CN111944853A - 一种微生物发酵生产(r)-3-羟基丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微生物发酵生产(R)‑3‑羟基丁酸的方法，包括：步骤1.种子液培养：将甘油管中的菌株保藏液解冻接种于种子培养基进行培养，得到种子液；步骤2.发酵培养：将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基与种子培养基相同，发酵过程中，通过调节通风量和搅拌速度控制溶氧常数在15~25%；步骤3.(R)‑3‑羟基丁酸的分离和纯化：离心上述发酵液，收集上清液，从上清液中提取(R)‑3‑羟基丁酸。通过上述方法制备的(R)‑3‑羟基丁酸不含细菌内毒素、无异味且纯度大于95%；无需使用有机溶剂，安全无毒、成本低、时空收率高、纯度好、操作简便、适合工业化。

Description

一种微生物发酵生产(R)-3-羟基丁酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种发酵法制备(R)-3-羟基丁酸的方法。
背景技术
(R)-3-羟基丁酸（BHB）是体内能量的来源之一，在哺乳动物体内由肝脏内的长链脂肪酸代谢产生，广泛存在于血浆和外周组织中。近年研究发现，(R)-3-羟基丁酸对许多代谢相关的疾病具有治疗作用，包括：
1. 提高代谢效率，治疗营养不足、心绞痛和心肌梗塞等疾病；
2. 治疗糖代谢紊乱相关的如糖尿病和低血糖低酮体等疾病；
3. 治疗癫痫等神经紊乱疾病和老年痴呆等神经退化性疾病；
4. 预防骨质疏松等疾病。
目前，3-羟基丁酸及其盐或衍生物作为食品添加剂和药物已经广泛使用。市场上在售的大部分产品仍为消旋体，但研究表明(S)-3-羟基丁酸几乎没有生理活性。
(R)-3-羟基丁酸主要为化学合成法和酶法，但收率往往不高，而且成本较高。化学法如手性催化剂氢化还原乙酰乙酸需要高温、高压等苛刻的反应条件且用到昂贵的手性配体；酶法降解反应时间较长，有机溶剂耗费量较大，时空收率低且无法工业化。
因此，亟需提供一种成本低、操作简便、安全无毒、适于工业化生产的制备(R)-3-羟基丁酸的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种(R)-3-羟基丁酸的微生物发酵制备方法，该方法安全无毒、简单易行、工艺稳定，可以经济方便地用于工业化生产。
为实现上述技术目的，发明人选择了无致病性的微生物作为宿主，利用基因工程技术进行改造，弱化分支代谢途径，增强(R)-3-羟基丁酸相关的基因表达，筛选出高产(R)-3-羟基丁酸的菌株。
本发明采用以下技术方案：
一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，包括以下步骤：
步骤1.种子液培养：将甘油管中的菌株保藏液解冻接种于种子培养基进行培养，得到种子液；步骤2.发酵培养：将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基与种子培养基相同，发酵过程中，通过调节通风量和搅拌速度控制溶氧常数在15~25%；
步骤3. (R)-3-羟基丁酸的分离和纯化：离心上述发酵液，收集上清液，从上清液中提取(R)-3-羟基丁酸。
本发明方法中，所述菌株选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌或产氨短杆菌中的一种。
本发明方法中，所述种子液的培养过程如下：将菌株保藏液和种子培养基按体积1:20~1:5的比例混合烧瓶中，在培养温度为20-35℃，搅拌速度为50~250 rpm，pH控制在6.4~6.7的条件下培养，当吸光度值OD = 0.4-0.5时下摇床，得到种子培养液。
本发明方法中，所述发酵培养过程如下：将500mL发酵种子液和4500mL发酵培养基接种于7L发酵罐中，高温灭菌，灭菌后pH=6.4~6.7；发酵初期培养温度为30℃，罐压0.05MPa，初始空气通气比为1vvm，搅拌速度为600 rpm，pH =6.5；发酵后期培养温度控制在35℃，pH=6.7。
本发明方法中，所述种子培养基和发酵培养基组成如下：葡萄糖75 g/L、玉米浆25-30 g/L、硫酸铵20 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、尿素1.0 g/L、组氨酸30 mg/L、糖蜜25 g/L、生物素100μg/ L 、消泡剂0.2 g/L。
本发明方法中，发酵培养过程中，当葡萄糖含量降至3.0%时，通过流加形式补充补料培养基，控制发酵体系中葡萄糖含量在1.5~2.0%，此处葡萄糖含量为质量百分数。
本发明方法中，补料培养基组成为硫酸铵500 g/L、葡萄糖650 g/L。
本发明方法中，述(R)-3-羟基丁酸的分离和纯化过程如下：将步骤2中得到的发酵液离心，离心转速为4500 rpm，弃去菌体，得上清液，向上清液加入1%硅藻土，搅拌过滤，得到滤液，再向滤液中加入1%活性炭，搅拌30 min，用纳滤膜过滤滤液，所得滤液经732阳离子交换树脂后收集，浓缩至1000 g/L，趁热转移，得到 (R)-3-羟基丁酸。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明选取葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油中的一种作为碳源，选取玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液、酵母浸膏、蛋白胨和尿素中的一种作为有机氮源，或选取硫酸铵、硝酸铵和氨水作为无机氮源；选取谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌或产氨短杆菌中的一种；上述菌株具有以下生物转化功能，使碳源于辅酶A转化为乙酰辅酶A，将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A，将乙酰乙酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酰辅酶A，将(R)-3-羟基丁酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酸，同时抑制β-酮硫解酶的表达。
