10g/L。
但上述用于生产DHA的裂壶藻(又称裂殖壶菌)的发酵工艺中，其发酵 产DHA温度普遍比较低(一般25℃左右)，这导致在发酵时需要大量的水 来冷却发酵液，产生较高的冷却成本，因此，有待进一步改进。
发明内容
为解决上述现有技术中生产DHA的裂壶藻(又称裂殖壶菌)的发酵工艺 中存在发酵温度较低的问题，本发明提供一种裂壶藻GT-D1，在30℃下可以 实现DHA的大量产生与富集，提高发酵了温度，降低了发酵过程的冷却成本。
本发明提供的裂壶藻GT-D1是从广东海岸潮间带积水样品中的分离筛选 得到的，并证明其在30℃下可以实现DHA的大量产生与富集；该菌株经分类 学研究和分子生物学研究鉴定为裂壶藻(Schizochytrium limacinum)，保藏编 号为：CCTCC NO:M20211573，已于2021年12月08日在中国典型培养物保藏 中心保藏，保藏地址位于中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供如上所述的裂壶藻GT-D1在生产DHA中的应用。
本发明还提供一种发酵生产富含DHA油脂的方法，利用如上所述的裂壶 藻GT-D1接种至发酵培养基中，经发酵培养制得富含DHA油脂。
优选地，所述裂壶藻GT-D1先接种于种子培养基中培养以获得种子液， 接着再将所述种子液转接于所述发酵培养基中进行发酵培养,发酵结束后通 过离心收集发酵液中的菌体，并从中提取粗油即得富含DHA的油脂。
在一实施例中，所述发酵培养的条件包括种子浓度为0.8～1.2cfu/mL、 温度为30～35℃、转速为100～300rpm、通气量为2～5vvm以及发酵时间 为90～100h。
在一实施例中，种子培养的条件包括温度为30～35℃、转速为100～300 rpm培养时间为20～30h。
在一实施例中，所述种子培养基的组成为碳源25～50g/L、氮源5～20 g/L、无机盐20～40g/L和维生素0.01～0.04g/L。
在一实施例中，所述发酵培养基的组成为碳源80～120g/L、氮源5～20 g/L、无机盐20～60g/L和维生素0.01～0.04g/L。
在一实施例中，所述碳源为葡萄糖、果葡糖浆、甘油、蔗糖、麦芽糖中 的一种或多种，所述氮源为谷氨酸钠、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、蛋白粉中 的一种或多种，所述无机盐为钙盐、磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐、铵盐中的 一种或多种，所述维生素为维生素B1、维生素B12、维生素B6中的一种或多 种。
在一实施例中，提取粗油的方法为对通过离心收集发酵液中的菌体进行 破壁、萃取即得到富含DHA的油脂。
本发明还提供一种富含DHA的油脂，由如上任意所述的利用裂壶藻GT-D1 发酵生产富含DHA油脂的方法制得。
在一实施例中，所述富含DHA的油脂中DHA含量为55％～62％，棕榈酸含 量为14％～25％，DPA含量为7％～17％。
基于上述，与现有技术相比，本发明提供的一株裂壶藻GT-D1,在30℃下 可以实现DHA的大量产生与富集，提高发酵了温度，降低了发酵过程的冷却 成本。
本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地 从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其 他有益效果可通过在说明书、权利要求书所记载的内容来实现和获得。
附图说明
图1为裂壶藻GT-D1在种子培养基上培养后的菌落状态；
图2为图1中的菌落的局部放大图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发 明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面 所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突 就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技 术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含 义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用 的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义 一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确 如此定义之外。
实施例1：裂壶藻GT-D1的分离
A、样品采集：
从广东海岸潮间采集到带积水混合样品
B、筛选过程：
(1)取无菌的0.22um滤膜过滤上述样品，将滤膜移至培养基1中，并 在30℃、200rpm的条件下培养5d后，将菌液在8000rpm的转速下离心10 min后再取上清液接种至培养基1，在30℃、200rpm的条件下培养5d后， 接着又将菌液在8000rpm的转速下离心10min后再取上清液接种至培养基1 培养，如此重复操作10次；
