CN110923271B - 裂殖壶菌的发酵生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种以浒苔水解液为主要碳源和氮源的裂殖壶菌生产工艺。该工艺方法，主要包括：浒苔水解液制备、发酵培养基与流加培养基制备、发酵体系设置和发酵，以及收集与干燥等步骤，而最终获得裂殖壶菌干粉。本发明发酵生产工艺，可以解决现有技术存在的产量较低、生产成本高的问题，以浒苔水解液作为主要的氮源、碳源的裂殖壶菌发酵生产新工艺，不仅降低了发酵生产的成本，而且提高了裂殖壶菌的生长速率，促进裂殖壶菌细胞的DHA积累。其在综合成本、发酵时间、生物量DHA产量等方面均具有较大的优势，宜于工业上规模生产与应用。

Description

裂殖壶菌的发酵生产方法
技术领域
本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种以浒苔水解液为主要碳源和氮源的裂殖壶菌生产工艺。
背景技术
近年来，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFAs)对人类健康的重要作用已越来越受到人们的重视。其中，DHA因其在人体和动物体内的重要生理功能而备受青睐。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分，对婴幼儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用，还具有降低胆固醇、抗凝血、预防癌症等药理作用。另外，DHA还是多种海水鱼、虾、贝等生长发育所必需脂肪酸，可以提高育苗的成活率。
传统上，DHA多是从深海鱼油中获得，但从鱼油中提取的PUFAs存在产量不稳、得率低、成本高及含有其他ω-6PUFAs等问题，且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。
裂殖壶菌(Schizochytrium limacimum)，又称裂壶藻，是一种海洋真菌，属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊弧菌科、裂殖壶菌属、裂殖壶菌。该藻中DHA含量丰富，还含有少量的二十五碳五烯酸(DPA)，而其他的不饱和脂肪酸含量很低；其使用安全，是一种优良的DHA潜生资源。
目前，裂殖壶菌发酵一般是以酵母制品作为主要氮源，葡萄糖等糖类物质作为碳源，生产成本较高。因此，寻求一种高产量、低成本的裂殖壶菌的工业化发酵生产新工艺则是本发明所面临的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产成本低、DHA含量高，且利于工业化规模应用的全新裂殖壶菌的发酵生产方法。
为达到上述目的，本发明所采用的方案是：
一种裂殖壶菌的发酵生产方法，其是利用海藻渣(特别是浒苔)所制备的培养基进行发酵以生产裂殖壶菌的工艺，是以浒苔水解液作为碳源和氮源的来源进行发酵生产的新型工艺方法。该方法至少包括以下步骤：
1)浒苔水解液制备的步骤
干浒苔的粉碎：将干浒苔用粉碎机粉碎，以得到干浒苔粉。
浒苔水解：向水解罐内加入干浒苔粉和水，根据设定的实验条件对浒苔进行水解，以得到浒苔水解物料；其中，水解过程所依据的设定实验条件可以是根据单因素实验确定的；例如，通过单因素实验确定碳酸氢钠、氢氧化钠用量、升压压力、加热温度、保温时间等对浒苔分解及还原糖积累的影响，以确定浒苔水解的最优实验条件，并按此进行水解过程。
水解液过滤：将水解物料打入板框压滤机以进行固液分离，依设定的过滤条件，对所得滤液进行过滤，以得到水解液。其中，过滤过程所依据的滤过条件，可以是以最终水解液的得率和还原糖的得率为主要衡量指标，对所用滤布的孔径、过滤时的温度、过滤压力等过滤参数进行最优实验条件的探索而得到的。
2)发酵培养基与流加培养基制备的步骤：
将浒苔水解液与其他营养物质配置成发酵培养基和流加培养基，灭菌后进行裂殖壶菌的发酵生产。其中，培养基中水解液的用量是根据生物量和DHA含量而确定的，其余营养物质的用量则可以根据裂殖壶菌生长时所需的离子导电率、营养盐消耗及离子平衡进行计算而确定。
3)发酵体系设置的步骤：
在不同规格的培养体系中，每一级发酵罐体系(即不同体积的培养体系)中，裂殖壶菌种子的接种量均为5-10％。
4)收集和干燥的步骤：
发酵结束后，将裂殖壶菌发酵液用离心机进行分离，再经喷雾干燥塔喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉。
作为优选，在步骤3)中的发酵过程串，采用流加补料方式进行发酵，其包括：
0-12h，不补料，培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm；
12-24h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/20-1/15；培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm；