通过上述方法制备的(R)-3-羟基丁酸不含细菌内毒素、无异味且纯度大于95%；无需使用有机溶剂，成本低、时空收率高、纯度好、操作简便、适合工业化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可以在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
本发明实施例中操作温度除特殊说明外，均指15-30 oC。本发明中“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒状杆菌”“菌株CGMCC No. 13111”均指发明人用于发酵生产(R)-3-羟基丁酸的菌株。
本发明所构建的(R)-3-羟基丁酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacterium glutamincum, 中文名称为谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒状杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 13111。
实施例 1
（1）种子液培养：将装在甘油管中的菌株CGMCC No. 13111保藏液解冻，取24mL菌株保藏液接种于476mL种子培养基（葡萄糖75 g/L、玉米浆25-30 g/L、硫酸铵20 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、尿素1.0 g/L、组氨酸30 mg/L、糖蜜25 g/L、生物素100μg/L，pH 7.0）中，混合于5 L的烧瓶中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为30oC，搅拌速度为50 rpm，pH控制在6.4，培养时间为18 h时吸光度值OD = 0.4-0.5，下摇床，得到种子培养液。
（2）发酵培养：取500 mL种子培养液加入到4.5L发酵培养基中，混合于7 L发酵罐中，高温灭菌，灭菌后pH = 6.4~6.7；初始发酵时控制培养温度为30 oC，罐压为0.05 MPa，初始通气比为1vvm，搅拌速度为600 rpm，pH为 6.5；发酵后期pH= 6.7，温度35 oC左右。灵活调节通风量和搅拌速度保证溶氧常数在15~25%；发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，当初始糖含量降至3.0%左右时，通过流加方式加入补料（硫酸铵500 g/L、葡萄糖650 g/L），控制反应体系中残糖含量在1.5~2.0%范围内；发酵过程进行72 h后，测得发酵液中 (R)-3-羟基丁酸的浓度为11.8 g/L。
（3）发酵液的分离和(R)-3-羟基丁酸的纯化：将上述发酵液离心，离心转速为4500rpm，弃去菌体，取上清液，向上清液中加入1%硅藻土过滤，再向滤液中加入1%活性炭，搅拌30 min后过滤；用纳滤膜再次过滤滤液，所得滤液经732阳离子交换树脂后收集，浓缩至1000 g/L，趁热转移，得到56.8 g(R)-3-羟基丁酸，收率92.5%。
液相检测(R)-3-羟基丁酸纯度为98%（方法：色谱柱Shim-pack VpODSX18 150 L× 4.6；流动相乙腈/水（V/V）= 15/85；波长210 nm，进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温10oC），比旋光度[α]D 20 = -25 o (C = 6%, H2O)。
实施例2
（1）种子液培养：将装在甘油管中的菌株CGMCC No. 13111保藏液解冻，取50mL菌株保藏液接种于450mL种子培养基（葡萄糖75 g/L、玉米浆25-30 g/L、硫酸铵20 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、尿素1.0 g/L、组氨酸30 mg/L、糖蜜25 g/L、生物素100μg/L，pH 7.0）中，混合于5 L的烧瓶中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为35oC，搅拌速度为150rpm，pH控制在6.5，培养时间为18 h时吸光度值OD = 0.4-0.5，下摇床，得到种子培养液。
（2）发酵培养：取500 mL种子培养液加入到4.5L发酵培养基中，混合于7 L发酵罐中，高温灭菌，灭菌后pH = 6.4~6.7；初始发酵时控制培养温度为30 oC，罐压为0.05 MPa，初始通气比为1vvm，搅拌速度为600 rpm，pH为 6.5；发酵后期pH= 6.7，温度35 oC左右。灵活调节通风量和搅拌速度保证溶氧常数在15~25%；发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，当初始糖含量降至3.0%左右时，通过流加方式加入补料（硫酸铵500 g/L、葡萄糖650 g/L），控制反应体系中残糖含量在1.5~2.0%范围内；发酵过程进行72 h后，测得发酵液中 (R)-3-羟基丁酸的浓度为11.9g/L。
（3）发酵液的分离和(R)-3-羟基丁酸的纯化：将上述发酵液离心，离心转速为4500rpm，弃去菌体，取上清液，向上清液中加入1%硅藻土过滤，再向滤液中加入1%活性炭，搅拌30 min后过滤；用纳滤膜再次过滤滤液，所得滤液经732阳离子交换树脂后收集，浓缩至1000 g/L，趁热转移，得到55.3 g(R)-3-羟基丁酸，收率93%。
