CN109609580A - 一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法,所述发酵培养基中添加有叶酸和氟化钠,该发酵培养基添加叶酸和氟化钠为菌体代谢提供缺乏的营养物质,解除糖酵解途径中对原料的浪费,促进HMP途径的代谢强度,有利于代谢目标产物的高效合成,利用该发酵培养基的核黄素的发酵方法为:将发酵种子液转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中培养60~70h,且在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0‑1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5‑1.0%,保证各阶段适当的葡萄糖浓度,降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响,利用该方法进行核黄素发酵,可以使核黄素的产量提高至34.6g/L,与未使用该方法相比产量提高76.53%,发酵周期缩短,减少成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及发酵工程技术领域,具体的说是一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法。
背景技术
核黄素(维生素B2,vitaminB2,riboflavin)分子式为C17H20O6N4,分子量为376.36。化学名称为 7,8-二甲基-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-3,10-二氢苯并蝶啶-2,4-二酮,系统命名为7,8-二甲基-10-(1’-D-核糖基)异咯嗪[7,8-dimethy-10-(1’-D-ribityl)soalloxazine];
核黄素是机体必需微量营养素之一,具有广泛的生理机能,世界卫生组织(WHO)将其列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一,核黄素在医药、食品营养强化剂和饲料添加剂工业中广泛应用;《美国药典》规格的核黄素可制成供口服的片剂,供注射的水溶液,或者可以含有烟酰胺或其增溶剂。作为动物饲料的一种添加剂,核黄素通常加入28mg/kg,具体的用量取决于动物的种类和年龄;
核黄素有三种方法:(1)生物发酵法:生物发酵法又分为传统的酵母菌发酵法和新型的基因工程菌发酵法;(2)化学合成法:以D-葡萄糖为原料,经化学反应合成;(3)化学半合成法:以D-葡萄糖为原料经发酵生成D-核糖,再以D-核糖为原料进行化学合成。目前在工业上应用的核黄素方法是化学半合成法、酵母菌发酵法和基因工程菌发酵法。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种核黄素的发酵培养基及其发酵方法,该发酵培养基添加叶酸和氟化钠为菌体代谢提供缺乏的营养物质,解除糖酵解途径中对原料的浪费,促进HMP途径的代谢强度,有利于代谢目标产物的高效合成;并提供一种中间流加糖控制策略,保证各阶段适当的葡萄糖浓度,降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响。
本发明通过以下技术方案来实现:
一种核黄素的发酵培养基,所述发酵培养基包含以下组分:葡萄糖15~30g/L,面包酵母5~15g/L,酵母浸粉1~4g/L,棉籽饼粉5~9g/L,玉米浆10~30ml/L,甜菜糖蜜10~30ml/L,磷酸二氢钾0.2~0.7g/L,磷酸氢二钾1~3g/L,硫酸铵1~5g/L,硫酸镁0.4~0.8g/L,氟化钠10~40mg/L,叶酸0.5~3mg/L,红霉素5~20mg/L,氯霉素5~20mg/L。
进一步的,所述发酵培养基还包括0.6~1mL/L的消泡剂。
进一步的,所述发酵培养基中氟化钠的含量为20mg/L。
进一步的,所述发酵培养基中叶酸的含量为2mg/L。
一种核黄素的发酵方法,包括以下步骤:
步骤一、将核黄素菌种进行活化,将活化后的核黄素菌种接种至种子培养基中,在37~39℃温度下,200~700rpm转速下培养13~16h,制得发酵种子液,备用;
步骤二、将发酵种子液按照体积百分比10~15%的接种量转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中,在温度为37~40℃,溶氧量为15~30%,pH为6.7~7.0的条件下培养60~70h,制得核黄素。
进一步的,所述核黄素菌种进行活化的具体步骤为:将核黄素菌种接种至活化斜面固体培养基上,在37~40℃的条件下培养15~20h;
所述斜面固体培养基包含如下组分:酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2。
进一步的,所述核黄素菌种为枯草芽孢杆菌属。
进一步的,步骤一中所述种子培养基包含如下组分:蔗糖20~30g/L,面包酵母5~15g/L,棉籽饼粉5~9g/L,玉米浆10~50ml/L,甜菜糖蜜4~6ml/L,磷酸二氢钾0.5~2g/L,磷酸氢二钾2~4g/L,硫酸铵3~8g/L,硫酸镁0.4~0.8g/L,红霉素5~20mg/L,氯霉素5~20mg/L。
进一步的,所述种子培养基还包括0.4~0.8mL/L的消泡剂。
进一步的,步骤二中在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明在核黄素发酵培养基中添加叶酸,可解除营养供应的瓶颈,延长代谢产物的时间,提高核黄素的产量;
(2)本发明在核黄素发酵培养基中添加氟化钠,可减少糖酵解途径对营养的利用,间接促进核黄素代谢途径中HMP途径的通量,提供核黄素合成所需要的前体物质,促进代谢通量,提高核黄素的产量;
(3)与传统的化学法和酶法相比,本发明设备简单,绿色污染小,符合当前的低碳环境,成本低,适合大规模;
(4)本发明使用的微生物菌株,遗传标记稳定不易丢失,传十代以上转接,产量基本保持稳定;
(5)使用本发明的方法进行核黄素的发酵,可以使通向核黄素合成代谢中前体物充足,从而使核黄素的产量提高至34.6g/L,与未使用该方法相比产量提高76.53%,发酵周期缩短至60h,减少成本。
(6)本发明提供了一种中间流加糖控制策略,保证各阶段适当的葡萄糖浓度,降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明:
以下实施例中发酵产物核黄素的含量测定所采用的分析方法如下:
色谱柱为Agilent ZORBAXSB—C18(150min×4.6mm,3.5μm);流动相为甲醇——0.35%磷酸的0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液(26:74);检测波长267nm;流速1.0ml/min;柱温35℃,进样量为20μL。精确称取核黄素的标准品,用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液;将预处理的待测发酵液样品用去离子水稀释至适当的浓度,并用0.22μm微孔滤膜过滤,作为发酵样品溶液待检测,发酵样品根据峰面积计算核黄素产量。
实施例1:
(1)以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株,将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基(酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2)上,38℃培养18h,得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌;
(2)用接种环刮取步骤(1)制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(蔗糖25g/L,面包酵母10g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜5ml/L,磷酸二氢钾1g/L,磷酸氢二钾3g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁0.6g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.6mL/L)中,38℃,通过调整转速(200~700rpm)、风量、罐压控制溶氧20~30%,培养15h,得到种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百分比15%(v/v)的接种量转接至装有核黄素发酵培养基(葡萄糖25g/L,面包酵母10g/L,酵母浸粉2g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜20ml/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾2g/L,硫酸铵3g/L,硫酸镁0.5g/L,氟化钠10mg/L,叶酸0.5mg/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中,在38.5℃,溶氧量15~30%,pH6.8(NH3·H2O调节)的条件下,进行发酵,发酵过程中,依据溶氧变化情况,分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%,发酵60h结束。
经HPLC检测,本实施例中核黄素产量达到27.3g/L。
实施例2:
(1)以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株,将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基(酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2)上,38℃培养18h,得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌;
(2)用接种环刮取步骤(1)制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(蔗糖25g/L,面包酵母10g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜5ml/L,磷酸二氢钾1g/L,磷酸氢二钾3g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁0.6g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.6mL/L)中,38℃,通过调整转速(200~700rpm)、风量、罐压控制溶氧20~30%,培养15h,得到种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百分比15%(v/v)的接种量转接至装有核黄素发酵培养基(葡萄糖25g/L,面包酵母10g/L,酵母浸粉2g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜20ml/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾2g/L,硫酸铵3g/L,硫酸镁0.5g/L,氟化钠20mg/L,叶酸2mg/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中,在38.5℃,溶氧量15~30%,pH6.8(NH3·H2O调节)的条件下,进行发酵,发酵过程中,依据溶氧变化情况,分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%,发酵60h结束。
经HPLC检测,本实施例中核黄素产量达到34.6g/L。
实施例3:
(1)以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株,将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基(酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2)上,38℃培养18h,得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌;
(2)用接种环刮取步骤(1)制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(蔗糖25g/L,面包酵母10g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜5ml/L,磷酸二氢钾1g/L,磷酸氢二钾3g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁0.6g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.6mL/L)中,38℃,通过调整转速(200~700rpm)、风量、罐压控制溶氧20~30%,培养15h,得到种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百分比15%(v/v)的接种量转接至装有核黄素发酵培养基(葡萄糖25g/L,面包酵母10g/L,酵母浸粉2g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜20ml/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾2g/L,硫酸铵3g/L,硫酸镁0.5g/L,氟化钠40mg/L,叶酸3mg/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中,在38.5℃,溶氧量15~30%,pH6.8(NH3·H2O调节)的条件下,进行发酵,发酵过程中,依据溶氧变化情况,分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%,发酵60h结束。
经HPLC检测,本实施例中核黄素产量达到31.3g/L。
对比例1:
(1)以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株,将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基(酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2)上,38℃培养18h,得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌;