其中，培养基1(富集培养基)的配方组成：葡萄糖100g和酵母粉15g 溶于质量浓度为1.5％的海盐水溶液中。
(2)将步骤(1)最终得到的上清液稀释涂布于培养基2的表面，在30℃ 下培养至单菌落长出，然后挑选大的菌落接种至培养基3，同样的，在30℃、 200rpm下发酵培养5d；
其中，培养基2(固体筛选培养基)的配方组成：在上述培养基1配方的 基础上继续加入琼脂粉至其浓度为2g/100mL即得培养基2；
培养基3的配方为葡萄糖5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠1.5g/L的水溶 液。
(3)取步骤(2)得到的发酵液1.5mL加入2mL浓盐酸(质量分数为 38％)摇匀，然后在65℃恒温加热50min至菌体完全消化,取出冷却，加入 2mL正已烷，振荡充分摇匀，常温下在3000rpm的转速下离心1min，取有 机相，在0.05～0.06MPa，40℃下蒸干正已烷后所剩液体即为粗油。
按照GB 26400-2011食品安全国家标准检测DHA含量，按照AOAC996.06 的方法检测脂肪酸的组成及含量并挑选DHA含量高的菌株，划线纯化3次， 将其命名为裂壶藻GT-D1；
所述裂壶藻GT-D1的微生物学特征为：
裂壶藻GT-D1在种子培养基上30℃培养24h后，其菌落白色，呈边缘稍 不整齐的圆形，培养3天后，参照图1和图2，菌落直径为2.5～5mm；菌体 以裂殖方式进行增殖，细胞壁薄，球形，无色透明，内可见颗粒物，大小为7～ 13μm，对数生长期可见游动孢子。
裂壶藻GT-D1进行18s rDNA测序后部分序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：利用裂壶藻GT-D1的发酵生产DHA
A.发酵温度优化
将上述裂壶藻GT-D1在不同发酵温度下，摇瓶批次发酵实验，具体操作 为在250mL三角瓶中装入100mL发酵培养基，接种裂壶藻GT-D1(接种后种 子浓度1cfu/mL)，转速200rpm,在不同温度下发酵48h,，并提取其中的 粗油,测定DHA含量。
结果如表1所示，在30℃时发酵效果较好，DHA含量最高。
表1
26℃ 30℃ 34℃
葡萄糖消耗量(g/L) 7.68 9.82 9.50
细胞干重(g/L) 2.15 3.14 2.85
粗脂肪含量(g/L) 0.96 1.47 1.19
DHA含量(g/L) 0.55 0.88 0.53
B.裂壶藻GT-D1在发酵罐中发酵生产DHA
(1)种子培养：挑取裂壶藻GT-D1菌体接种于种子培养基中，在30℃、 200rpm的条件下培养24h；
(2)发酵培养：将步骤(1)制得的种子液接种于发酵培养基中，使其 发酵液中种子浓度0.8～1.2cfu/mL，并置于10L发酵罐中在30℃，200rpm, 通气量2vvm的条件下补料发酵96h。
(3)将步骤(2)制得的发酵液经10000rpm离心收集发酵液中的菌体， 并提取其中的粗油。
按照GB 26400-2011食品安全国家标准检测DHA含量，按照AOAC996.06 的方法检测脂肪酸的组成及含量，按照如下方法测试生物量：
将发酵液经10000rpm离心收集菌泥，将菌泥于60℃下真空干燥24h， 称重。
测试结果表明：其生物量为81～93g/L，粗油含量40～45g/L，DHA含 量22～26g/L，(即粗油中DHA含量比例高达55％～62％)；
脂肪酸的组成及含量如表2所示：
表2
序号 名称 含量
1 DHA 55％～62％
2 棕榈酸 14％-25％
3 DPA 7％～17％
4 亚麻酸 0.2％～2.4％
5 EPA 0.1％～1.2％
6 月桂酸 0～0.5％
该实施例的种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，氯化钠0.4g/L； 硫酸钠15g/L；谷氨酸钠5g/L；硫酸钾1g/L；七水硫酸镁3g/L；磷酸氢 二钾2g/L；磷酸二氢钾3g/L；氯化钙0.15g/L；维生素B10.004g/L； 维生素B6 0.003g/L；维生素B12 0.004g/L的水溶液；
发酵培养基为含葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸 钠15g/L，谷氨酸钠15g/L，硫酸钾1g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，氯化钙0.05g/L,维生素B10.008g/L，维生素B6 0.002g/L，维生素 B12 0.008g/L的水溶液。
本发明还提供如下对比例：
对比例1
根据论文《裂殖壶菌利用混合碳源发酵生产DHA的研究》(作者：李婧) 中提到的：裂殖壶菌A.limacinumSR21具有较佳的发酵效果，具体为在发酵 温度维持在25℃，采用100g/L葡萄糖经4天发酵可获得生物量39.27g/L， 总脂占干重含量66.58％，DHA占总脂肪酸含量41.23％，而采用100g/L甘油 经6天发酵最终可获得生物量36.34g/L，总脂和DHA含量分别为62.40％和47.37％。
对比例2
