CN109609580B - 一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法 - Google Patents

一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法，所述发酵培养基中添加有叶酸和氟化钠，该发酵培养基添加叶酸和氟化钠为菌体代谢提供缺乏的营养物质，解除糖酵解途径中对原料的浪费，促进HMP途径的代谢强度，有利于代谢目标产物的高效合成，利用该发酵培养基的核黄素的发酵方法为：将发酵种子液转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中培养60～70h，且在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0‑1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5‑1.0%，保证各阶段适当的葡萄糖浓度，降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响，利用该方法进行核黄素发酵，可以使核黄素的产量提高至34.6g/L，与未使用该方法相比产量提高76.53%，发酵周期缩短，减少成本。

Description

一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物及发酵工程技术领域，具体的说是一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法。
背景技术
核黄素（维生素B2，vitaminB2，riboflavin）分子式为C17H20O6N4，分子量为376.36。化学名称为 7,8-二甲基-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-3,10-二氢苯并蝶啶-2,4-二酮，系统命名为7,8-二甲基-10-(1’-D-核糖基)异咯嗪[7,8-dimethy-10-(1’-D-ribityl)soalloxazine]；
核黄素是机体必需微量营养素之一，具有广泛的生理机能，世界卫生组织（WHO）将其列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一，核黄素在医药、食品营养强化剂和饲料添加剂工业中广泛应用；《美国药典》规格的核黄素可制成供口服的片剂，供注射的水溶液，或者可以含有烟酰胺或其增溶剂。作为动物饲料的一种添加剂，核黄素通常加入28mg/kg，具体的用量取决于动物的种类和年龄；
核黄素有三种方法：（1）生物发酵法：生物发酵法又分为传统的酵母菌发酵法和新型的基因工程菌发酵法；（2）化学合成法：以D-葡萄糖为原料，经化学反应合成；（3）化学半合成法：以D-葡萄糖为原料经发酵生成D-核糖，再以D-核糖为原料进行化学合成。目前在工业上应用的核黄素方法是化学半合成法、酵母菌发酵法和基因工程菌发酵法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法，该发酵培养基添加叶酸和氟化钠为菌体代谢提供缺乏的营养物质，解除糖酵解途径中对原料的浪费，促进HMP途径的代谢强度，有利于代谢目标产物的高效合成；并提供一种中间流加糖控制策略，保证各阶段适当的葡萄糖浓度，降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基包含以下组分：葡萄糖15～30g/L，面包酵母5～15g/L，酵母浸粉1～4g/L，棉籽饼粉5～9g/L，玉米浆10～30ml/L，甜菜糖蜜10～30ml/L，磷酸二氢钾0.2～0.7g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，硫酸铵1～5g/L，硫酸镁0.4～0.8g/L，氟化钠10～40mg/L，叶酸0.5～3mg/L，红霉素5～20mg/L，氯霉素5～20mg/L。
进一步的，所述发酵培养基还包括0.6～1mL/L的消泡剂。
进一步的，所述发酵培养基中氟化钠的含量为20mg/L。
进一步的，所述发酵培养基中叶酸的含量为2mg/L。
一种核黄素的发酵方法，包括以下步骤：
步骤一、将核黄素菌种进行活化，将活化后的核黄素菌种接种至种子培养基中，在37～39℃温度下，200～700rpm转速下培养13～16h，制得发酵种子液，备用；
步骤二、将发酵种子液按照体积百分比10～15%的接种量转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中，在温度为37～40℃，溶氧量为15～30%，pH为6.7～7.0的条件下培养60～70h，制得核黄素。
进一步的，所述核黄素菌种进行活化的具体步骤为：将核黄素菌种接种至活化斜面固体培养基上，在37～40℃的条件下培养15～20h；
所述斜面固体培养基包含如下组分：酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2。
进一步的，所述核黄素菌种为枯草芽孢杆菌属。
进一步的，步骤一中所述种子培养基包含如下组分：蔗糖20～30g/L，面包酵母5～15g/L，棉籽饼粉5～9g/L，玉米浆10～50ml/L，甜菜糖蜜4～6ml/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，磷酸氢二钾2～4g/L，硫酸铵3～8g/L，硫酸镁0.4～0.8g/L，红霉素5～20mg/L，氯霉素5～20mg/L。
进一步的，所述种子培养基还包括0.4～0.8mL/L的消泡剂。
进一步的，步骤二中在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明在核黄素发酵培养基中添加叶酸，可解除营养供应的瓶颈，延长代谢产物的时间，提高核黄素的产量；
（2）本发明在核黄素发酵培养基中添加氟化钠，可减少糖酵解途径对营养的利用，间接促进核黄素代谢途径中HMP途径的通量，提供核黄素合成所需要的前体物质，促进代谢通量，提高核黄素的产量；
（3）与传统的化学法和酶法相比，本发明设备简单，绿色污染小，符合当前的低碳环境，成本低，适合大规模；
（4）本发明使用的微生物菌株，遗传标记稳定不易丢失，传十代以上转接，产量基本保持稳定；
（5）使用本发明的方法进行核黄素的发酵，可以使通向核黄素合成代谢中前体物充足，从而使核黄素的产量提高至34.6g/L，与未使用该方法相比产量提高76.53%，发酵周期缩短至60h，减少成本。
（6）本发明提供了一种中间流加糖控制策略，保证各阶段适当的葡萄糖浓度，降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
以下实施例中发酵产物核黄素的含量测定所采用的分析方法如下：
色谱柱为Agilent ZORBAXSB—C18(150min×4.6mm,3.5μm)；流动相为甲醇——0.35%磷酸的0.01mol／L庚烷磺酸钠溶液(26：74);检测波长267nm；流速1.0ml／min；柱温35℃，进样量为20μL。精确称取核黄素的标准品，用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液；将预处理的待测发酵液样品用去离子水稀释至适当的浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤，作为发酵样品溶液待检测，发酵样品根据峰面积计算核黄素产量。
实施例1：
（1）以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株，将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基（酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2）上，38℃培养18h，得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌；
