CN104388486A - 花生四烯酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

花生四烯酸的制备方法，涉及花生四烯酸。对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，在基础培养基分批发酵，在优化培养基中以酵母粉和玉米浆为氮源分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，对高山被孢霉在优化培养基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养，将优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉，得混合氮源优化培养基；对高山被孢霉在混合氮源优化培养基中分批发酵；对高山被孢霉高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干菌体、油脂和ARA。

Description

花生四烯酸的制备方法

技术领域

本发明涉及花生四烯酸，尤其是涉及花生四烯酸的制备方法。

背景技术

花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称ARA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双键，因此被认为是人体必需脂肪酸，是许多二十碳衍生物如前列腺素E₂(PGE₂)、前列环素(PGI₂)、血栓烷A₂(TXA₂)、白三烯Leukotirene B₄(LTB₄)和C₄(LTC₄)的直接前体。ARA还具有调节体内多种离子通道作用，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理功能。同时研究表明，花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意义，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防与治疗也有显著的效果(Roger et al.Biotechnology Bioengineering，2010,9(20):245-257)。因此，花生四烯酸既是一种营养强化剂，又是人类重要的保健品。ARA作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的作用，应用前景广阔。

ARA主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但ARA在动物组织中含量低，来源也有限，而微生物发酵法则为生产ARA开辟了新途径，它具有不受原材料及气候限制、生长周期短、培养工艺简单、ARA含量高等特点，近年来已成为国内外研究的热点。国际上开展产多不饱和脂肪酸(PFUAs)的微生物研究主要集中在以下几个方面：(1)产PFUAs菌种的分离与选育；(2)培养条件及发酵工艺的优化；(3)培养方式的研究(包括批式、补料、连续培养工艺等)；(4)PFUAs的分离纯化及结构鉴定。目前，人们仅发现接合菌纲是比较具有研究价值的的一个纲，而且普遍看好被孢霉，认为它是生产ARA、EPA、DHA最有潜力的菌种。目前，日本、美国等国家已经先后问世了ARA的发酵产品，国内在这一领域的研究起步晚，虽对微生物发酵生产ARA方面作了一些研究，但还存在着生物量偏低，油脂含量较低等问题，离大规模的工业化生产仍有一定的距离。

中国专利CN101613724公开一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法，包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养；再转接于装有发酵培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以质量百分比计为10％～90％；发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品，霉菌生物体经非极性溶剂浸提后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌粕，该发明利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放。

发明内容

本发明的目的在于提供花生四烯酸的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取4mL种子液接入装有50mL基础培养基(葡萄糖40g/L；酵母粉5g/L；MgSO₄-7H₂O 0.1g/L；KH₂PO₄0.5g/L；CaCO₃0.05g/L；ZnSO₄-7H₂O 0.1g/L；pH6.0)的250mL三角瓶，28℃、150rpm培养5～6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L；酵母粉或玉米浆10g/L；谷氨酸1.0g/L；MgSO₄-7H₂O0.1g/L；KH₂PO₄2.0g/L；CaCO₃0.05g/L；ZnSO₄-7H₂O 0.1g/L；混合微量元素1mL/L；混合维生素1mL/L；pH调至6.0；

2)对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了2L分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干菌体、油脂和ARA。

在步骤1)中，所述混合微量元素可包括FeCl₃·6H₂O,、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、NiSO₄·6H₂O等；所述混合维生素可包括维生素B₁₂、生物素、维生素B₁、泛酸钙等。

在步骤2)中，所述发酵的条件可为：将培养3d的液体种子，按10％接种量接种于基础培养基中，装液量1.5L，初始葡萄糖浓度为60g/L，在28℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm；所述干菌体可得21g/L，油脂可得9g/L，ARA可得3.8g/L。

所述高山被孢霉可以接种适量的被孢霉至载有培养基的摇瓶中，置于摇床上培养，转速为100～300rpm，较好的为150～200rpm。

本发明涉及的培养基的组成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是较适宜的碳源，来源简单，价格低廉，使用量为30～80g/L。对于摇瓶种子培养，一般将使用量降低至10～30g/L，可根据培养的时间及所要求的生物量密度来选择用量。具体合适的用量选择，本领域的技术人员可以通过相关操作确定碳源的种类及合适用量。同时，可视微生物的生长情况，选择一次性加入全部碳源或者分批补入。氮源可以选择酵母粉、玉米浆、蛋白胨、大豆粉等中的至少一种，酵母粉或者玉米浆被认为是比较好的氮源，添加浓度在5～15g/L，本领域的技术人员可以通过相关实验操作确定氮源的种类及用量。

