CN116426584A - 一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，且公开了一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法，以大肠杆菌为菌种发酵生产四氢嘧啶时，在发酵过程中添加γ‑氨基丁酸。γ‑氨基丁酸为生物体中的天然物质，对人类及环境无害；γ‑氨基丁酸在微生物发酵生产四氢嘧啶效果上呈时间效应和剂量效应，当发酵液中四氢嘧啶的含量≥30g/L时，添加终浓度为3ppm可以显著性的提高四氢嘧啶的产量。本发明在用大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶时，在发酵过程中添加γ‑氨基丁酸，可以显著性的提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的生产成本，提高四氢嘧啶在市场的占有率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体为一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法。
背景技术
四氢嘧啶，又叫依克多因，化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，是一种存在于微生物中的氨基酸衍生物，属于环状氨基酸类。四氢嘧啶于1985年被人们所发现，源自埃及沙漠地区盐湖里的一种微生物（高嗜盐菌体内的功效成分），因此也把它称之为“耐盐菌萃取液”。四氢嘧啶在制药、食品、化妆品、生物制剂、酶制剂、农业和化学合成药物及有机电子材料等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景。如中国专利CN113528595A《一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法》，公开了将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，通过酶切、连接导入到表达载体pBAD中，构成重组表达载体pBADVnectABC，并导入大肠杆菌BW25113，构成重组菌株K-VnectABC，该菌种不仅可以在低盐环境下生产四氢嘧啶，而且安全环保、成本低；但该发明不适用于工业化生产，因此仍需要继续研究，以提高四氢嘧啶发酵产量。
γ-氨基丁酸是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的非蛋白质氨基酸，是神经系统中最重要的抑制性神经递质，其不仅具有降低神经元活性、防止神经细胞过热以及降低血压的作用，还具有防止动脉硬化、调节心律失常、降低血脂、增强肝功能等生理功效。而且γ-氨基丁酸对癫痫、惊厥、亨廷顿病和帕金森病等多种精神疾病具有一定的疗效。以γ-氨基丁酸提高四氢嘧啶产量，具有一定的可行性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法，提高了四氢嘧啶在工业生产中的产量。
一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法，所述方法为在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶的过程中，将γ-氨基丁酸灭菌后投入发酵罐内；所述γ-氨基丁酸的添加终浓度为0.1ppm-10ppm。
进一步的，所述发酵生产四氢嘧啶的微生物为大肠杆菌。
进一步的，所述灭菌方法为将γ-氨基丁酸投入到pH为3.7-4.3酸水中，在85-93℃的条件下加热15-25min。
进一步的，所述γ-氨基丁酸的添加终浓度为3ppm。
进一步的，所述γ-氨基丁酸的投入时间为发酵开始期、发酵诱导期、发酵开始后16-24h、发酵开始后30-40h或发酵开始后50-60h的其中一个时间段。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
四氢嘧啶可以平衡细胞的渗透压, 而且在高温、冷冻和干燥等严苛条件下下, 对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用。γ-氨基丁酸为生物体中的天然物质，对人类及环境无害；γ-氨基丁酸在微生物发酵生产四氢嘧啶效果上呈时间效应和剂量效应，当发酵液中四氢嘧啶的含量≥30g/L时，添加终浓度为3ppm可以显著性的提高四氢嘧啶的产量。
本发明在用大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶时，在发酵过程中添加γ-氨基丁酸，可以显著性的提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的生产成本，提高四氢嘧啶在市场的占有率。
附图说明
图1是在发酵开始时添加不同浓度γ-氨基丁酸的四氢嘧啶产量图；
图2是在发酵诱导时添加不同浓度γ-氨基丁酸的四氢嘧啶产量图；
图3是在发酵液中四氢嘧啶含量10g/L时添加不同浓度γ-氨基丁酸的四氢嘧啶产量图；
图4是在发酵液中四氢嘧啶含量30g/L时添加不同浓度γ-氨基丁酸的四氢嘧啶产量图；
图5是在发酵液中四氢嘧啶含量50g/L时添加不同浓度γ-氨基丁酸的四氢嘧啶产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所使用的γ-氨基丁酸为山东福瑞达生物科技有限公司生产，以水为溶剂，配成浓度为50%的γ-氨基丁酸溶液。在用大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶时，在发酵过程中的不同阶段添加不同量的灭菌后的50%γ-氨基丁酸溶液，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm，于发酵结束后检测发酵液中四氢嘧啶的含量（如图1~图5），评估γ-氨基丁酸对大肠杆菌发酵产四氢嘧啶能力的影响。结果说明γ-氨基丁酸在提高四氢嘧啶发酵产量的效果上呈时间效应和剂量效应，只有在特定的发酵阶段以及特定浓度的γ-氨基丁酸才能实现四氢嘧啶产量最大化，而当发酵液中四氢嘧啶的含量为30g/L时，添加终浓度为3ppmγ-氨基丁酸即可有效提高发酵液中四氢嘧啶的产量，其效果最优。
实施例中：种子培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，其余为水，用液碱（10%）调节pH7.2~7.5。
发酵培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1g/L，柠檬酸钠2g/L，氨基酸5g/L，玉米浆干粉7g/L，消泡剂0.8g/L，其余为水，用氨水（20%）调pH至7.0。
发酵控制：30℃培养，控糖浓度0.5~3g/L，控溶氧20~30%，发酵过程中用氨水（20%）控PH7.0。
实施例1
（1）四氢嘧啶的生产发酵：在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶时，在发酵开始期将γ-氨基丁酸投入到pH为3.7酸水中，在93℃的条件下加热25min，灭菌处理后的50%γ-氨基丁酸溶液，添加到发酵罐内，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm。
（2）四氢嘧啶的检测：配制 1.0 mg/mL 的四氢嘧啶标准品母液，利用高效液相色谱仪检测四氢嘧啶浓度，检测流动相为体积分数2%的乙腈，波长 210 nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，上样量为10μL。
结果如图1所示，在发酵刚开始时加入不同量的γ-氨基丁酸至发酵液中的γ-氨基丁酸含量为0.1ppm~10ppm，对大肠杆菌发酵产四氢嘧啶的能力没有差异性的影响。
实施例2
（1）四氢嘧啶的生产发酵：在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶时，在发酵诱导期将γ-氨基丁酸投入到pH为3.7酸水中，在85℃的条件下加热15min，灭菌处理后的50%γ-氨基丁酸溶液添加到发酵罐内，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm。
（2）四氢嘧啶的检测：配制1.0 mg/mL 的四氢嘧啶标准品母液，利用高效液相色谱仪检测四氢嘧啶浓度，检测流动相为体积分数2%的乙腈，波长 210 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃，上样量为10μL。
在发酵诱导时，添加不同浓度的γ-氨基丁酸。
结果如图2所示，在发酵诱导时加入不同量的γ-氨基丁酸至发酵液中的γ-氨基丁酸含量为0.1ppm~10ppm，γ-氨基丁酸浓度在0.1ppm~5ppm的随着γ-氨基丁酸浓度的增大，大肠杆菌发酵产四氢嘧啶的产量越高，结果显示在γ-氨基丁酸浓度5ppm时四氢嘧啶的含量最高达到80g/L。
实施例3
