CN105400835A - 一种利用豆渣制备dha的方法和dha - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种利用豆渣制备DHA的方法，包括以下步骤：(1)豆渣预处理；(2)采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶制剂对豆渣进行酶解，得到酶解混合物，离心后得到豆渣酶解上清液；(3)将葡萄糖和豆渣酶解上清液溶解在人工海水中，得到以豆渣作为主要氮源的发酵培养基，所述豆渣酶解上清液的浓度为20～60g/L；(4)采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，向发酵培养基接种裂殖壶菌种子，搅拌通空气，发酵4-6天后，收获发酵液；(5)将发酵液离心干燥后得到裂殖壶菌干粉，即制得DHA。该方法能显著降低DHA的生产成本，同时将豆渣变废为宝，减少对环境的污染。本发明还提供了该方法制得的DHA。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产领域，特别是涉及一种利用豆渣制备DHA的方法和DHA。
背景技术
豆渣是生产豆奶或者豆腐过程中的副产品，每年全球的豆渣产量都很大。目前人们对豆渣的利用率较低，传统的利用是将豆渣作为动物饲料，直接喂养动物，使豆渣中很多高营养价值的成分利用率较低，有些甚至将豆渣直接作为废弃物丢弃，给环境造成了污染。因此，有必要寻求一种能高效利用豆渣，彻底将其变废为宝的新工艺。
DHA，全名二十二碳六烯酸，是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸。目前，微生物发酵法生产DHA由于易实现大规模生产，同时可克服传统鱼油提取的不足，因而具有广阔的应用前景。其中，裂殖壶菌因生长速度快、易于培养、细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，成为目前进行工业化生产DHA的理想物种之一。然而现有微生物发酵法生产DHA仍存在发酵培养基成本高，所得产品DHA含量不高等问题。
发明内容
鉴于此，本发明实施例第一方面提供了一种利用豆渣制备DHA的方法，以解决现有豆渣利用率低，污染环境，以及现有DHA产品生产成本高、DHA含量不高的问题。
第一方面，本发明实施例提供了一种利用豆渣制备DHA的方法，包括以下步骤：
(1)豆渣预处理
将豆渣脱水干燥、粉碎处理后进行膨化；
(2)豆渣酶解
将膨化后的豆渣加入到蒸馏水中制成豆渣匀浆液，向所述豆渣匀浆液中加入由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶制剂进行酶解，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液；收集所有豆渣酶解上清液用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；
(3)发酵培养基制备
将葡萄糖和上述所得豆渣酶解上清液溶解在人工海水中，得到以豆渣作为主要氮源发酵裂殖壶菌的发酵培养基，所述培养基中，葡萄糖浓度为60～120g/L，豆渣浓度为20～60g/L；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子的接种量为3％～10％，发酵温度为25～35℃，pH值维持在5.0～7.0，搅拌通空气，分阶段控制溶氧量发酵4-6天后，发酵终止，收获发酵液；
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在10％～30％，将物料经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
本发明实施例上述提供的利用豆渣生产DHA的方法，利用廉价且营养丰富的新鲜豆渣为原料，经膨化-酶解预处理，以酶解液为发酵基质调配发酵培养基，灭菌后接种裂殖壶菌发酵生产DHA，能够显著降低DHA的生产成本，同时将豆渣变废为宝，减少对环境的污染。
步骤(1)中，所述豆渣为豆制品加工过程中的副产品。优选地，将豆渣脱水干燥至含水量约20％～40％。优选地，将豆渣粉碎处理后过60～120目筛，再进行膨化。
步骤(2)中，优选地，所述豆渣匀浆液中，豆渣与蒸馏水的体积比为1:10～1:40。
优选地，所述复合酶制剂中，纤维素酶和果胶酶的体积比为1:0.5～1:3。
优选地，所述复合酶制剂在所述豆渣匀浆液中的质量含量≤0.3％。
所述纤维素酶和果胶酶的酶活均达到10000U/L。优选地，酶解过程中，调节pH3.0～5.5，温度35～65℃，酶解12～48h。
步骤(3)中，所述葡萄糖浓度是指葡萄糖的质量占整个发酵培养基的百分比浓度，所述豆渣浓度是指豆渣的质量占整个发酵培养基的百分比浓度，即将豆渣酶解上清液折合成豆渣的重量。