可选择使用单一氮源或混合氮源，更好的结果是使用混合氮源(玉米浆、酵母粉)为发酵罐培养的适宜氮源，且二者的质量比例对于油脂的积累影响较大，可利用响应面分析等统计方法进一步优化碳氮源的组合，较好的两种氮源比例为3:8(w/w)。

温度低于20℃高山被孢霉将会开始大量产生EPA，而培养要求得到较高含量的ARA，同时尽量减低或避免产生EPA，培养温度通常保持在25～30℃。微生物发酵生产PUFAs，其最高产量一般是在对数期后期或稳定期前期，因此要在最短的时间内获得最大可能的生物量及总脂肪酸的含量，一般来说，最适收获ARA的时间是在第5～6天。

真菌生长的pH范围较广，更偏好于在偏酸环境中生长，pH在4.0至8.0之间均可以正常生长，本发明的实施过程中发现，初始pH 6.0～6.5，培养过程中pH在7～8之间有利于ARA的积累；pH 4～5之间有利于生物量的积累，在培养过程中可分阶段的调节pH水平以适应所要求的生长环境。

接种量可以在2％至14％(V/V)，接种量低，生物量达不到所要求的水平，接种量高，在生物量积累到一定程度将会抑制菌体的继续生长，在摇瓶培养中，接种控制在3％～5％(V/V)，而在发酵罐培养中，接种量控制在8％～10％(V/V)能得到较好的结果。

培养基中碳氮比影响真菌油脂的积累，碳氮比在10∶1至60∶1之间，较好的是40∶1至50∶1，在培养过程中可以选择灭菌前一次性加入或培养开始后分批加入。

微生物的生长需要维生素等生长因子，当培养环境中缺乏维生素时，细胞内RNA、DNA以及蛋白质的含量会下降。添加维生素B₁、维生素B₁₂、生物素及泛酸钙最有利于ARA的积累，其用量分别在50～150mg/L、300～600μg/L、400～600μg/L及80～150mg/L之间。谷氨酸可以提高细胞中G6PDH的活性，为被孢霉细胞的生长提供核酸原料，从而与花生四烯酸的合成紧密相关，在培养基中添加0.5～2g/L的谷氨酸有利于ARA的积累。

为了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存过程中的稳定性，可对菌种进行了高糖驯化培养，驯化后的结果发现，菌种的耗糖能力及产油能力明显提升，ARA的含量呈倍数增长。

发酵培养过程可采用分批发酵或补料-分批发酵，分批发酵要求营养物质一次性加入，营养物含量过高可能在培养前期抑制真菌的生长而延长延滞期，发酵周期随之延长，而营养物含量过低，在培养后期无法满足真菌生长需要的营养补充。本领域的技术人员，可以通过一系列实验操作确定适宜的碳氮营养物含量；补料-分批发酵培养过程中，必须对培养液中的营养物质进行检测，特别是当葡萄糖浓度小于5g/L时，需要及时补充葡萄糖，这是需要分别灭菌的。上述两种培养方式，在实施过程中，可能会出现起泡现象，这是不希望出现的，可以选择在灭菌之间加入适量消泡剂或者在起泡现象出现时，适时地加入消泡剂防止产生过量泡沫。

根据上述优化高山被孢霉的发酵条件，能够获得较高的生物量及总油脂含量，可以每12h或24h取样测定生物量、油脂及ARA含量，或者培养结束收获生物质测定。

可以用多种方法对生物质体进行收获，例如过滤、真空抽滤、离心、膜分离、絮凝沉淀等，一般的，选择成本低且方便操作的过滤或真空抽滤收获生物质体。收获后，可以选择采用干菌体或湿菌体进行油脂的萃取，本实施过程中，对菌体进行干燥至含水量小于4％，此时，使用丙酮、乙醇、异丙醇等醇类、烷烃如正己烷、正庚烷等萃取油脂是较适宜的，但正己烷最佳。干燥后的菌体加入正己烷，进行研磨、匀浆或减法破壁萃取，得到的萃取液进行离心分离取上层，蒸发除去其中的有机溶剂，得到总油脂即粗油。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：原料易购、价格适中、培养基配制方便、发酵工艺简便、花生四烯酸合成稳定、油脂产量为16～28g/L，其中花生四烯酸产量在6.5～16g/L，解决了花生四烯酸的发酵生产效率和产量低的问题、适合工业化生产。