（1）四氢嘧啶的生产发酵：在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶时，在发酵开始后16-24h，将γ-氨基丁酸投入到pH为4.3酸水中，在93℃的条件下加热25min，灭菌处理后的50%γ-氨基丁酸溶液添加到发酵罐内，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm。
（2）四氢嘧啶的检测：配制 1.0 mg/mL 的四氢嘧啶标准品母液，利用高效液相色谱仪检测四氢嘧啶浓度，检测流动相为体积分数2%的乙腈，波长 210 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃，上样量为10μL。
在发酵开始后16-24h，当发酵液中四氢嘧啶含量达到10g/L时，添加不同浓度的γ-氨基丁酸。
结果如图3所示，在发酵液中四氢嘧啶含量10g/L时，加入不同量的γ-氨基丁酸至发酵液中的γ-氨基丁酸含量为0.1ppm~10ppm，γ-氨基丁酸浓度在0.1ppm~3ppm的随着γ-氨基丁酸浓度的增大，大肠杆菌发酵产四氢嘧啶的产量越高，结果显示在γ-氨基丁酸浓度3ppm时四氢嘧啶的含量最高达到87g/L，随着γ-氨基丁酸浓度的增加发酵液中四氢嘧啶的含量成下降的趋势。
实施例4
（1）四氢嘧啶的生产发酵：在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶时，在发酵开始后30-40h，将γ-氨基丁酸投入到pH为4酸水中，在90℃的条件下加热20min，灭菌处理后的50%γ-氨基丁酸溶液添加到发酵罐内，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm。
（2）四氢嘧啶的检测：配制 1.0 mg/mL 的四氢嘧啶标准品母液，利用高效液相色谱仪检测四氢嘧啶浓度，检测流动相为体积分数2%的乙腈，波长 210 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃，上样量为10μL。
在发酵开始后30-40h，当发酵液中四氢嘧啶含量达到30g/L时，添加不同浓度的γ-氨基丁酸。
结果如图4所示，在发酵液中四氢嘧啶含量30g/L时，加入不同量的γ-氨基丁酸至发酵液中的γ-氨基丁酸含量为0.1ppm~10ppm，γ-氨基丁酸浓度在0.1ppm~3ppm的随着γ-氨基丁酸浓度的增大，大肠杆菌发酵产四氢嘧啶的产量越高，结果显示在γ-氨基丁酸浓度3ppm时四氢嘧啶的含量最高达到95g/L，随着γ-氨基丁酸浓度的增加发酵液中四氢嘧啶的含量成下降的趋势。
实施例5
（1）四氢嘧啶的生产发酵：在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶时，在发酵开始后50-60h，将γ-氨基丁酸投入到pH为4.3酸水中，在85℃的条件下加热15min，灭菌处理后的50%γ-氨基丁酸溶液添加到发酵罐内，至发酵液中γ-氨基丁酸的终浓度为0.1ppm~10ppm。
（2）四氢嘧啶的检测：配制1.0 mg/mL 的四氢嘧啶标准品母液，利用高效液相色谱仪检测四氢嘧啶浓度，检测流动相为体积分数2%的乙腈，波长 210 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃，上样量为10μL。
在发酵开始后50-60h，当发酵液中四氢嘧啶含量达到50g/L时，添加不同浓度的γ-氨基丁酸。
结果如图5所示，在发酵液中四氢嘧啶含量50g/L时，加入不同量的γ-氨基丁酸至发酵液中的γ-氨基丁酸含量为0.1ppm~10ppm，对大肠杆菌发酵产四氢嘧啶的能力没有差异性的影响。
Claims (5)
1.一种提高四氢嘧啶发酵产量的方法，其特征在于：所述方法为在发酵培养基中利用微生物发酵生产四氢嘧啶的过程中，将γ-氨基丁酸灭菌后投入发酵罐内；所述γ-氨基丁酸的添加终浓度为0.1ppm-10ppm。
2.根据权利要求1所述的提高四氢嘧啶发酵产量的方法，其特征在于：所述发酵生产四氢嘧啶的微生物为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的提高四氢嘧啶发酵产量的方法，其特征在于：所述灭菌方法为将γ-氨基丁酸投入到pH为3.7-4.3酸水中，在85-93℃的条件下加热15-25min。
4.根据权利要求1所述的提高四氢嘧啶发酵产量的方法，其特征在于：所述γ-氨基丁酸的添加终浓度为3ppm。
5.根据权利要求1所述的提高四氢嘧啶发酵产量的方法，其特征在于：所述γ-氨基丁酸的投入时间为发酵开始期、发酵诱导期、发酵开始后16-24h、发酵开始后30-40h或发酵开始后50-60h的其中一个时间段。
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