(2)用接种环刮取步骤(1)制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(蔗糖25g/L,面包酵母10g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜5ml/L,磷酸二氢钾1g/L,磷酸氢二钾3g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁0.6g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.6mL/L)中,38℃,通过调整转速(200~700rpm)、风量、罐压控制溶氧20~30%,培养15h,得到种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百分比15%(v/v)的接种量转接至装有核黄素发酵培养基(葡萄糖25g/L,面包酵母10g/L,酵母浸粉2g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜20ml/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾2g/L,硫酸铵3g/L,硫酸镁0.5g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.8ml/L)的50L发酵罐中,在38.5℃,溶氧量为15~30%,pH6.8(NH3·H2O调节)的条件下,进行发酵,发酵过程中,依据溶氧变化情况,前40h维持葡萄糖浓度1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%,发酵60h结束。
经HPLC检测,本实施例中核黄素产量达到,19.6g/L。
对比例2:
(1)以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌为出发菌株,将稀释好的枯草芽孢杆菌保藏菌液均匀涂布至活化斜面固体培养基(酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2)上,38℃培养18h,得到活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌;
(2)用接种环刮取步骤(1)制得的活化后的核黄素生产菌枯草芽孢杆菌接种至种子培养基(蔗糖25g/L,面包酵母10g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜5ml/L,磷酸二氢钾1g/L,磷酸氢二钾3g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁0.6g/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.6mL/L)中,38℃,通过调整转速(200~700rpm)、风量、罐压控制溶氧20~30%,培养15h,得到种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百分比15%(v/v)的接种量转接至装有核黄素发酵培养基(葡萄糖25g/L,面包酵母10g/L,酵母浸粉2g/L,棉籽饼粉7g/L,玉米浆20ml/L,甜菜糖蜜20ml/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾2g/L,硫酸铵3g/L,硫酸镁0.5g/L,氟化钠20mg/L,叶酸2mg/L,红霉素10mg/L,氯霉素10mg/L,消泡剂0.8ml/L的50L发酵罐中,在38.5℃,溶氧量15~30%,pH6.8(NH3·H2O调节)的条件下,进行发酵,发酵过程中,依据溶氧变化情况,发酵过程中维持发酵液中残余葡萄糖浓度为1.0-1.5,发酵60h结束。
经HPLC检测,本实施例中核黄素产量达到23.2g/L。
综上所述,由实施例1~3和对比例1、对比例2可以看出,在发酵培养基中加入叶酸0.5~3mg/L,氟化钠10~40mg/L,可以提高核黄素的产量,这表明叶酸和氟化钠的添加弥补了发酵过程中营养物质不足,解除代谢途径中其它途径对营养物质的利用的问题,且提供了一种中间流加糖控制策略,保证各阶段适当的葡萄糖浓度,降低葡萄糖浓度过高或过低对菌体代谢核黄素的影响,提高核黄素的产量,通过实施例1~3以看出,叶酸和氟化钠添加量的不同,对于核黄素的积累有影响,其中,实施例2中发酵培养基中添加叶酸2mg/L、化钠20mg/L,且发酵过程中前40h维持葡萄糖浓度1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5%-1.0%,可以显著提高核黄素的产量,核黄素含量提高76.53%,可以更好的维持核黄素生产菌枯草芽孢杆菌生产核黄素的能力,使核黄素的产量达到较高水平。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点,本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内,本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种核黄素的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基包含以下组分:葡萄糖15~30g/L,面包酵母5~15g/L,酵母浸粉1~4g/L,棉籽饼粉5~9g/L,玉米浆10~30ml/L,甜菜糖蜜10~30ml/L,磷酸二氢钾0.2~0.7g/L,磷酸氢二钾1~3g/L,硫酸铵1~5g/L,硫酸镁0.4~0.8g/L,氟化钠10~40mg/L,叶酸0.5~3mg/L,红霉素5~20mg/L,氯霉素5~20mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基还包括0.6~1mL/L的消泡剂。
3.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基中氟化钠的含量为20mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种核黄素的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基中叶酸的含量为2mg/L。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的一种核黄素的发酵方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一、将核黄素菌种进行活化,将活化后的核黄素菌种接种至种子培养基中,在37~39℃温度下,200~700rpm转速下培养13~16h,制得发酵种子液,备用;
步骤二、将发酵种子液按照体积百分比10~15%的接种量转接至装有核黄素的发酵培养基的发酵罐中,在温度为37~40℃,溶氧量为15~30%,pH为6.7~7.0的条件下培养60~70h,制得核黄素。
6.根据权利要求5所述的一种核黄素的发酵方法,其特征在于:所述核黄素菌种进行活化的具体步骤为:将核黄素菌种接种至活化斜面固体培养基上,在37~40℃的条件下培养15~20h;
所述斜面固体培养基包含如下组分:酵母浸出粉5g/L,NaCl 5g/L,麦芽糖20g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂20g/L,红霉素10u/mL,氯霉素10u/mL,pH7.0~7.2。
7.根据权利要求5或6所述的一种核黄素的发酵方法,其特征在于:所述核黄素菌种为枯草芽孢杆菌属。
8.根据权利要求5所述的一种核黄素发酵培养基的发酵方法,其特征在于:步骤一中所述种子培养基包含如下组分:蔗糖20~30g/L,面包酵母5~15g/L,棉籽饼粉5~9g/L,玉米浆10~50ml/L,甜菜糖蜜4~6ml/L,磷酸二氢钾0.5~2g/L,磷酸氢二钾2~4g/L,硫酸铵3~8g/L,硫酸镁0.4~0.8g/L,红霉素5~20mg/L,氯霉素5~20mg/L。
9.根据权利要求8所述的使用核黄素发酵培养基的发酵方法,其特征在于:所述种子培养基还包括0.4~0.8mL/L的消泡剂。
10.根据权利要求5所述的一种核黄素的发酵方法,其特征在于:步骤二中在发酵罐中分阶段控制发酵液中葡萄糖的浓度,前40h维持葡萄糖浓度为1.0-1.5%,40h至下罐维持葡萄糖浓度0.5-1.0%。
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