附图说明

图1为高山被孢霉在基础培养基中的发酵结果。

图2高山被孢霉在添加了维生素、氨基酸和微量元素的培养基中的发酵结果。

图3高山被孢霉在实施例3培养基中添加了混合氮源的发酵结果。

图4驯化后的高山被孢霉在实施例4中的培养基中的发酵结果。

图1～4分别为实施例2～5中不同培养基对高山被孢霉的生物量、总油脂和ARA产量的影响结果。在图1～4中，横坐标为培养时间(h)，左纵坐标为葡萄糖消耗情况Glucose(■,g/L)，右纵坐标分别为生物量Biomass(●,g/L)，总油脂Total fatty acid(★,g/L)和ARA产量(▲,g/L)。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明。

实施例1.利用高山被孢霉生产ARA

在一个250mL摇瓶中培养高山被孢霉，载液量为50mL的活化培养基，150rpm，28℃，活化3天。再将活化后的菌株接入基础培养基，装液量250mL的摇瓶装入50mL的基础培养基，接种量10％(v/v),于28℃往复式摇床培养5～6d，转速150rpm,28℃，培养5d后收获，抽滤收获生物质，将其恒温干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸发除去有机容剂后，得到总油脂5g/L。

活化培养基组成(g/L)：

基础培养基组成(g/L)：

实施例2.利用基础培养基在发酵罐培养高山被孢霉生产ARA

2L发酵罐培养，装液量1.5L基础培养基(如实施例1)，将初始葡萄糖浓度定为60～65g/L，单独灭菌，发酵温度维持在28℃，初始搅拌转速150～200rpm，通气量1vvm的条件下对高山被孢霉菌进行分批发酵培养，灭菌前将pH调节至6.5～7.0，灭菌后的初始pH在6.0～6.5，培养12h后溶氧开始迅速下降，生长进入对数期，培养48h之后生长开始进入稳定期，在整个生长周期中，初始pH值为6.0～6.5，过程中pH值先升高后降低再升高，随着稳定期的到来，最后pH值稳定在7.0～7.9之间；溶氧随着生物量的增加迅速下降，在对数生长期维持溶氧在0.5％～10％。

培养期间每12h取样进行生物质及脂肪酸的分析。培养至第168h，开始收获菌体，采用实施例1的方法，获得干菌体18g/L，总油脂7g/L，ARA 2.7g/L，发酵液中的葡萄糖浓度从初始的60g/L降至15g/L，具体结果如图1所示。

实施例3.氨基酸、维生素和微量元素对高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影响

在实施例2的基础培养基中添加了生长因子(维生素、氨基酸)，以及微量元素来提高产量。

加入的生长因子包括：

维生素配成500×浓缩液，使用0.2μm无菌过滤膜过滤除菌，并放置4℃冰箱保存，待接种前直接加入基础培养基中，添加量为2mL/L。谷氨酸在灭菌前配制基础培养基时加入，随培养基一同灭菌。

加入的微量元素包括(g/L)：

微量元素配成1000×浓缩液(即1L培养基中加入1mL微量元素浓缩液)，调至pH 7。使用0.2μm无菌过滤膜过滤除菌，并放置4℃冰箱保存，待接种前直接加入基础培养基中。

为了制备接种菌体，将使用的种子接种在3个含50mL活化培养基的摇瓶中，在28℃、150rpm培养3天后，菌体在发酵液中呈现的形态为球状，直径为2～4mm，或松散的菌丝聚集体。接种至载液量为1.5L的2L发酵罐，接种量10％(V/V)，若种子在摇瓶中生长的密度较低，则在接种至发酵罐时适当的增加接种量。发酵罐中的培养基为添加了生长因子(维生素、氨基酸)和微量元素的优化培养基，进行分批发酵培养。其中初始葡萄糖浓度为60～65g/L，分开灭菌，120℃灭菌30min。

