CN101781625A

CN101781625A - 一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用

Info

Publication number: CN101781625A
Application number: CN201010017175A
Authority: CN
Inventors: 王大慧; 邵娜; 卫功元
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-01-04
Filing date: 2010-01-04
Publication date: 2010-07-21
Anticipated expiration: 2030-01-04
Also published as: CN101781625B

Abstract

本发明公开了一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用，所述产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01于2009年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 209298。应用上述产朊假丝酵母(Candidautilis)SUGS-01联产发酵生产SAM和GSH，具体包括以下步骤：以产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，发酵至少24小时；每1升所述发酵培养基含有：蔗糖35～36g，硫酸铵10～12g，磷酸二氢钾12～13g，硫酸镁0.05～0.06g，L-蛋氨酸4～5g；所述发酵培养基pH 5.5～6.0。由于本发明采用了紫外诱变和γ-射线诱变联合作用，得到了能够联产SAM和GSH的产朊假丝酵母突变株，所得产朊假丝酵母作为生产菌株，具有生长营养谱宽泛，发酵过程中乙醇产生量少，合成蛋白能力强等优点，具有良好的工业化应用前景。

Description

一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术，具体涉及一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其在S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵中的应用。

背景技术

S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一种生物细胞内广泛存在的重要小分子物质，由Cantoni于1953年发现。研究发现SAM作为基团提供者和酶的诱导剂参与许多关键的生化反应，如脂类、蛋白质、核酸的甲基化，转硫反应及聚胺的合成等。SAM在细胞内的生理功能涉及：甲基反应中的甲基供体；生成甲硫腺苷和高丝氨酸；是tRNA的氨基丁基的供体；维生素H的合成中氨基酸链的供体；腺苷部分的供体；溶细胞素-2，3-氨基变构酶、苏氨酸合成酶、丙酮酸甲酸裂解酶、N5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶的抑制剂；SAM也是细菌和白细胞趋药性所必须的物质，在原核和真核生物的DNA限制和修饰体系中起着重要作用；它的脱羧产物还是合成聚胺的丙基供体。在医药方面，SAM可以控制衰老和一些疾病如癌症的恶化，对荷尔蒙、神经递质、DNA、RNA和蛋白质的合成和代谢以及保持质膜的流动性等具有重要作用，是合成细胞内另一重要小分子化合物谷胱甘肽的前体。尤为重要的是，由于SAM在治疗抑郁症方面显现了卓越的功效，其自1999年作为保健食品在美国大规模上市以来，销量稳居保健品类销量的首位。此外，SAM还被广泛地用作关节炎、各类肝病的临床用药，并可显著改善帕金森病的失运和僵硬不调，改善血液流动，对动脉硬化和脑血栓具有疗效；还能够诱导入睡、改善睡眠，促进皮肤再生延缓皮肤衰老等。

SAM的制备方法主要有化学合成法、发酵法、酶促转化法3种。发酵法是在含有碳、氮源的基本培养基上添加前体L-蛋氨酸，通过培养微生物细胞可以获得大量的SAM。这是目前工业生产SAM的主要途径。其中用来发酵的微生物可以由筛选或重组构建的方法得到，这在国内外有很多文章和专利的记载。Shiozaki通过筛选300多株不同的菌株，分离得到一株Saccharomyces sake k-6菌，该菌在10L发酵罐中培养7天后的SAM产量达10.8g/L(参见：Shiozaki Set al.，Agric Biol Chem，1984，48(9)：2293-2300；Shiozaki S et al.，Jouranl ofBiotechnology，1986，4：345-354)。海南国栋药物研究所有限公司构建了一株含有两个表达载体的SAM高产菌株，1000L发酵罐中S-腺苷蛋氨酸产量达14-16g/L发酵液(参见公开号为CN1824768A的中国发明申请公开说明书)。酶促转化法是利用哺乳动物或微生物(酵母、大肠杆菌)来源的SAM合成酶[EC2.5.16]催化腺苷三磷酸酶(ATP)和L-蛋氨酸(L-Met)来合成SAM。由于其反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短、无污染等特点越来越受到研究者的关注。但是添加外源ATP代价高昂以及生物细胞中SAM合成酶含量较低、分离纯化困难等原因，成为酶法大规模生产SAM的限制因素。