优选地，所述人工海水中包括如下质量含量的组份：谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵1g/L，氯化钾0.2g/L，氯化钙0.1g/L和微量元素。
优选地，所述微量元素组成为：
Na2EDTA4～10mg/L，
MnCl2·4H2O0.5～1.2mg/L，
CuSO4·5H2O0.4～1mg/L，
H3BO30.5～1.5mg/L，
FeSO40.01～0.05mg/L，
NiSO4·6H2O0.06～0.12mg/L，
CoCl2·6H2O0.01mg/L，
泛酸钙0.001～0.008mg/Lmg/L。
更优选地，所述微量元素组成为：
Na2EDTA6mg/L，
MnCl2·4H2O0.86mg/L，
CuSO4·5H2O0.6mg/L，
H3BO30.5mg/L，
FeSO40.29mg/L，
NiSO4·6H2O0.06mg/L，
CoCl2·6H2O0.01mg/L，
泛酸钙0.0032mg/L。
本发明中，所述人工海水各组分的浓度是指在整个发酵培养基中的终浓度。
步骤(4)中，优选地，所述分阶段控制溶氧量发酵4-6天的具体过程为：
第一阶段，前48h溶氧量保持在10％～20％；第二阶段，从48～60h间溶氧量维持在8％～15％；第三阶段，从60～72h间溶氧量维持在4％～10％；第四阶段，从72～84h间溶氧量维持在2％～8％；第五阶段，从84h到发酵过程终止溶氧量维持在0.5％～2％。
所述分阶段控制溶氧量发酵，发酵过程中的溶氧量是通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速与溶氧量关联。优选地，起始转速设置为540rpm，通气量设置为2vvm。优选地，发酵过程中，自动流加氢氧化钠和柠檬酸，维持发酵体系pH值在5.0～7.0。优选地，发酵过程中，温度全程采用28℃进行发酵。
充足的氧气有助于DHA的合成和菌体的快速生长。通过通气量和搅拌转速调控发酵液中的溶氧量，可以使菌体和营养物质均匀分布，有利于不饱和脂肪酸的合成，提高菌体生长率。高溶氧有利于裂殖壶菌菌体生长，低溶氧有利于裂殖壶菌积累DHA。因此，本发明发酵前期，采用高溶氧，使菌体生长更快；到发酵后期，采用低溶氧限制刺激菌体积累DHA，从而有效提高DHA产量。
优选地，所述发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，向发酵液中补加葡萄糖，每次补加后发酵液中葡萄糖浓度为10-70g/L。该葡萄糖补料方式可提高底物利用率，提高发酵液中生物量、总油脂和DHA产量。
优选地，所述发酵过程中，当发酵液中氮源浓度为1-5g/L时，向发酵液中补加氮源，即所述豆渣酶解上清液，每次补加后发酵液中豆渣浓度为20～60g/L。
优选地，所述发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，向发酵液中补加葡萄糖，每次补加后发酵液中葡萄糖浓度为10-70g/L；同时当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，向发酵液中补加氮源，即所述豆渣酶解上清液，每次补加后发酵液中豆渣浓度为20～60g/L。
第二方面，本发明实施例提供了一种由上述方法制备得到的DHA。所述DHA可以作为食品添加剂，饲料添加剂等。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.豆渣属于豆制品加工中的副产物，本发明以此作为裂殖壶菌发酵生产DHA的原辅料，可重复利用加工副产物，延伸产品链，减少了豆制品企业废物污染，实现豆制品企业的清洁和循环生产。
2.本发明以豆渣酶解上清液替代培养基中的绝大部分氮源，降低了培养基生产成本，进而极大降低了DHA的生产成本。
3.本发明采用分阶段控制溶氧量发酵，有利于DHA菌株的生长和DHA的积累，并通过进一步地补加碳氮源，所得发酵液中生物量含量为可达80.9g/L，油脂含量可达48.1g/L，DHA产量可达22.5g/L。
4.本发明将富含DHA的发酵液加工成DHA产品，所得DHA产品的DHA含量高，同时通过优化豆渣的发酵工艺，建立了一套裂殖壶菌的发酵新工艺，不但降低了生产成本，还提高了裂殖壶菌的产量，增加了细胞中DHA含量，实现了豆渣资源化循环利用。
本发明实施例的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1是本发明实施例利用豆渣制备DHA的方法流程图；
图2是本发明实施例1中采用豆渣酶解上清液发酵生产裂殖壶菌的脂肪酸分析图谱；
图3是本发明实施例1-3中采用不同浓度的豆渣酶解上清液对生物量、总油脂及DHA产量的影响；
图4是本发明实施例中采用优化碳氮源补加条件下的裂殖壶菌发酵曲线。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
下面结合附图以及具体实验针对以下问题作详细的说明；
I、豆渣浓度对以裂殖壶菌生长和DHA含量的影响；
II、碳源(葡萄糖)补加对豆渣发酵裂殖壶菌产油脂和DHA的影响；
III、氮源(豆渣酶解上清液)补加对豆渣发酵裂殖壶菌产油脂和DHA影响；
IV、碳源(葡萄糖)和氮源(豆渣酶解上清液)同时补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影响。
Ⅰ、以豆渣为主要氮源的裂殖壶菌发酵培养基的优化，不同豆渣浓度对裂殖壶菌的生长和DHA含量的影响。
实施例1
一种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
(1)豆渣预处理
先将豆渣进行脱水干燥至豆渣含水量为20％左右，进行粉碎处理，过60目筛后进行膨化；
(2)豆渣酶解
称取40g膨化后的干豆渣按固液质量比1:20制成豆渣匀浆液，在豆渣匀浆液中加入不超过0.3％质量含量的复合酶制剂，调节pH4.0，温度55℃，酶解24h，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液，收集所有豆渣酶解上清液用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；所述复合酶制剂为体积比1:1的酶活均达到10000U/L的纤维素酶和果胶酶；
加蒸馏水将收集的豆渣酶解上清液定容至1L，获得的溶液即为豆渣浓度为40g/L的豆渣酶解上清液(折合成豆渣的质量)；若需其他浓度的豆渣酶解上清液，只需相应调整豆渣的用量即可；
(3)发酵培养基制备
将葡萄糖和的豆渣酶解上清液，溶解在人工海水中，得到发酵培养基，所述培养基中，葡萄糖浓度为100g/L，豆渣浓度为40g/L；所述人工海水中包括如下质量含量的组份：谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵1g/L，氯化钾0.2g/L，氯化钙0.1g/L和微量元素。其中微量元素组成为：Na2EDTA6mg/L，MnCl2·4H2O0.86mg/L，CuSO4·5H2O0.6mg/L，H3BO30.5mg/L，FeSO40.29mg/L，NiSO4·6H2O0.06mg/L，CoCl2·6H2O0.01mg/L，泛酸钙0.0032mg/L；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4％(v/v)的接种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L上述发酵培养基，培养温度28℃，起始转速540rpm，通气量2vvm。自动流加NaOH和柠檬酸，维持pH值在6.5。在整个生长周期中，温度全程采用28℃进行发酵。发酵过程中的溶氧通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约15％，从48～60h间维持在约10％，从60～72h间维持在约8％，从72～84h间维持在约6％，从84h到发酵过程终止约为2％，发酵4天后，发酵终止，收获发酵液；
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15％左右，将物料打入喷雾干燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于豆渣浓度为20g/L。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于豆渣浓度为60g/L。
将实施例1-3所得的裂殖壶菌干粉分别进行如下实验测定：取适量裂殖壶菌干粉加入浓HCl在60～70℃水浴锅中进行破壁，用正己烷提取油脂，55℃水浴旋转蒸发至恒重，测其总油脂产量；取适量油脂和内标物(二十烷酸)，按常规的BF3-乙醚催化剂进行KOH-CH3OH甲酯化，通过气相色谱法测定菌体中的DHA产量。
实验结果如表1、图2和图3所示。
表1发酵后期不同豆渣浓度下培养裂殖壶菌的脂肪酸组成
结果表明：实施例1-3中，选用不同豆渣浓度的豆渣酶解上清液进行实验，经过4d的发酵，如图3所示，当豆渣酶解上清液浓度为40g/L时，裂殖壶菌生物量，总油脂和DHA分别达到最大值15.4、6.1和2.8g/L；当豆渣酶解上清液浓度为60g/L时，培养4d后裂殖壶菌生物量、总油脂和DHA分别达到最大值14.9、5.8和2.6g/L；且结合表1中油脂在生物中的含量，当豆渣酶解上清液浓度为40～60g/L时，总油脂在生物量中的含量达到了38％以上。豆渣酶解上清液的浓度是折合成豆渣的质量计算的。
表1中列出了裂殖壶菌中各种分析脂肪酸的成分组成，当豆渣酶解上清液的浓度从20增至40～60g/L时，饱和脂肪酸如肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)的含量都在相应的减少；而不饱和脂肪酸如DPA(C22:5)、DHA(C22:6)的含量都在相应的增加。因此豆渣酶解上清液的浓度(即氮源浓度)的变化可能影响着脂肪酸从饱和到不饱和转变的这一重要过程，可见氮源浓度在不饱和脂肪酸合成的过程中起着重要的作用。