发酵罐的参数如下：温度：28℃；通气：0.5～1vvm；pH：用25％氨水维持在6.0左右；初始搅拌转速：150rpm。

第12h，溶氧开始迅速下降，pH也开始下降，菌体生长进入对数期，将转速调至200rpm，此后1～2h内开始产生泡沫，加入适量消泡剂。此后将转速调至250rpm。

接种时，发酵罐中的菌体是直径为1～2mm的小球状，外缘光滑，培养至12h开始，球体开始变大，至24h，球体形状更清晰，继续变大，48h开始罐内菌体密度增大，至72h，球体外缘显得蓬松，且出现类似羽毛絮状的松散菌丝体，这可能由于较大的球状菌体开始解体，至120h，球的直径在2～4mm之间，同时形成了许多松散的菌丝聚集体。每隔12h对发酵罐进行取样进行生物量及脂肪酸的分析，168h后发酵结束，罐内发酵液的最终体积为1.2L。获得干菌体21g/L，总油脂9g/L，ARA 3.8g/L，发酵液中的葡萄糖浓度从初始的65g/L降至13g/L，具体结果如图2所示。

实施例4.混合氮源对高山被孢霉高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影响

这一组实验通过使用混合氮源来进一步提高产量，过程与实施例3基本相同，添加的混合氮源的组成成分及比例通过一系列实验得到。

添加的混合氮源包括(g/L)：

玉米浆            3

酵母粉            7

发酵罐在第11h，溶氧开始迅速下降，在约第14h开始产生少量泡沫，通过人工加入消泡剂控制。至24h，菌体为直径1～2mm的球状，至48h，菌体为直径2～3mm的球状，外缘光滑，至72h，开始出现松散的羽毛絮状菌丝聚集体，球体外缘松散。每隔12h对发酵罐进行取样进行生物量及脂肪酸的分析，168h后收获，获得干菌体36g/L，总油脂16g/L，ARA6.5g/L，发酵液中的葡萄糖浓度从初始的60g/L降至5g/L，具体结果如图3所示。

实施例5.利用驯化后的高山被孢霉生产ARA

为使高山被孢霉在发酵培养过程中，对营养物质的吸收更为充分，减少原料的浪费，提高菌种耗糖能力，对菌种进行了驯化，主要通过固体培养基及液体培养基的逐级高糖驯化，提高菌体的耗糖能力，且驯化后的菌种均呈现为有利于油脂积累的外缘带刺状的松散球体。利用该驯化后的菌种，使用实施例4中所述的优化后培养基进行分批补料培养，及当葡萄糖浓度降至10g/L左右，流加600g/L葡萄糖，使残糖控制在10g/L左右，其余操作过程与实施4相同。

发酵过程中用25％氨水调节控制pH在6.0～6.5。

第12h，菌体开始生长,菌体为外缘刺状的小球，直径1～2mm，之后随着菌体大量生长，呈现为外缘刺状的松散的球状，直径2～5mm，此时pH开始下降，这是糖代谢先产生酮酸等有机酸，而后被利用再逐渐上升，此时，允许pH降至4.5，至72h，pH会随着菌体进入稳定期缓慢回升，此时菌体主要为外缘刺状的松散的球状，其次为羽毛絮状的菌丝聚集体，至98h，将pH缓慢升至6.5～7.5之间，但不高于8.0。每隔12h对发酵罐进行取样进行生物量及脂肪酸的分析，

培养168h后开始收获，获得干菌体58g/L，总油脂28g/L，ARA 16g/L，发酵结束时发酵液中的葡萄糖浓度趋于零。根据本实施例进行的分批发酵结果显示，ARA产量较之前已有大幅度提高，具体结果如图4所示。

Claims (4)

1.花生四烯酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取4mL种子液接入装有50mL基础培养基的250mL三角瓶，28℃、150rpm培养5～6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L；酵母粉或玉米浆10g/L；谷氨酸1.0g/L；MgSO₄-7H₂O0.1g/L；KH₂PO₄2.0g/L；CaCO₃0.05g/L；ZnSO₄-7H₂O 0.1g/L；混合微量元素1mL/L；混合维生素1mL/L；pH调至6.0；所述基础培养基的组成为葡萄糖40g/L；酵母粉5g/L；MgSO₄-7H₂O 0.1g/L；KH₂PO₄0.5g/L；CaCO₃0.05g/L；ZnSO₄-7H₂O 0.1g/L；pH 6.0；

2)对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了2L分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干菌体、油脂和ARA。

2.如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述混合微量元素包括FeCl₃·6H₂O,、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、NiSO₄·6H₂O。

3.如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述混合维生素包括维生素B₁₂、生物素、维生素B₁、泛酸钙。

4.如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵的条件为：将培养3d的液体种子，按10％接种量接种于基础培养基中，装液量1.5L，初始葡萄糖浓度为60g/L，在28℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm。