CN110129384B - 一种花生四烯酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花生四烯酸的制备方法，以高山被孢霉(Mortierella alpina)为生产菌株，在发酵过程中流加硝酸铵，通过在发酵的不同时期调节硝酸铵的流加速度分段控制溶氨，以此提高花生四烯酸在总油脂中的比例的方法，进一步提高了花生四烯酸的产量。此外，该方法还具有操作简单、降低发酵成本和提取难度、提高了提取效率、易于在工业化中应用等优势。

Description

一种花生四烯酸的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种通过在发酵过程中流加硝酸铵分段控制溶氨，以此提高花生四烯酸在总油脂中的比例的花生四烯酸的制备方法。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，简称ARA或AA)为5，8，11，14-全顺-二十碳四烯酸，它是通过ω-6系列的脱氢酶由亚油酸转化而来的，为ω-6系列的多不饱和脂肪酸。花生四烯酸(AA)是ω-6系脂肪酸在人体内的代谢枢纽，所有的ω-6系脂肪酸如亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸最终通过链加长和去饱和反应转化为AA，再由AA转化为一系列的活性物质如前列腺素E2，前列环素，血栓素A2和白三烯等二十碳多烯酸衍生物，对细胞和机体的代谢活动具有重要生理作用。
目前大多数工艺都是直接提高花生四烯酸的产量，很少涉及提高花生四烯酸在总油脂中的比例，在不影响总油脂含量的前提下，提高花生四烯酸所占的比例，可进一步提高花生四烯酸的产量。周蓬蓬等通过在发酵培养基中加入毛霉菌油来提高花生四烯酸在总油脂中的比例，可达18.03％(生命科学研究第6卷第3期，毛霉菌油对被孢霉产花生四烯酸的影响)，但上述操作较复杂，生产成本较高，且提高有限。因此，寻找一种操作简单、能够降低发酵成本、易于在工业化中应用的花生四烯酸制备方法很有必要。
发明内容
本发明的提供了一种花生四烯酸的制备方法，包括以可产花生四烯酸的高山被孢霉为生产菌株，在发酵过程中流加硝酸铵，分段控制发酵溶氨大小的步骤，以此提高花生四烯酸在总油脂中的比例。
在优选的实施方案中，所述分段控制溶氨具体包括下述步骤：流加硝酸铵的时间为发酵1h后，在发酵1-50h时控制溶氨300-10000ppm，优选8000-10000ppm；在发酵51h-136h时控制溶氨2000-10000ppm，优选5000-6000ppm；在发酵137h-250h时控制溶氨50-300ppm，优选200-300ppm。
在优选的实施方案中，其中所述的高山被孢霉为Mortierella alpina CICC2560。
在优选的实施方案中，其中所述流加硝酸铵的浓度为0.50-10.0(g/L)。
在优选的实施方案中，所述发酵的温度为23-28℃，优选25℃，所述发酵的时间为240-250h，优选246h。
在优选的实施方案中，还包括下述步骤：
(1)原始菌株的活化：将高山被孢霉菌经PDA平板培养冷冻后获得高山被孢霉的冷冻孢子悬液；
(2)种子培养：将高山被孢霉的冷冻孢子悬液接种于摇瓶培养基中通气培养获得种子培养液；
(3)种子扩大培养：将步骤(2)的种子培养液扩大培养或根据最终发酵罐的大小，将步骤(2)的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液。
在优选的实施方案中，上述步骤(2)种子培养中，转速为180-250rpm，周期为48h-72h，培养温度23-28℃。
在优选的实施方案中，上述步骤(3)种子扩大培养中，接种量为5％-10％(体积比)，培养时间为24h-48h，转速为180-250rpm，培养温度23-28℃。
在优选的实施方案中，所述发酵所用的发酵培养基包括：葡萄糖160-190g/L，酵母抽提粉5.0-8.0g/L，KH2PO43.0-4.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0-3.0g/L，柠檬酸0.50-2.0g/L，NH4NO33.0-4.0g/L，CaCO34.0-6.0g/L，培养基的pH为6.0。
在优选的实施方案中，所述发酵的发酵罐中的接种量为10％-15％(体积比)。
在优选的实施方案中，所述步骤(2)种子培养的种子培养基包括：葡萄糖50.0-66.0g/L，酵母抽提物10.0-20.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2.0g/L，培养基的pH为6.0。
在优选的实施方案中，所述步骤(3)种子扩大培养的种子培养基包括：葡萄糖50.0-66.0g/L，热榨黄豆饼粉10.0-20.0g/L，酵母抽提物10.0-20g/L，柠檬酸0.5-1.0g/L，KH2PO42.0-3.0g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2.5g/L，CaCO32.0-3.0g/L，培养基的pH为6.0。
在优选的实施方案中，为保证培养的顺利进行，所述的发酵培养基、种子培养基的装液量均为20％。
本发明所采用的高山被孢霉是任意可产花生四烯酸的高山被孢霉，例如可购自国家标准品网的Mortierella alpina CICC2560。
本发明通过在发酵过程中流加硝酸铵，通过调节硝酸铵的流加速度控制溶氨大小，提高了花生四烯酸在总油脂中的比例，进一步提高了花生四烯酸的含量，制得的花生四烯酸在总油脂中的比例高达76％，含量约为15g/L，且操作简单，生产成本较低，利于工业化生产。
本发明所述的溶氨是指：发酵培养物中铵根离子的含量。
本发明所述的PDA是指：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
1.菌种：Mortierella alpina CICC2560
2.原始菌株的活化：将高山被孢霉菌接种到PDA平板上，在25±1℃下培养8～10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA平板，刮取菌丝和孢子，用20％甘油制成孢子悬液，然后-80℃冷冻制得高山被孢霉(Mortierella alpina)冷冻孢子悬液。
3.种子培养：将高山被孢霉(Mortierella alpina)冷冻孢子悬液接入装有100ml种子培养基、容量为500ml挡板三角瓶中，25±1℃，200r/m条件下培养70h，制得一级种子液。所述种子培养基包括如下原料：葡萄糖66.0g/l，酵母抽提物15.0g/l，KH2PO42.0g/l，MgSO4·7H2O1.0g/l，调节pH为6.0。
4.种子扩大培养：将步骤3培养好的3L种子液，接种到装有300L种子培养基的500L种子罐中进行培养，接种量10％(体积比)，种子罐控制温度为25±1℃，溶氧控制在30-60％，罐压0.04-0.08Mpa，180-250rpm培养48h。
所述种子培养基包括如下原料：葡萄糖66.0g/L，热榨黄豆饼粉15.0g g/L，酵母抽提物15.0g/L,柠檬酸0.5g/L,KH2PO42.5g，MgSO4·7H2O 2.0g/L，CaCO32.0g/L，培养基的pH为6.0。
5.发酵培养：将步骤4中培养好的300L种子液，接种到装有3T发酵培养基的5T发酵罐中进行培养，接种量10％(体积比)，发酵罐控制温度为25±1℃，溶氧控制在40-60％，罐压0.04-0.08Mpa，培养246h。发酵过程中调节硝酸铵的流加速度分段控制溶氨，流加硝酸铵的时间为发酵1h后，发酵1h-50h溶氨维持在8000-10000ppm，发酵培养51h-136h时控制溶氨5000-6000ppm，发酵培养137h-246h时控制溶氨200-300ppm，最终气相检测发酵液中ARA含量14.26g/l，ARA在总油脂中的比例为76％。
所述的发酵培养基包括：葡萄糖180g/L，酵母抽提粉6.0g/L，KH2PO43.5g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，柠檬酸1.0g/L，NH4NO33.0g/L，CaCO35.0g/L，培养基的pH为6.0。

