CN103981106A - Dha高产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)CGMCC No.5415及其发酵方法和应用。利用本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415，可实现快速地积累生物量和DHA，具有广泛的工业应用价值。

Description

DHA高产菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及二十二碳六烯酸的高产菌株及其应用。

背景技术

DHA(二十二碳六烯酸)是一种重要的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，属于ω3系列。DHA具有促进脑细胞生长发育、降血脂、抗炎和改善自身免疫、抗癌作用、促进神经发育和改善视力等多种重要的生理功能，被誉为新一代功能保健因子，受到世人的极大关注。

DHA的传统来源为深海鱼油，但是，这种来源存在比较突出的缺陷：资源有限、提取工艺复杂、污染环境、含有强烈的鱼腥味。因而传统深海鱼来源的DHA已远不能能满足社会的需求。而利用微生物发酵生产DHA以其独有的技术优势成为研究热点。其中利用微藻发酵生产DHA具有更大的优势和潜能。

微藻具有生长周期短、繁殖速度快、可塑性强、对营养要素要求简单等优点。利用微藻高密度发酵生产可获得高产量的DHA。目前已发现的微藻有裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等。其中裂殖壶菌为一种海洋真菌，具有较强的多不饱和脂肪酸的生产能力，且不饱和脂肪酸成分集中，制药为DHA和DPA，其他不饱和脂肪酸含量低。

目前，利用裂殖壶菌生产DHA已成为热点之一。涉及利用裂殖壶菌生产DHA的文献有CN1648233A、CN1916156A、CN101575584B、CN101519676B、CN101638361A、CN101812484B、CN101993824A、CN101993824A、CN101892160A、CN102864111A等。其中CN1648233A公开了裂殖壶菌经培养后生物量为25g/L，DHA含量为8.7g/L；CN1916156A公开了优化培养后裂殖壶菌的生物量为42.5g/L，DHA含量为14.1g/L；CN101575584B公开了利用裂殖壶菌生产DHA，优化条件下细胞干重达到70g/L、油脂含量31.5g/L、DHA占总脂含量35％；CN101812484B公开了经120～130小时高密度培养发酵后，裂殖壶菌的生物量为120～150g/L、DHA含量为26～30g/L；CN101892160A公开了经100小时培养发酵后，裂殖壶菌生物量为72.5g/L、DHA含量为15.3g/L；CN102199541A公开了经72小时培养发酵后，裂殖壶菌的生物量为120g/L、油脂含量为54.3％、DHA为51.4％；CN102864111A公开了经72小时培养发酵后，裂殖壶菌的生物量为100g/L、DHA为22.9g/L。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一株能高产DHA的裂殖壶菌及其发酵方法和应用，本发明提供的高产DHA的菌株菌体产量增加快、易于大规模培养。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，该菌株的保藏号为CGMCC No.5415。

本发明的第二个目的在于提供所述的裂殖壶菌CGMCC No.5415用于生产二十二碳六烯酸的应用。

本发明的第三个目的在于提供通过发酵所述的裂殖壶菌CGMCC No.5415获得二十二碳六烯酸的生产方法，所述发酵的培养条件如下：

种子培养基为：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海盐15g/L、pH7.0；

发酵培养基(5L装量发酵罐)为：葡萄糖60g/L，玉米浆12g/L，海盐15g/L，pH6.0；

接种量10％，搅拌转速为250～300rpm，温度为25℃，溶氧为40％，空气流量3L/min，pH6.0，发酵72h；其间，0-18小时，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小时，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小时，以6-8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小时，以10mL/h速率流加120g/L玉米浆溶液。

本发明的有益效果：本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415能够利用普通碳源和氮源，快速进行细胞培养和DHA的积累。通过条件优化，经72h发酵培养后，可使细胞培养生物量达到150g/L左右，DHA占菌体细胞干重的量为0.3g/g左右。相比现有技术，利用本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415，可实现快速地积累生物量和DHA，达到高产的效果。

本发明提供了一种新的裂殖壶菌，可用于高产DHA，具有广泛的工业应用前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)已于2011年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.5415。