24-96h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/5-1/4；发酵温度28-32℃；通气量为1-2vvm；50-80rpm。
进一步地，步骤3)的发酵过程还包括：
96-100h，发酵液中补入乙酸钠和硫酸亚铁，并且，使发酵液中NaAc 0.1-0.5g/L，FeSO4 0.05-0.1g/L(均为终浓度)；发酵温度20-22℃；通气量为0.1-0.3vvm；30-50rpm。
作为优选，步骤1)中浒苔的水解条件为：向水解罐内加入质量比为1:1的干浒苔粉和水，加入终浓度分别为10-15g/L的碳酸氢钠和2-5g/L的氢氧化钠，压力升至0.1-0.20MPa，加热至30-60℃，保温时间40min-80min，冷却后用硫酸或磷酸调节pH至6.5-7，即得浒苔水解物料。
更佳地，碳酸氢钠和氢氧化钠的添加量分别为12-14g/L和4-5g/L(均为终浓度)，加热温度为50-55℃，保温时间50-60min。
作为优选，步骤)1中的过滤条件为：板框压滤机的有效过滤面积为80-100m2，采用100-600目滤布，过滤温度20-80℃，过滤压力0.05-0.4Mpa；所得滤液为浒苔水解液；更佳地，水解液过滤最佳条件为：采用250-300目滤布，过滤温度50-55℃，过滤压力0.2-0.3Mpa。
作为优选，步骤2)中，发酵培养基为：淡水配置，浒苔水解液50-500mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L；流加培养基：淡水配置，浒苔水解液250-750mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
更佳地，所述发酵培养基的优选配方为：浒苔水解液300-400mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L，补料培养基的优选配方为：浒苔水解液500-600mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
作为优选，步骤1)中，离心分离后的物料含固量应控制在20-30％；将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为200-300kg/h，进口温度为175-190℃，出口温度为70-90℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
最佳地，离心分离后的物料含固量控制在25％左右，将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为250kg/h，进口温度为175℃，出口温度为70℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
最佳地，在步骤3)中的发酵过程串，采用流加补料方式进行发酵，其具体可以采用以下工艺控制参数中的至少一种。
参数1：12-24h，浒苔水解液350mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/20；培养温度22±0.5℃；通气量为0.5vvm；100rpm；24-96h，浒苔水解液350mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/5；发酵温度29±0.5℃；通气量为1vvm；50rpm；96-100h，补入NaAc和FeSO4，NaAc0.1g/L，FeSO4 0.05g/L；发酵温度21±0.5℃；通气量为0.1vvm；30rpm。
参数2：12-24h，浒苔水解液450mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/18；培养温度22±0.5℃；通气量为0.8vvm；120rpm；24-96h，浒苔水解液450mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/5；发酵温度30±0.5℃；通气量为1vvm；50rpm；96-100h，补入NaAc和FeSO4，NaAc0.5g/L，FeSO4 0.05g/L；发酵温度21±0.5℃；通气量为0.1vvm；30rpm。
参数3：12-24h，浒苔水解液500mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/15；培养温度24±0.5℃；通气量为1vvm；150rpm；24-96h，浒苔水解液500mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/4；发酵温度31±0.5℃；通气量为2vvm；80rpm；96-100h，补入NaAc和FeSO4，NaAc 0.5g/L，FeSO4 0.1g/L；发酵温度21±0.5℃；通气量为0.1vvm；30rpm。
上述三个具体的参数条件是较佳的过程控制参数，其具体效果见表3所示，从中可以看出均具有不错的实际效果，特别是参数2、3。