液相检测(R)-3-羟基丁酸纯度为98%（方法：色谱柱Shim-pack VpODSX18 150 L× 4.6；流动相乙腈/水（V/V）= 15/85；波长210 nm，进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温10oC），比旋光度[α]D 20 = -25 o (C = 6%, H2O)。
实施例3
（1）种子液培养：将装在甘油管中的菌株CGMCC No. 13111保藏液解冻，取85mL菌株保藏液接种于415mL种子培养基（葡萄糖75 g/L、玉米浆25-30 g/L、硫酸铵20 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、尿素1.0 g/L、组氨酸30 mg/L、糖蜜25 g/L、生物素100μg/L，pH 7.0）中，混合于5 L的烧瓶中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为20oC，搅拌速度为250rpm，pH控制在6.7，培养时间为18 h时吸光度值OD = 0.4-0.5，下摇床，得到种子培养液。
（2）发酵培养：取500 mL种子培养液加入到4.5L发酵培养基中，混合于7 L发酵罐中，高温灭菌，灭菌后pH = 6.4~6.7；初始发酵时控制培养温度为30 oC，罐压为0.05 MPa，初始通气比为1vvm，搅拌速度为600 rpm，pH为 6.5；发酵后期pH= 6.7，温度35 oC左右。灵活调节通风量和搅拌速度保证溶氧常数在15~25%；发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，当初始糖含量降至3.0%左右时，通过流加方式加入补料（硫酸铵500 g/L、葡萄糖650 g/L），控制反应体系中残糖含量在1.5~2.0%范围内；发酵过程进行72 h后，测得发酵液中 (R)-3-羟基丁酸的浓度为11.7 g/L。
（3）发酵液的分离和(R)-3-羟基丁酸的纯化：将上述发酵液离心，离心转速为4500rpm，弃去菌体，取上清液，向上清液中加入1%硅藻土过滤，再向滤液中加入1%活性炭，搅拌30 min后过滤；用纳滤膜再次过滤滤液，所得滤液经732阳离子交换树脂后收集，浓缩至1000 g/L，趁热转移，得到54.7 g(R)-3-羟基丁酸，收率93.5%。
液相检测(R)-3-羟基丁酸纯度为98%（方法：色谱柱Shim-pack VpODSX18 150 L× 4.6；流动相乙腈/水（V/V）= 15/85；波长210 nm，进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温10oC），比旋光度[α]D 20 = -25 o (C = 6%, H2O)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种微生物发酵生产(R)-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.种子液培养：将甘油管中的菌株保藏液解冻接种于种子培养基进行培养，得到种子液；
步骤2.发酵培养：将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基与种子培养基相同，发酵过程中，通过调节通风量和搅拌速度控制溶氧常数在15~25%；
步骤3.提取和纯化：离心上述发酵液，收集上清液，从上清液中提取(R)-3-羟基丁酸。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述菌株选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌或产氨短杆菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述种子液的培养过程如下：将菌株保藏液和种子培养基按体积1:20~1:5的比例混合于烧瓶中，培养温度为20-35℃，搅拌速度为50~250 rpm，pH控制在6.4~6.7之间，当吸光度值OD =0.4-0.5时下摇床，得到种子培养液。
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述发酵培养过程如下：将500mL发酵种子液和4500mL发酵培养基接种于7L发酵罐中，高温灭菌，灭菌后pH=6.4~6.7；发酵初期培养温度为30℃，罐压0.05 MPa，初始空气通气比为1vvm，搅拌速度为600 rpm，pH =6.5；发酵后期培养温度控制在35℃，pH=6.7。
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述种子培养基和发酵培养基组成如下：葡萄糖75 g/L、玉米浆25-30 g/L、硫酸铵20 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、尿素1.0 g/L、组氨酸30 mg/L、糖蜜25 g/L、生物素100 μg/L、消泡剂0.2 g/L。
6.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，发酵培养过程中，当葡萄糖含量降至3.0%时，通过流加形式补充补料培养基，控制发酵体系中葡萄糖含量在1.5~2.0%。
7.根据权利要求6所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，补料培养基组成为硫酸铵500 g/L、葡萄糖650 g/L。
8.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产（R）-3-羟基丁酸的方法，其特征在于，所述(R)-3-羟基丁酸的分离和纯化过程如下：将步骤2中得到的发酵液离心，离心转速为4500rpm，弃去菌体，得上清液，向上清液加入1%硅藻土，搅拌过滤，得到滤液，再向滤液中加入1%活性炭，搅拌30 min，用纳滤膜过滤滤液，所得滤液经732阳离子交换树脂后收集，浓缩至1000 g/L，趁热转移，得到 (R)-3-羟基丁酸。
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