实施例1、HCCB30108的筛选

将宁波舟山近海采集的水样离心后取沉淀物涂布于含有青霉素(0.5g/L)和链霉素(0.5g/L)的固体培养基中(葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，海水，pH7.0)，28℃培养4～5天。将获得的培养物转种于新的固体平板上，平板划线直至出现单菌落。经过复筛后，最终得到一株纯培养物，编号为HCCB30108。

实施例2、HCCB30108的鉴定

将实施例1获得的HCCB30108送往中国科学院微生物研究所进行了菌种鉴定。根据HCCB30108的培养及细胞显微形态特征、生理生化特征和rRNA基因序列等数据，确定HCCB30108为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)。

裂殖壶菌HCCB30108于2011年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5415。

实施例3、裂殖壶菌CGMCC No.5415的发酵罐培养

将实施例2获得的裂殖壶菌CGMCC No.5415进行发酵培养。斜面培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，海盐15g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0。将斜面培养2天的裂殖壶菌接种于种子培养基中。种子培养基为：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海盐15g/L、pH7.0。25℃培养至对数生长期，以10％的接种量接种于含有5L发酵培养基的发酵罐中。发酵培养基为：葡萄糖60g/L，玉米浆12g/L，海盐15g/L，pH6.0。接种量10％，控制搅拌转速为250～300rpm，温度为25℃，调节转速控制溶氧为40％，空气流量3L/min，使用氨水控制pH维持在6.0。发酵0-18小时，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小时，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小时，以6-8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小时，以10mL/h速率流加120g/L玉米浆溶液，至72小时生物量达到高峰，停止发酵。

发酵液经高速冷冻离心(8000rpm/min，8min)，弃去上清。沉淀用等体积的1％的NaCl溶液洗，再次离心后，获得湿菌体。将获得的湿菌体进行冷冻干燥，获得干菌体。4批发酵批次数据如表1所示。

表1、裂殖壶菌CGMCC No.5415的发酵菌体量

批次	发酵液体积(L)	干菌体(g/L)
			1	5.3	145
2	5.4	153
			3	5.3	149
4	5.5	148

由表1的结果可见，本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415能够利用普通碳源和氮源快速进行细胞培养，经发酵培养，可使细胞培养生物量达到150g/L左右。

实施例4、油脂提取和脂肪酸甲酯化

将实施例3所述的干菌体碾磨成粉，采用索氏抽提法抽提油脂，并称重。称取30g干菌体，加入300ml0.4M的氢氧化钾-甲醇溶液，60℃水浴回流2h；待水浴结束后，冷却到室温，加入400ml14％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于60℃水浴30min，进行甲酯化。然后冷却到室温，加入300ml正己烷，充分振荡。再加入200ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液，获得脂肪酸甲酯。

参照CN201110111247.7的分析方法进行DHA甲酯的定量分析。4批发酵所得干菌体中DHA的含量如表2所示。

表2、裂殖壶菌CGMCC No.5415的发酵菌体中的DHA含量

批次	DHA的含量(g)/100g干菌体
		1	28.8
2	29.1
		3	30.5
4	29.6

由表2的结果可见，本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415的发酵菌体中，DHA占菌体细胞干重的量最高可达0.3g/g以上，因此，相比现有技术，利用本发明提供的裂殖壶菌CGMCC No.5415，可实现快速地积累生物量和DHA，实现高产的目的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，其特征在于：该菌株的保藏号为CGMCC No.5415。

2.如权利要求1所述的裂殖壶菌CGMCC No.5415用于生产二十二碳六烯酸的应用。

3.一种二十二碳六烯酸的生产方法，其特征在于，通过发酵如权利要求1所述的裂殖壶菌CGMCC No.5415获得二十二碳六烯酸。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养条件如下：

种子培养基为：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海盐15g/L、pH7.0；

发酵培养基(5L装量发酵罐)为：葡萄糖60g/L，玉米浆12g/L，海盐15g/L，pH6.0；

接种量10％，搅拌转速为250～300rpm，温度为25℃，溶氧为40％，空气流量3L/min，pH6.0，发酵72h；其间，0-18小时，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小时，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小时，以6-8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小时，以10mL/h速率流加120g/L玉米浆溶液。