本发明的裂殖壶菌的发酵生产方法(工艺)，以浒苔水解液作为主要碳源、氮源进行发酵生产，经浒苔水解、压滤、发酵培养基的配置、发酵罐体系的设置、裂殖壶菌的收集和干燥而制得裂殖壶菌干粉。本发明是以浒苔水解液作为主要的氮源、碳源的裂殖壶菌发酵生产的全新工艺，其不仅降低了发酵生产的成本，还提高了裂殖壶菌的生长速率、促进裂殖壶菌细胞的DHA积累；很好解决现有技术工艺所存在的产量较低、生产成本高的问题。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种裂殖壶菌的发酵生产方法，其是利用海藻渣(特别是浒苔)制备的培养基发酵生产裂殖壶菌的工艺，以浒苔作为碳源和氮源的来源进行发酵生产，包括以下步骤：
1、浒苔水解液的制备
1.1)干浒苔的粉碎：将干浒苔用粉碎机粉碎，以得到干浒苔粉。
1.2)浒苔水解：向水解罐内加入质量比为1:1的干浒苔粉和水，再根据设定的实验条件对浒苔进行水解，以得到水解物料。
其中，水解过程所依据的设定实验条件可以是根据单因素实验确定的；例如，通过单因素实验确定碳酸氢钠、氢氧化钠用量、升压压力、加热温度、保温时间等对浒苔分解及还原糖积累的影响，以确定浒苔水解的最优实验条件，并按此进行水解过程。
在较佳情况下，所依据的浒苔最佳水解条件可以为：向水解罐内加入质量比为1:1的干海苔粉和水，加入终浓度分别为10-15g/L的碳酸氢钠和2-5g/L的氢氧化钠，压力升至0.1-0.20MPa，加热至30-60℃，保温时间40min-80min，冷却后用硫酸或磷酸调节pH至6.5-7，即得浒苔水解物料。更佳地，碳酸氢钠和氢氧化钠的添加量分别为12-14g/L和4-5g/L(均为终浓度)，加热温度为50-55℃，保温时间50-60min。
1.3)水解液过滤：将上一步骤的水解物料打入板框压滤机以进行固液分离，依设定的过滤条件，对所得滤液进行过滤，以得到水解液；收集所有滤液保存于储罐中，用于下一步裂殖壶菌的发酵生产。
其中，过滤过程所依据的滤过条件，可以是以最终水解液的得率和还原糖的得率为主要衡量指标，对所用滤布的孔径、过滤时的温度、过滤压力等过滤参数进行最优实验条件的探索而得到的。
在较佳情况下，板框压滤机的有效过滤面积为80-100m2，采用100-600目滤布，过滤温度20-80℃，过滤压力0.05-0.4Mpa；所得滤液为浒苔水解液。更佳地，水解液过滤最佳条件为：采用250-300目滤布，过滤温度50-55℃，过滤压力0.2-0.3Mpa。
2、发酵培养基与流加培养基的制备
将不同量的浒苔水解液分别配成发酵培养基和流加培养基，灭菌后进行裂殖壶菌的养殖；在发酵培养基配置时，按设定数值添加相应量的水解液与其余营养物质的，以进行后续实验。
其中，培养基中水解液的用量是根据生物量和DHA含量而确定的，其余营养物质的用量则可以根据裂殖壶菌生长时所需的离子导电率、营养盐消耗及离子平衡进行计算而确定。
在较佳情况下，发酵培养基与流加培养基的配置组分要求分别如下：
发酵培养基：淡水配置，每升培养基中浒苔水解液50-500mL，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1.5g，硫酸钾4g，磷酸钠5g；流加培养基：淡水配置，每升培养基中浒苔水解液250-750mL，磷酸二氢钾3g，硫酸镁4.5g，硫酸钾12g，磷酸钠15g。
更佳地，所述发酵培养基优选配方为：浒苔水解液300-400mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L；补料培养基优选配方为：浒苔水解液500-600mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
3、发酵体系的设置
按以下条件设置发酵体系，包括：
A.培养体系设计：根据需要设定裂殖壶菌培养体系的规格，即其容积数(体积数)。
经实验表明，本发明的工艺在10-1000L的范围内，具有较为一致的发酵制备效果。具体来说，我们试验采用的裂殖壶菌培养体系分别为10L、200L、1000L的培养体系；其中：10L发酵罐中培养体积为6L，200L发酵罐中培养体积为120L，1000L发酵体系中培养体积为650L。
B.接种量设计：每一级发酵罐体系中，裂殖壶菌种子接种量为5-10％。
在较佳情况下，发酵中采用流加培养的方式，且在不同阶段，采用不同的发酵控制参数；其优选培养参数为：
C.流加补料方式设计:发酵中采用流加补料的方式，具体如下：
0-12h，不补料，培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm。
12-24h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/20-1/15；培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm。
24-96h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/5-1/4；发酵温度28-32℃；通气量为1-2vvm；50-80rpm。