Ⅱ、不同浓度的碳源(葡萄糖)补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影响
实施例4
一种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
(1)豆渣预处理
先将豆渣进行脱水干燥至豆渣含水量为20％左右，进行粉碎处理，过60目筛后进行膨化；
(2)豆渣酶解
称取50g膨化后的干豆渣按固液质量比1:20制成豆渣匀浆液，在豆渣匀浆液中加入不超过0.3％质量含量的复合酶制剂，调节pH4.0，温度55℃，酶解24h，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液，收集所有豆渣酶解上清液用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；所述复合酶制剂为体积比1:1的酶活均达到10000U/L的纤维素酶和果胶酶；
加蒸馏水将收集的豆渣酶解上清液定容至1L，获得的溶液即为浓度为50g/L的豆渣酶解上清液(折合成豆渣的质量)；若需其他浓度的豆渣酶解上清液，只需相应调整豆渣的用量即可；
(3)发酵培养基制备
将葡萄糖和的豆渣酶解上清液，溶解在人工海水中，得到发酵培养基，所述培养基中，葡萄糖浓度为120g/L，豆渣浓度为50g/L；所述人工海水中包括如下质量含量的组份：谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵1g/L，氯化钾0.2g/L，氯化钙0.1g/L和微量元素。其中微量元素组成为：Na2EDTA6mg/L，MnCl2·4H2O0.86mg/L，CuSO4·5H2O0.6mg/L，H3BO30.5mg/L，FeSO40.29mg/L，NiSO4·6H2O0.06mg/L，CoCl2·6H2O0.01mg/L，泛酸钙0.0032mg/L；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4％(v/v)的接种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L发酵培养基，培养温度28℃，起始转速540rpm，通气量2vvm。自动流加NaOH和柠檬酸，维持pH值在6.5。在整个生长周期中，温度全程采用28℃进行发酵。分段溶氧控制发酵。发酵过程中的溶氧是通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约8％，从48～60h间维持在约6％，从60～72h间维持在约4％，从72～84h间维持在约2％，从84h到发酵过程终止约为1％。发酵过程中，当发酵液中葡萄糖糖浓度低于5g/L时，开始补加高浓度葡萄糖，控制补加后葡萄糖残糖浓度为10g/L；当培养5d时，发酵终止，收获发酵液。
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15％左右，将物料打入喷雾干燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
实施例5
本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为30g/L。
实施例6
本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为50g/L。
实施例7
本实施例与实施例4的区别仅在于控制补加后葡萄糖残糖浓度为70g/L。
按前述实验方法测定实施例4-7所得发酵液中生物量、油脂及DHA产量，观察不同补糖浓度对裂殖壶菌的生长和DHA含量的影响。结果见表2。
表2不同浓度的葡萄糖补加下的发酵参数
结果表明：实施例4-7中的葡萄糖补料方式均提高了底物利用率，提高了生物量、总油脂和DHA产量。除了实施例7补加70g/L葡萄糖产量提高不明显外，其余浓度的补加均有不同程度的提升。原因可能是补加葡萄糖浓度过高，抑制了菌体生长。故补加50g/L的葡萄糖组产量提高程度不如补加葡萄糖浓度30g/L。补加10g/L的葡萄糖虽缓解一部分碳源缺乏的菌体生长，但生物量和DHA产量提高程度不如补加葡萄糖浓度30g/L。固本发明优选控制补加后葡萄糖残糖浓度为20-40g/L。
其中，实施例5补加浓度为30g/L的葡萄糖组获得的裂殖壶菌干粉的营养组成为(％，干菌粉重量)：蛋白质13.2％、粗脂肪55.4％、碳水化合物10.4％、水分6.5％，其中DHA占菌体干重的含量为26.5％。
Ⅲ、不同浓度的氮源(豆渣酶解上清液)补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影响
实施例8
一种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
(1)-(3)同实施例4；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4％(v/v)的接种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L发酵培养基(葡萄糖浓度为120g/L)，培养温度28℃，起始转速540rpm，通气量2vvm。自动流加NaOH和柠檬酸，维持pH值在6.5。在整个生长周期中，温度全程采用28℃进行发酵。发酵过程中的溶氧是通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约8％，从48～60h间维持在约6％，从60～72h间维持在约4％，从72～84h间维持在约2％，从84h到发酵过程终止约为0.5％。发酵过程中，当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，开始补加浓度为20g/L的豆渣酶解上清液；当培养5d时，发酵终止，收获发酵液。
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15％左右，将物料打入喷雾干燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
实施例9
本实施例与实施例8的区别仅在于当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，开始补加浓度为40g/L的豆渣酶解上清液。
实施例10
本实施例与实施例8的区别仅在于当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，开始补加浓度为60g/L的豆渣酶解上清液。
按前述实验方法测定实施例8-10所得发酵液中生物量、油脂及DHA产量，观察不同补氮浓度对裂殖壶菌的生长和DHA含量的影响。结果见表3。
表3不同浓度的豆渣酶解上清液补料后的发酵参数
结果表明：实施例8-10中的豆渣补料方式均能使生物量、总油脂和DHA产量得以提高。其中，实施例9补加40g/L的豆渣酶解上清液组，达到了最大的生物量、油脂和DHA产量，分别为26.3、11.7、5.2g/L。补加60g/L的豆渣酶解上清液组，生物量和DHA产量降低，可能是氮源浓度过高，限制了油脂合成。
实施例9补加40g/L豆渣酶解上清液组获得的裂殖壶菌干粉的营养组成为(％，干菌粉重量)：蛋白质9.2％、粗脂肪44.3％、碳水化合物15.4％、水分6.1％，其中DHA占菌体干重的含量为15.1％。
Ⅳ、碳源(葡萄糖)和氮源(豆渣酶解上清液)同时补加对裂殖壶菌的生长和DHA产量的影响
实施例11
一种利用豆渣制备DHA的方法，包括如下步骤：
(1)豆渣预处理
先将豆渣进行脱水干燥至豆渣含水量为20％左右，进行粉碎处理，过60目筛后进行膨化；
(2)豆渣酶解
称取40g膨化后的干豆渣按固液质量比1:20制成豆渣匀浆液，在豆渣匀浆液中加入不超过0.3％质量含量的复合酶制剂，调节pH4.0，温度55℃，酶解24h，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液，收集所有豆渣酶解上清液用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；所述复合酶制剂为体积比1:1的酶活均达到10000U/L的纤维素酶和果胶酶；
加蒸馏水将收集的豆渣酶解上清液定容至1L，获得的溶液即为浓度为40g/L的豆渣酶解上清液(折合成豆渣的质量)；若需其他浓度的豆渣酶解上清液，只需相应调整豆渣的用量即可；
(3)发酵培养基制备
将葡萄糖和的豆渣酶解上清液，溶解在人工海水中，得到发酵培养基，所述培养基中，葡萄糖浓度为100g/L，豆渣浓度为40g/L；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子培养两代后以4％(v/v)的接种量接种于5L发酵罐中，5L发酵罐中装入3L发酵培养基(葡萄糖浓度为100g/L)，培养温度28℃，起始转速540rpm，通气量2vvm。自动流加NaOH和柠檬酸，维持pH值在6.5。在整个生长周期中，温度全程采用28℃进行发酵。分段溶氧控制发酵。发酵过程中的溶氧是通过控制通气量和搅拌速度来完成，将转速与溶氧关联，设置540rpm为最低转速。前48h溶氧保持在约8％，从48～60h间维持在约6％，从60～72h间维持在约4％，从72～84h间维持在约2％，从84h到发酵过程终止约为1％。发酵过程中，当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，开始补加40g/L的豆渣酶解上清液；同时当葡萄糖糖浓度低于5g/L时，开始补加高浓度葡萄糖，控制补加后葡萄糖残糖浓度为30g/L；当培养5d时，发酵终止，收获发酵液。
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在15％左右，将物料打入喷雾干燥器中，经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
本发明实施例11裂殖壶菌在5L发酵罐中的发酵曲线如图4所示。最终发酵液中生物量、油脂及DHA产量分别为80.9g/L、48.1g/L和22.5g/L，其中DHA在总油脂中含量为46.8％。所得DHA的营养组成为(％，干菌粉重量)：蛋白质14.5％、粗脂肪59.4％、碳水化合物13.6％、水分6.3％，其中DHA占菌体干重的含量为27.8％。
经过该方法发酵获得裂殖壶菌总脂含量为59.4％，远远高于其蛋白含量，细胞内高效的积累了脂肪酸。
表45L发酵获得裂殖壶菌干粉的脂肪酸分析结果
表4列出了裂殖壶菌中各种脂肪酸的成分组成，细胞中不饱和脂肪酸占到总脂肪酸的一般左右，特别是DHA含量占到了总脂肪酸的46～47％。
Claims (10)
1.一种利用豆渣制备DHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)豆渣预处理
将豆渣脱水干燥、粉碎处理后进行膨化；
(2)豆渣酶解
将膨化后的豆渣加入到蒸馏水中制成豆渣匀浆液，向所述豆渣匀浆液中加入由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶制剂进行酶解，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和豆渣酶解上清液；收集所有豆渣酶解上清液用于下一步裂殖壶菌的发酵生产；
(3)发酵培养基制备
将葡萄糖和上述所得豆渣酶解上清液溶解在人工海水中，得到以豆渣作为主要氮源发酵裂殖壶菌的发酵培养基，所述培养基中，葡萄糖浓度为60～120g/L，豆渣浓度为20～60g/L；
(4)发酵罐体系的设置
采用阶段控制溶氧量的发酵罐体系，裂殖壶菌种子的接种量为3～10％，发酵温度为25～35℃，pH值维持在5.0～7.0，搅拌通空气，分阶段控制溶氧量发酵4-6天后，发酵终止，收获发酵液；
(5)裂殖壶菌的收集和干燥
将所述发酵液用离心机分离，分离后物料含固量在10％～30％，将物料经过喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，即制得DHA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工海水中包括如下质量含量的组份：谷氨酸钠20g/L，硫酸钠10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铵1g/L，氯化钾0.2g/L，氯化钙0.1g/L和微量元素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微量元素组成为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合酶制剂中，纤维素酶和果胶酶的体积比为1:0.5～1:3。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合酶制剂在所述豆渣匀浆液中的质量含量≤0.3％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分阶段控制溶氧量发酵4-6天的具体过程为：
第一阶段，前48h溶氧量保持在10％～20％；第二阶段，从48～60h间溶氧量维持在8％～15％；第三阶段，从60～72h间溶氧量维持在4％～10％；第四阶段，从72～84h间溶氧量维持在2％～8％；第五阶段，从84h到发酵过程终止溶氧量维持在0.5％～2％。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，向发酵液中补加葡萄糖，每次补加后发酵液中葡萄糖浓度为10-70g/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵液中氮源浓度为1-5g/L时，向发酵液中补加氮源，即所述豆渣酶解上清液，每次补加后发酵液中豆渣浓度为20～60g/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，向发酵液中补加葡萄糖，每次补加后发酵液中葡萄糖浓度为10-70g/L；同时当发酵液中氮源浓度低于1g/L时，向发酵液中补加氮源，即所述豆渣酶解上清液，每次补加后发酵液中豆渣浓度为20～60g/L。
10.如权利要求1-9任一项所述方法制备得到的DHA。
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