Claims (11)

1.一种花生四烯酸的制备方法，其特征在于，包括以可产花生四烯酸的高山被孢霉为生产菌株，在发酵过程中流加硝酸铵，分段控制发酵溶氨的步骤，所述分段控制溶氨具体包括下述步骤：流加硝酸铵的时间为发酵1h后，在发酵1-50h时控制溶氨8000-10000ppm；在发酵51h-136h时控制溶氨5000-6000ppm；在发酵137h-250h时控制溶氨200-300ppm；所述发酵所用的发酵培养基包括：葡萄糖160-190 g/L，酵母抽提粉5.0-8.0g/L，KH2PO4 3.0-4.5 g/L，MgSO4•7H2O 1.0-3.0 g/L，柠檬酸0.50-2.0g/L，NH4NO3 3.0-4.0 g/L，CaCO3 4.0-6.0 g/L；所述的高山被孢霉为Mortierella alpina CICC2560。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流加硝酸铵的浓度为0.50-10.0g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为23-28℃，所述发酵的时间为240-250h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为246h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基的pH为6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：
(1)原始菌株的活化：将高山被孢霉菌经PDA平板培养冷冻后获得高山被孢霉的冷冻孢子悬液；
(2)种子培养：将高山被孢霉的冷冻孢子悬液接种于摇瓶培养基中通气培养获得种子培养液；
(3)种子扩大培养：将步骤（2）的种子培养液扩大培养或根据最终发酵罐的大小，将步骤（2）的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）种子培养中，转速为180-250rpm，周期为48h-72h，培养温度23-28℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)种子扩大培养中，接种量为5%-10%体积比，培养时间为24h-48h，转速为180-250rpm，培养温度23-28℃。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)种子培养的种子培养基包括：葡萄糖 50.0-66.0g/L，酵母抽提物 10.0-20.0g/L，KH2PO4 1.0-3.0g/L，MgSO4•7H2O0.5-2.0g/L，培养基的pH为6.0。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)种子扩大培养的种子培养基为：葡萄糖 50.0-66.0g/L，热榨黄豆饼粉 10.0- 20.0g/L，酵母抽提物 10.0-20g/L，柠檬酸0.5-1.0g/L，KH2PO4 2.0-3.0g/L，MgSO4•7H2O 1.5-2.5g/L，CaCO3 2.0-3.0g/L，培养基的pH为6.0。
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