根据论文《高产DHA裂壶藻突变株的选育与发酵工艺研究》(作者：吕 小义)提到的：裂壶藻(Schizochytrium sp.ATCC20888)温度在18～26℃的 温度范围内，DHA产量随温度增加而不断增加，在26℃达到最大；当温度继 续升高，菌种生长受到抑制，导致产物积累减少，其最优发酵工艺为在初始 糖浓度为80g/L，藻种培养至第72h补糖2％一次，24h后再补糖2％一次， 其生物量、油脂产量和DHA产量可分别达到52.7g/L，23.54g/L，9.52g/L (见论文摘要)，计算可得DHA在油脂中含量为9.52/23.54＝40.44％。
对比例3
根据公告号CN110846232B，名称为《一株可高温发酵生产DHA的菌株及 其应用》的专利文件其说明书【0044】至【0046】段所公开的内容并计算可 知，其裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)ALE-HT在28℃、35℃下补料发酵后所 得油脂中DHA比例分别为：19.49/40.2＝48.48％；14.89/31.1＝47.88％。
结合实施例和对比例的发酵数据可以看出，本发明提供的裂壶藻GT-D1， 在30℃下发酵可以实现DHA的大量产生与富集，降低了发酵过程的冷却成本。 而且无论是生物量，粗油产量还是油脂中DHA的含量均相对上述对比例有较 明显的提升，特别是其发酵获得的油脂中DHA的比例达55％～62％，而油脂中 DHA的含量提高意义很大，可以减少提纯的成本，具备生产高纯度DHA的优势。
另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是， 本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必 同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员 应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求 的限制。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对 其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通 技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修 改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 深圳古他生物科技有限公司
<120> 一株产DHA的裂壶藻GT-D1及其应用、富含DHA油脂及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1708
<212> DNA
<213> 裂壶藻GT-D1(Schizochytrium limacinum)
<400> 1
tctcaaagat taaggcatgc atgtgtaagt ataagcgatt gtactgtgag actgcgaacg 60
gctcattata tcagttataa tttcttcggt agtttctttt atatggatac ctgcagtaat 120
tctggaaata atacatgctg taagagccct gtatggggct gcacttatta gattgaagcc 180
gattttattg gtgaatcatg ataattgagc agattgacta ttttagtcga tgaatcgttt 240
gagtttctgc cccatcagtt gtcgacggta gtgtattgga ctacggtgac tataacgggt 300
gacggagagt tagggctcga ctccggagag ggagcctgag agacggctac catatccaag 360
gatagcagca ggcgcgtaaa taacccactg tggactccac gaggtagtga cgagaaatat 420
cgatgcgaag cgtgtatgcg ttttgctatc ggaatgagag caatgtaaaa ccctcatcga 480
ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccagaagcat 540
atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt tctggcatgg gcgaccggtg 600
ctttccctga atggggattg attgtctgtg ttgccttggc catctttctc atgctatttt 660
ggtatgagat ctttcactgt aatcaaagca gagtgttcca agcaggtcgt atgaccggta 720
tgtttattat gggatgataa gataggactt gggtgctatt ttgttggttt gcacgcctga 780
gtaatggtta ataggaacag ttgggggtat tcgtatttag gagctagagg tgaaattctt 840
ggatttccga aagacgaact agagcgaagg catttaccaa gcatgttttc attaatcaag 900
aacgaaagtc tggggatcga agatgattag gtaccatcgt agtctagacc gtaaacgatg 960
ccgacttgcg attgttgggt gctttattct atgggcctca gcagcagcac atgagaaatc 1020
aaagtctttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg 1080
aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg aaaacttacc 1140
aggtccagac ataggtagga ttgacagatt gagagctctt tcatgattct atgggtggtg 1200
gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt taattccgtt aacgaacgag 1260
acctcggcct actaaatagt gcgtggtatg gcaacatagt acgtttttac ttcttagagg 1320
gacatgtccg gtttacgggc aggaagttcg aggcaataac aggtctgtga tgcccttaga 1380
tgttctgggc cgcacgcgcg ctacactgat cggttcatcg ggttttaatt ctgatttttg 1440
gaattgagtg cttggtcgga aggcctggct aatccttgga acgctcatcg tgctggggct 1500
agatttttgc aattattaat ctccaacgag gaattcctag taaacgcaag tcatcagctt 1560
gcattgaata cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gcacctaccg attgaacggt 1620
ccgatgaaac catgggatgt ttctgtttgg attcattttt ggacagaggc agaactcggg 1680
tgaatcttat tgtttagagg aaggtgaa 1708

Claims (10)

1.一株产DHA的裂壶藻GT-D1(Schizochytrium limacinum)，其特征在于：其保藏编号为CCTCC NO:M20211573。
2.一种根据权利要求1所述的产DHA的裂壶藻GT-D1在生产DHA中的应用。
3.一种发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：
利用权利要求1所述的产DHA的裂壶藻GT-D1接种至发酵培养基中，经发酵培养制得富含DHA油脂。
4.根据权利要求3所述的发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：所述裂壶藻GT-D1先接种于种子培养基中培养以获得种子液，接着再将所述种子液转接于所述发酵培养基中进行发酵培养,发酵结束后通过离心收集发酵液中的菌体，并从中提取粗油即得富含DHA的油脂。
5.根据权利要求3所述的发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件包括种子浓度为0.8～1.2cfu/mL、温度为30～35℃、转速为100～300rpm、通气量为2～5vvm以及发酵时间为90～100h。
6.根据权利要求4所述的发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：所述种子培养的条件包括温度为30～35℃、转速为100～300rpm培养时间为20～30h。
7.根据权利要求4所述的发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为碳源80～120g/L、氮源5～20g/L、无机盐20～60g/L和维生素0.01～0.04g/L。
8.根据权利要求7所述的发酵生产富含DHA油脂的方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、果葡糖浆、甘油、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种，所述氮源为谷氨酸钠、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、蛋白粉中的一种或多种，所述无机盐为钙盐、磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐、铵盐中的一种或多种，所述维生素为维生素B1、维生素B12、维生素B6中的一种或多种。
9.一种富含DHA的油脂，其特征在于：由如权利要求3～8任一项所述的发酵生产富含DHA油脂的方法制得。
10.根据权利要求9所述的富含DHA的油脂，其特征在于：所述富含DHA的油脂中DHA含量为55％～62％，棕榈酸含量为14％～25％，DPA含量为7％～17％。
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