谷胱甘肽(GSH)作为一种重要的生理活性物质，在抗辐射、肿瘤、癌症、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无副作用。临床上主要用于：(1)保护蛋白质或酶的巯基免遭氧化性破坏，防止红细胞溶血，促进高铁血红蛋白的还原，抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的发展；(2)清除体内自由基，恢复细胞功能，防止机体衰老，防止肿瘤或动脉硬化的产生；(3)抗辐射，对放射线照射、放射性药物及抗肿瘤药物所引起的白血球减少、放射线引起的骨髓组织炎与口腔粘膜炎均有保护或减轻症状作用；(4)解除丙烯腈、氟化物、一氧化碳、重金属、农药、药物和有机溶剂造成的中毒症状；(5)维持并促进肝细胞正常功能，减轻脂肪肝与感染性肝炎症状；(6)纠正乙酰胆碱及脂碱酯酶之间的不平衡，解除过敏症状；(7)促进胆酸代谢，促进消化道对脂溶性维生素的吸收，从而促进肝脏合成凝血因子，减轻出血倾向；(8)作为多种酶的辅酶和辅基，参与TCA循环和糖代谢；(9)通过γ-谷氨酰循环参与众多氨基酸向胞内转运，促进蛋白质的合成。此外，由于GSH能够提高体内血红蛋白的含量，并保护红细胞免遭氧化性破坏，因此，GSH在体育领域内，无论是在运动性贫血机理的探讨，还是训练过度的预防、运动性疲劳机理的探讨，以及运动营养的补充方面都倍受人们的关注。

自1938年发表的用酵母制造GSH的最早专利以来，国外学者围绕GSH的生产开展了大量的研究，概括来说，谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合成GSH。该法较早应用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在ATP的存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系，其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段。发酵法就是采用廉价的糖类原料，利用细菌或酵母体内物质的代谢途径来进行GSH生物合成的方法。

综合比较，发酵法生产SAM或GSH最具有竞争力，由于微生物容易培养，因此该法将具有极大的应用潜力。

但是，发酵法生产的最关键问题在于提高微生物体内的目标产物含量，通常是通过菌种选育来实现。主要有两种方法：一是采用常规诱变育种选育高产菌株，二是利用遗传工程技术构建具有目的产物合成活性的基因工程菌。此外，对发酵过程进行控制和优化也可以提高目的产物的产量。近年来，对于SAM和GSH的研究也大都是围绕这一思路来展开。

目前国内外的研究主要集中在SAM或GSH这样的单一目的产物的发酵法制备上，到目前为止，还没有选育产朊假丝酵母用于SAM和GSH的联产发酵中。

发明内容

本发明目的是提供一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母。

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母SUGS-01(Candida utilis SUGS-01)于2009年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 209298；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。

上述产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01的筛选方法，包括以下步骤：以产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，经斜面培养和种子培养，诱变和筛选得到能够联产SAM和GSH的产朊假丝酵母突变株；具体地，所述诱变和筛选过程包括以下步骤：

(1)紫外诱变

吸取经培养20h后的种子培养液1mL，10000r/min下离心2min，弃上清，加入灭菌的生理盐水洗涤离心三次，以1mL生理盐水重新悬浮，倒入盛有9mL无菌生理盐水的培养皿(直径9cm)中混匀，并依次稀释，得到稀释106倍的菌液，将该梯度培养皿先暂时放入恒温箱中备用；

将磁力搅拌器(包括转子)放入无菌操作台，调整高度使位于最佳辐照距离处，随后打开紫外灯，照射20min后，将培养箱中存放的培养皿迅速放至磁力搅拌器上，搅拌并开始计时，依次按照时间梯度取出平板，避光保存；

将诱变后菌液涂布于选择性平板(含有0～0.7g/L的乙硫氨酸)上，30℃下恒温倒置培养，筛选出SAM和GSH产量最高的菌株，作为γ-射线诱变的出发菌株；

(2)γ-射线诱变

以紫外诱变得到的高产菌株作为出发菌株，培养20h后的菌液经稀释106倍后，进行⁶⁰Coγ-射线诱变，在相同剂量率80Gy/min下，采用的γ-射线总辐照剂量为160～800Gy；