96-100h，发酵液中补入NaAc和FeSO4，使发酵液中NaAc 0.1-0.5g/L，FeSO4 0.05-0.1g/L；发酵温度20-22℃；通气量为0.1-0.3vvm；30-50rpm。
4、裂殖壶菌的收集和干燥
发酵结束后，将裂殖壶菌发酵液用离心机进行分离，再经喷雾干燥塔喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉。
在较佳情况下，离心分离后的物料含固量应控制在20-30％；将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为200-300kg/h，进口温度为175-190℃，出口温度为70-90℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。最佳地，离心分离后的物料含固量控制在25％左右，将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为250kg/h，进口温度为175℃，出口温度为70℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
实施例
1、物料及菌种说明
采用我司自行生产的浒苔作为本申请的基础物料，该浒苔具有以下性质：多糖和粗纤维含量约为40-60％，粗蛋白含量约为20-40％，粗脂肪含量约为5-10％，其余为灰分；
本实施例中所采用的裂殖壶菌为保藏编号ATCC1381的裂殖壶菌；当然，本发明并不依赖于该保藏的特定菌种，其他裂殖壶菌亦是可适用的，选用该保藏菌种是为使实验结果可重复。
2、浒苔水解液的制备
2.1干浒苔的粉碎：
将干浒苔用粉碎机粉碎，得到干浒苔粉。
2.2浒苔水解：
向水解罐内加入质量比为1:1的干浒苔粉和水，再根据设定的实验条件对浒苔进行水解，以得到水解物料。其中，水解过程所依据的设定实验条件可以是根据单因素实验确定的；例如，通过单因素实验确定碳酸氢钠、氢氧化钠用量、升压压力、加热温度、保温时间等对浒苔分解及还原糖积累的影响，以确定浒苔水解的最优实验条件，并按此进行水解过程。
经单因素实验，确定浒苔最佳水解条件可以为：向水解罐内加入质量比为1:1的干海苔粉和水，加入终浓度分别为10-15g/L的碳酸氢钠和2-5g/L的氢氧化钠，压力升至0.1-0.20MPa，加热至30-60℃，保温时间40min-80min，冷却后用硫酸或磷酸调节pH至6.5-7，即得浒苔水解物料。更佳的条件则可以为：碳酸氢钠和氢氧化钠的添加量分别为12-14g/L和4-5g/L(均为终浓度)，加热温度为50-55℃，保温时间50-60min，其他不变。
2.3水解液过滤：
将上一步骤的水解物料打入板框压滤机以进行固液分离，依设定的过滤条件，对所得滤液进行过滤，以得到水解液；收集所有滤液保存于储罐中，用于下一步裂殖壶菌的发酵生产。其中，过滤过程所依据的滤过条件，可以是以最终水解液的得率和还原糖的得率为主要衡量指标，对所用滤布的孔径、过滤时的温度、过滤压力等过滤参数进行最优实验条件的探索而得到的。
根据实验结果，在较佳情况下，板框压滤机的有效过滤面积为80-100m2，采用100-600目滤布，过滤温度20-80℃，过滤压力0.05-0.4Mpa；所得滤液为浒苔水解液。更佳地，水解液过滤最佳条件为：采用250-300目滤布，过滤温度50-55℃，过滤压力0.2-0.3Mpa。
3、发酵培养基与流加培养基的制备
将不同量的浒苔水解液分别配成发酵培养基，灭菌后进行裂殖壶菌的养殖；在发酵培养基配置时，按设定数值添加相应量的水解液与其余营养物质的，以进行后续的发酵实验。其中，培养基中水解液的用量是根据生物量和DHA含量而确定的，其余营养物质的用量则可以根据裂殖壶菌生长时所需的离子导电率、营养盐消耗及离子平衡进行计算而确定。
在本实施例中，其余营养物质的用量是根据裂殖壶菌生长时所需的离子导电率、营养盐消耗及离子平衡进行计算而得的，我们计算并首选确定了磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钾、磷酸钠物质的用量分别为：磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L。
计算的过程包括：用电导率仪测试正产的海水培养基配置时的导电率，用其他离子取代腐蚀性强的氯离子，结合生长实验菌液培养前后离子浓度的变化，估算大致的离子用量；各物质的用量基本是一个变量，为了简化培养工艺并确保效果，特选取了上述的定点用量作为其余营养物质用量。
为考查不同水解液添加量对生物量和DHA含量的影响，淡水配置了浓度分别100-1000mL/L的培养基，将裂殖壶菌于其中摇瓶培养48小时，以确定不同水解液添加量对生物量和DHA含量的影响，实验结果见表1所示。
表1裂殖壶菌在不同水解液配置的培养基中生长情况
Figure BDA0002319842080000081
根据表1的根据摇瓶培养实验结果，我们确定了最优的水解液的用量为300-400mL/L。