（2）用接种环刮取步骤（1）制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基（蔗糖25g/L，面包酵母10g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜5ml/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.6g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.6mL/L）中，38℃，通过调整转速（200～700rpm）、风量、罐压控制溶氧20～30%，培养15h，得到种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按照体积百分比15%（v/v）的接种量转接至装有核黄素发酵培养基（葡萄糖25g/L，面包酵母10g/L，酵母浸粉2g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜20ml/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁0.5g/L，氟化钠10mg/L，叶酸0.5mg/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中，在38.5℃，溶氧量15～30%，pH6.8（NH3·H2O调节）的条件下，进行发酵，发酵过程中，依据溶氧变化情况，分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%，发酵60h结束。
经HPLC检测，本实施例中核黄素产量达到27.3g/L。
实施例2：
（1）以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株，将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基（酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2）上，38℃培养18h，得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌；
（2）用接种环刮取步骤（1）制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基（蔗糖25g/L，面包酵母10g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜5ml/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.6g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.6mL/L）中，38℃，通过调整转速（200～700rpm）、风量、罐压控制溶氧20～30%，培养15h，得到种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按照体积百分比15%（v/v）的接种量转接至装有核黄素发酵培养基（葡萄糖25g/L，面包酵母10g/L，酵母浸粉2g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜20ml/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁0.5g/L，氟化钠20mg/L，叶酸2mg/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中，在38.5℃，溶氧量15～30%，pH6.8（NH3·H2O调节）的条件下，进行发酵，发酵过程中，依据溶氧变化情况，分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%，发酵60h结束。
经HPLC检测，本实施例中核黄素产量达到34.6g/L。
实施例3：
（1）以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株，将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基（酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2）上，38℃培养18h，得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌；
（2）用接种环刮取步骤（1）制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基（蔗糖25g/L，面包酵母10g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜5ml/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.6g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.6mL/L）中，38℃，通过调整转速（200～700rpm）、风量、罐压控制溶氧20～30%，培养15h，得到种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按照体积百分比15%（v/v）的接种量转接至装有核黄素发酵培养基（葡萄糖25g/L，面包酵母10g/L，酵母浸粉2g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜20ml/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁0.5g/L，氟化钠40mg/L，叶酸3mg/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中，在38.5℃，溶氧量15～30%，pH6.8（NH3·H2O调节）的条件下，进行发酵，发酵过程中，依据溶氧变化情况，分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%，发酵60h结束。
经HPLC检测，本实施例中核黄素产量达到31.3g/L。
对比例1：
（1）以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株，将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基（酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2）上，38℃培养18h，得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌；