将诱变后菌液涂布于选择性平板(含有0～0.7g/L的乙硫氨酸)上，恒温30℃下进行倒置培养，筛选出SAM和GSH产量最高的菌株，获得突变株产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01。

上述产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01可以联产发酵生产SAM和GSH，具体包括以下步骤：以产朊假丝酵母(Candida utilis)SUGS-01为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，发酵至少24小时；每1升所述发酵培养基含有：蔗糖35～36g，硫酸铵10～12g，磷酸二氢钾12～13g，硫酸镁0.05～0.06g，L-蛋氨酸4～5g；所述发酵培养基pH 5.5～6.0。

进一步的技术方案中，提取胞内S-腺苷蛋氨酸的方法包括以下步骤：

发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，在4℃下于0.35mol/LH₂SO₄溶液中处理2小时，离心取上清液，经0.22微米微孔滤膜过滤后作为待测样品。

进一步的技术方案中，提取胞内谷胱甘肽的方法包括以下步骤：

发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，在40％乙醇中30℃下处理2小时，离心取上清液进行GSH检测。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、由于本发明采用了紫外诱变和γ-射线诱变联合作用，得到了能够联产SAM和GSH的产朊假丝酵母突变株，并且优化了发酵培养基，最终得到较高产量的SAM和GSH。

2、本发明所得产朊假丝酵母作为生产菌株，具有生长营养谱宽泛，发酵过程中乙醇产生量少，合成蛋白能力强等优点，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1C.utilis SUGS-01联产发酵生产SAM和GSH的过程曲线。

具体实施方式

下面结合附图说明及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一，联产发酵SAM和GSH，并且确定乙硫氨酸最佳浓度

(1)菌株

出发菌株为产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01，苏州大学工业微生物实验室保藏。

(2)培养基

斜面及种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0；

筛选培养基：向种子培养基中加入0～0.7g/L乙硫氨酸；

优化前发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵8，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.25，pH 5.5。

(3)紫外诱变

在飞利浦ZWSSJD-30型紫外灯下进行照射，其辐照功率和波长分别为30W、253.7nm，照射距离为30cm。具体操作步骤为：吸取经培养20h后的种子培养液1mL，10000r/min下离心2min，弃上清，加入灭菌的生理盐水洗涤离心三次，以1mL生理盐水重新悬浮，倒入盛有9mL无菌生理盐水的培养皿(直径9cm)中混匀，并依次稀释，得到稀释10⁶倍的菌液，将该梯度培养皿先暂时放入恒温箱中备用。将磁力搅拌器(包括转子)放入无菌操作台，调整高度使位于最佳辐照距离处，随后打开紫外灯20min，使其稳定。将培养箱中存放的培养皿迅速放至磁力搅拌器上，搅拌并开始计时，依次按照时间梯度取出平板，避光保存。关闭紫外灯，吸取200μL诱变后菌液涂布于选择性平板(含有0.1～0.8g/L的乙硫氨酸)，后于30℃恒温箱中倒置培养。约48h，挑取平板上的可见菌落进行摇瓶复筛，根据检测结果，确定SAM和GSH产量最高的菌株，作为γ-射线诱变的出发菌株。

(4)γ-射线诱变

以紫外诱变得到的高产菌株作为出发菌株，培养20h后的菌液经稀释106倍后，于苏州大学辐照中心进行⁶⁰Co γ-射线诱变，在相同剂量率80Gy/min下，采用的γ-射线总辐照剂量为160～800Gy。γ-射线诱变后菌株的筛选过程与紫外诱变相同。

(5)种子培养

斜面种子活化4小时后接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间20小时。

(6)发酵培养

按10％的接种量将种子接入装有50mL优化前发酵培养基的500mL三角瓶中，在摇床中进行发酵培养。培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时。