从而，可以确定发酵培养基的较佳配置为：淡水配置，每升培养基中浒苔水解液50-500mL，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1.5g，硫酸钾4g，磷酸钠5g；最佳配置为：淡水配置，浒苔水解液300-400mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L。
流加实验之前，根据发酵过程裂殖壶菌生长曲线、各阶段对营养物质的消耗等因素，确定初步的流加步骤，设定各阶段的培养参数；并根据该优化后的参数，进行后续的实验。
为确定流加培养基的配置，考查裂殖壶菌在不同水解液配置的流加培养基流加生长情况，培养时间设定为100h，在10L发酵罐中补料培养实验，补料体积为发酵体积的1/4，实验结果如表2所示。整个补料体积为发酵体积的1/4，整个发酵维持在22±0.5℃，搅拌转速100rpm。
表2裂殖壶菌在不同水解液配置流加培养基流加生长情况
Figure BDA0002319842080000082
根据表2所示的培养100h的实验结果，我们确立了补料实验补料液中营养盐的用量。发酵培养基的较佳配置为：浒苔水解液300-400mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L；最佳配置为：浒苔水解液500-600mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
4、发酵体系的设置
按以下条件设置发酵体系，发酵中采用流加培养的方式，且在不同阶段，采用不同的发酵控制参数。
培养体系设计：我们采用的裂殖壶菌培养体系为10L、200L、1000L的培养体系；其中：10L发酵罐中培养体积为6L，200L发酵罐中培养体积为120L，1000L发酵体系中培养体积为650L。
接种量设计：每一级发酵罐体系中，裂殖壶菌种子接种量为5-10％。
根据发酵培养中营养盐物质的消耗，我们初步确定从培养的12h开始补料，0-12h控制培养温度为22±0.5℃，通气量为1vvm，转速为100rpm；更佳地，还包括：12-24h，补料液中浒苔水解液500mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/15；培养温度20-25℃；通气量为1vvm；100rpm；24-96h，补料液中浒苔水解液500mL/L，补料总体积为发酵液体积的1/4；发酵温度30±0.5℃；通气量为2vvm；80rpm；96h，发酵液中补入NaAc和FeSO4，使发酵液中NaAc0.5g/L，FeSO4 0.05g/L；发酵温度21±0.5℃；通气量为0.3vvm；50rpm。
从而可以形成了以下的流加补料方式：
0-12h，不补料，培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm。
12-24h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/20-1/15；培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm。
24-96h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/5-1/4；发酵温度28-32℃；通气量为1-2vvm；50-80rpm。
96-100h，发酵液中补入NaAc和FeSO4，使发酵液中NaAc 0.1-0.5g/L，FeSO4 0.05-0.1g/L；发酵温度20-22℃；通气量为0.1-0.3vvm；30-50rpm。
5、裂殖壶菌的收集和干燥
发酵结束后，将裂殖壶菌发酵液用离心机进行分离，离心分离后的物料含固量在25％左右；将其打入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥塔的蒸发量为250kg/h，进口温度为175℃，出口温度为70℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
为考查不同发酵培养参数对实验结果的影响，设计了3个不同的补料条件，按培养100h，补料体积为发酵体积的1/4，进行实验，测量其生物量和干燥后的DHA干重，实验结果如表3所示。
表3 3次发酵培养的参数及结果
Figure BDA0002319842080000101
从表3的实验结果可以看出，本发明的生产工艺具有明显的优势。
具体来说，在目前的裂殖壶菌的发酵生产中，通常的发酵时间是120h，生物量一般在150g/L左右，有少数生物量能超过200g/L，极少数能够达到250g/L左右，而生产的DHA一般是15g/L，有极少数能够达到50g/L。而在本发明中，由于采用了适合裂殖壶菌发酵的培养工艺，裂殖壶菌生长迅速，其在100h的培养中生物量能够达到280g/L甚至更高的浓度，DHA的产量能够达到74-83g/L。同时，表3的3种补料条件下，各自的效果也有所差异，相对来说，后两次的效果更佳；特别是第3次试验，其生物量和DHA含量分别达到了299.7g/L和27.8(％干重)。