（2）用接种环刮取步骤（1）制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基（蔗糖25g/L，面包酵母10g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜5ml/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.6g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.6mL/L）中，38℃，通过调整转速（200～700rpm）、风量、罐压控制溶氧20～30%，培养15h，得到种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按照体积百分比15%（v/v）的接种量转接至装有核黄素发酵培养基（葡萄糖25g/L，面包酵母10g/L，酵母浸粉2g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜20ml/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁0.5g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.8ml/L）的50L发酵罐中，在38.5℃，溶氧量为15～30%，pH6.8（NH3·H2O调节）的条件下，进行发酵，发酵过程中，依据溶氧变化情况，前40h维持葡萄糖浓度1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%，发酵60h结束。
经HPLC检测，本实施例中核黄素产量达到，19.6g/L。
对比例2：
（1）以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株，将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基（酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2）上，38℃培养18h，得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌；
（2）用接种环刮取步骤（1）制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基（蔗糖25g/L，面包酵母10g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜5ml/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.6g/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.6mL/L）中，38℃，通过调整转速（200～700rpm）、风量、罐压控制溶氧20～30%，培养15h，得到种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按照体积百分比15%（v/v）的接种量转接至装有核黄素发酵培养基（葡萄糖25g/L，面包酵母10g/L，酵母浸粉2g/L，棉籽饼粉7g/L，玉米浆20ml/L，甜菜糖蜜20ml/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁0.5g/L，氟化钠20mg/L，叶酸2mg/L，红霉素10mg/L，氯霉素10mg/L，消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中，在38.5℃，溶氧量15～30%，pH6.8（NH3·H2O调节）的条件下，进行发酵，发酵过程中，依据溶氧变化情况，发酵过程中维持发酵液中残余葡萄糖浓度为1.0-1.5，发酵60h结束。
经HPLC检测，本实施例中核黄素产量达到23.2g/L。
综上所述，由实施例1～3和对比例1、对比例2可以看出，在发酵培养基中加入叶酸0.5～3mg/L，氟化钠10～40mg/L，可以提高核黄素的产量，这表明叶酸和氟化钠的添加弥补了发酵过程中营养物质不足，解除代谢途径中其它途径对营养物质的利用的问题，且提供了一种中间流加糖控制策略，保证各阶段适当的葡萄糖浓度，降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响，提高核黄素的产量，通过实施例1～3以看出，叶酸和氟化钠添加量的不同，对于核黄素的积累有影响，其中，实施例2中发酵培养基中添加叶酸2mg/L、化钠20mg/L，且发酵过程中前40h维持葡萄糖浓度1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5%-1.0%，可以显著提高核黄素的产量，核黄素含量提高76.53%，可以更好的维持核黄素生产菌枯草芽孢杆菌生产核黄素的能力，使核黄素的产量达到较高水平。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种核黄素的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将核黄素菌种进行活化，将活化后的核黄素菌种接种至种子培养基中，在37～39℃温度下，200～700rpm转速下培养13～16h，制得发酵种子液，备用，所述核黄素菌种为枯草芽孢杆菌；
步骤二、将发酵种子液按照体积百分比10～15%的接种量转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中，在温度为37～40℃，溶氧量为15～30%，pH为6.7～7.0的条件下培养60～70h，制得核黄素；
在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度，前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%，40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%；
核黄素的发酵培养基包含以下组分：葡萄糖15～30g/L，面包酵母5～15g/L，酵母浸粉1～4g/L，棉籽饼粉5～9g/L，玉米浆10～30ml/L，甜菜糖蜜10～30ml/L，磷酸二氢钾0.2～0.7g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，硫酸铵1～5g/L，硫酸镁0.4～0.8g/L，氟化钠10～40mg/L，叶酸0.5～3mg/L，红霉素5～20mg/L，氯霉素5～20mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基还包括0.6～1mL/L的消泡剂。
3.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基中氟化钠的含量为20mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基中叶酸的含量为2mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：所述核黄素菌种进行活化的具体步骤为：将核黄素菌种接种至活化斜面固体培养基上，在37～40℃的条件下培养15～20h；
所述斜面固体培养基包含如下组分：酵母浸出粉5g/L，NaCl 5g/L，麦芽糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，红霉素10u/mL，氯霉素10u/mL，pH7.0～7.2。
6.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：步骤一中所述种子培养基包含如下组分：蔗糖20～30g/L，面包酵母5～15g/L，棉籽饼粉5～9g/L，玉米浆10～50ml/L，甜菜糖蜜4～6ml/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，磷酸氢二钾2～4g/L，硫酸铵3～8g/L，硫酸镁0.4～0.8g/L，红霉素5～20mg/L，氯霉素5～20mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种核黄素的发酵方法，其特征在于：所述种子培养基还包括0.4～0.8mL/L的消泡剂。
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