(7)细胞干重的测定

取25mL发酵液，于3500rpm下离心10min，蒸馏水洗涤3次，得到的新鲜酵母细胞在70℃下烘48h至恒重。

(8)胞内谷胱甘肽的提取

(9)胞内S-腺苷蛋氨酸的提取

(10)葡萄糖质量浓度的测定

3，5-二硝基水杨酸法。

(11)蔗糖质量浓度的测定

硫酸-苯酚法。

(12)谷胱甘肽的测定

采用DTNB[5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法。

(13)S-腺苷蛋氨酸的测定

HPLC检测，流动相为0.5mol/L甲酸铵溶液，流速0.8mL/min，采用C18柱(4.6×250mm)，柱温25℃；

采用优化前发酵培养基进行联产发酵制备SAM和GSH的实验结果：

步骤(3)和步骤(4)中，乙硫氨酸浓度：0～0.7g/L，不同浓度的结果参见表1；

最终，SAM产量：140.0～183.1mg/L；GSH产量：144～198.9mg/L；SAM和GSH联产总量284～376.4mg/L；

其中，乙硫氨酸最佳浓度为0.5g/L。

表1 乙硫氨酸浓度对SAM和GSH联产发酵的影响

实施例二，确定最佳碳源

按照实施例一进行操作，不同在于：以优化前的发酵培养基为基准，考察不同碳源(碳源分别为葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇、乙酸钠、柠檬酸钠和淀粉)对SAM和GSH联产发酵的影响，在此基础上，进行联产发酵制备SAM和GSH的实验结果，结果参见表2：

SAM产量：0～173.1mg/L；GSH产量：6.5～193.5mg/L；

SAM和GSH联产总量6.5～366.6mg/L；

其中，最佳碳源为蔗糖。

表2 碳源种类对SAM和GSH联产发酵的影响

实施例三，确定最佳氮源

按照实施例一进行操作，不同在于：以优化前的发酵培养基为基准，考察不同氮源(氮源分别为酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素和硝酸铵)对SAM和GSH联产发酵的影响，在此基础上，进行联产发酵制备SAM和GSH的实验结果，结果参见表3：

SAM产量：41～146mg/L；GSH产量：57.5～167.7mg/L；

SAM和GSH联产总量90.5～308.7mg/L；

其中，最佳氮源为硫酸铵。

表3 氮源种类对SAM和GSH联产发酵的影响

实施例四，确定SAM和GSH联产发酵的最佳培养基

按照实施例一进行操作，不同在于：以优化前的发酵培养基为基准，采用响应面分析的方法对发酵培养基进行优化，确定最佳的培养基成分及浓度。

根据响应面分析结果，蔗糖、磷酸二氢钾和L-蛋氨酸被认为是影响SAM和GSH联产发酵的最主要因素，其最佳的浓度分别为：蔗糖35.4g/L，磷酸二氢钾12.2g/L，L-蛋氨酸4.6g/L。

实施例五，按照实施例一中所述发酵培养方法对突变株进行培养，采用优化前的发酵培养基联产发酵SAM和GSH的结果：

SAM产量167.3mg/L；GSH产量162.2mg/L；SAM和GSH联产总量329.5mg/L。

实施例六，按照实施例一中所述发酵培养方法对突变株进行培养，采用优化后的发酵培养基联产发酵SAM和GSH的结果：

优化后发酵培养基(g/L)：蔗糖35.4，硫酸铵10，磷酸二氢钾12.2，硫酸镁0.05，L-蛋氨酸4.6，pH 5.5。

SAM产量347.1mg/L；GSH产量242.2mg/L；SAM和GSH联产总量589.3mg/L。

对比实施例五和六可以发现，优化后的发酵培养基可以提高SAM和GSH的联产总量。

实施例七，按照实施例六中所述培养方法对突变株进行培养，采用优化后的发酵培养基联产发酵SAM和GSH，不同的是步骤(6)中培养时间为36时间，检测培养过程中SAM和GSH的变化，结果见图1。

Claims

1.一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母SUGS-01(Candida utilis SUGS-01)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 209298。

2.应用权利要求1所述产朊假丝酵母SUGS-01(Candida utilis SUGS-01)联产发酵生产S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽，具体包括以下步骤：以产朊假丝酵母SUGS-01(Candida utilis SUGS-01)为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，发酵至少24小时；每1升所述发酵培养基含有：蔗糖35～36g，硫酸铵10～12g，磷酸二氢钾12～13g，硫酸镁0.05～0.06g，L-蛋氨酸4～5g；所述发酵培养基pH5.5～6.0。