此外，本发明所采用的浒苔提取液价格低廉，浒苔生产所需营养条件低，生产迅速，采收方便。考虑水解液的制作成本，其成本经核算只有通常普通培养基(含大量葡萄糖、蛋白胨等的传统培养基)的1/3-1/2，在成本上具有巨大的优势。
应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种裂殖壶菌的发酵生产方法，其特征在于，包括：
1)浒苔水解液制备的步骤：
干浒苔的粉碎：将干浒苔用粉碎机粉碎，以得到干浒苔粉；
浒苔水解：向水解罐内加入干浒苔粉和水，根据设定的实验条件对浒苔进行水解，以得到浒苔水解物料；
水解液过滤：将水解物料打入板框压滤机以进行固液分离，依设定的过滤条件，对所得滤液进行过滤，以得到水解液；
2)发酵培养基与流加培养基制备的步骤：
将浒苔水解液与其他营养物质配置成发酵培养基和流加培养基，灭菌后进行裂殖壶菌的发酵生产；
3)发酵体系设置的步骤：
发酵罐体系中，裂殖壶菌种子的接种量为5-10％；采用流加补料方式进行发酵，包括：
0-12h，不补料，培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm；
12-24h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/20-1/15；培养温度20-25℃；通气量为0.5-1vvm；100-150rpm；
24-96h，补料液，料液组成：浒苔水解液350-500mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，硫酸钠15g/L；匀速补料，补料总体积为发酵液体积的1/5-1/4；发酵温度28-32℃；通气量为1-2vvm；50-80rpm；
96-100h，发酵液中补入NaAc和FeSO4，使发酵液中NaAc 0.1-0.5g/L，FeSO4 0.05-0.1g/L；发酵温度20-22℃；通气量为0.1-0.3vvm；30-50rpm；
4)收集和干燥的步骤：
发酵结束后，将裂殖壶菌发酵液用离心机进行分离，再经喷雾干燥塔喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中浒苔的水解条件为：向水解罐内加入质量比为1:1的干浒苔粉和水，加入终浓度分别为10-15g/L的碳酸氢钠和2-5g/L的氢氧化钠，压力升至0.1-0.20MPa，加热至30-60℃，保温时间40min-80min，冷却后用硫酸或磷酸调节pH至6.5-7，即得浒苔水解物料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，碳酸氢钠和氢氧化钠的添加量分别为12-14g/L和4-5g/L，加热温度为50-55℃，保温时间50-60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的过滤条件为：板框压滤机的有效过滤面积为80-100m2，采用100-600目滤布，过滤温度20-80℃，过滤压力0.05-0.4Mpa；所得滤液为浒苔水解液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，水解液过滤条件为：采用250-300目滤布，过滤温度50-55℃，过滤压力0.2-0.3Mpa。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，发酵培养基为：淡水配置，浒苔水解液50-500mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L；流加培养基：淡水配置，浒苔水解液250-750mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：浒苔水解液300-400mL/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾4g/L，磷酸钠5g/L，补料培养基的配方为：浒苔水解液500-600mL/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸钾12g/L，磷酸钠15g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，离心分离后的物料含固量应控制在20-30％；将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为200-300kg/h，进口温度为175-190℃，出口温度为70-90℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，离心分离后的物料含固量控制在25％左右，将其打入喷雾干燥塔，喷雾干燥塔的蒸发量为250kg/h，进口温度为175℃，出口温度为70℃；经喷雾干燥后获得的干粉即为裂殖壶菌干粉，快速避光、真空冷藏保存。
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