CN105671098A - 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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曹华杰
刘帅
李静
岳贵龙
张孟涛
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Abstract

本发明涉及一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：（1）、将菌种接入种子罐中，得到成熟的菌种；（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，进行发酵培养；（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品。本发明生产L-2-氨基丁酸的方法，通过对发酵配方及过程控制、微生物酶转化方案和控制工艺、提取方案及控制工艺的改进，使得提取工艺简单且产品纯度可达95%以上，极大提高了L-2-氨基丁酸的生产能力及效率，可满足L-2-氨基丁酸的大规模工业化生产，具有较高的社会和经济效益。

Description

一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法。
背景技术
2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的天然氨基酸，也是一种重要的化工原料和医药中间体，已经广泛应用于药物合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇的合成，L-2-氨基丁酸液是合成新型抗癫痫药左乙拉西坦的主要生产原料。
受技术和成本的限制，我国L-2-氨基丁酸的产量不能满足国内和外贸出口的需求。L-2-氨基丁酸的制备方法已有化学法和生物方法,JefferyEA等利用汞电极在氨水或氯化铵溶液中电催化还原其相应的酮式氨基酸（或氨基酸的钠盐）的方法，制备了2-氨基丁酸，产率仅为48%，且有副产物谷氨酸生成；BabievskiiKK等将硝酸乙酯、乙醛和异丁酸的反应产物经催化加氢后制备了2-氨基丁酸，产率依然较低，也有副产物苏氨酸生成。李斌等人发明了一种L-2-氨基丁酸的生物制备法，其以L-苏氨酸为原料、使L-苏氨酸在水中、在苏氨酸脱氨酶和具有亮氨酸脱氢酶和辅酶再生功能的全细胞的催化作用下，在温度15℃-50℃下搅拌反应得到L-2-氨基丁酸。传统的化学法不论是有机合成或化学拆分均因生产成本高而失去竞争力。生物方法中因酶催化方法制备方法效率相对较高，但仍存在操作繁琐，原料昂贵，生产成本过高的问题。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法,该方法效率高，成本低，易于产业化生产。
本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是：一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度33℃-37℃，ph为6.5-7.5，溶氧控制在15%以上，移种OD为9-25，得到成熟的菌种；
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵前期，即培养至15h前，通过微孔过滤除菌技术，向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1至0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），或者通过流加技术，在15h前将所需量的IPTG添加完毕,发酵过程温度两阶控制，发酵前期控制温度在34-37℃，待菌体生长至对数中期时，调整温度到30-33℃培养；
（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-100g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-10g/L，硫酸铵0.5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，VB10-50mg/L，VH0.5-50mg/L，硫酸亚铁0.5-100mg/L，硫酸锰0.5-500mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-100g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-10g/L，硫酸铵0.5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，VB10-50mg/L，VH0.5-50mg/L，硫酸亚铁0.5-100mg/L，硫酸锰0.5-500mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌先加热至60-80℃，并保持10-40min。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为10-60min。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述步骤（4）中洗脱用的氨水浓度为1-5%。
作为本发明一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法的进一步优化：所述步骤（4）中蒸发浓缩终浓度为200-350g/L。
有益效果
申请人针对目前发酵工艺方法中的不足，在天津科技大学、中国氨基酸技术服务中心的帮助指导下，通过对发酵配方及过程控制、微生物酶转化方案和控制工艺、提取方案及控制工艺的改进，使得提取工艺简单且产品纯度可达95%以上，极大提高了L-2-氨基丁酸的生产能力及效率，可满足L-2-氨基丁酸的大规模工业化生产，具有较高的社会和经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度36℃，ph为7.0，溶氧控制在25%，移种OD为10，得到成熟的菌种；
种子罐配方葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，VB110mg/L，VH20mg/L，硫酸亚铁75mg/L，硫酸锰100mg/L，消泡剂0.25ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵前期，即培养至15h前，通过微孔过滤除菌技术，向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），,发酵过程温度两阶控制，发酵前期控制温度在34℃，待菌体生长至对数中期时，调整温度到33℃培养；
发酵罐罐配方葡萄糖8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁2g/L，VB120mg/L，VH50mg/L，硫酸亚铁112mg/L，硫酸锰230mg/L，消泡剂0.35ml/L，其余为水。
（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品，纯度为95.8%。
实施例2
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度36℃，ph为7.0，溶氧控制在25%，移种OD为10，得到成熟的菌种；
种子罐配方葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，VB110mg/L，VH20mg/L，硫酸亚铁75mg/L，硫酸锰100mg/L，消泡剂0.25ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，通过流加技术，在15h前将所需量的IPTG（投入终浓度为0.1至0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷））添加完毕,发酵过程温度两阶控制，发酵前期控制温度在35℃，待菌体生长至对数中期时，调整温度到30℃培养；
发酵罐罐配方葡萄糖8g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁2g/L，VB120mg/L，VH50mg/L，硫酸亚铁112mg/L，硫酸锰230mg/L，消泡剂0.35ml/L，其余为水。
（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过2.5Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用1.5%氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品，纯度为97.3%。
实施例3
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度33℃，ph为6.5，溶氧控制在20%，移种OD为20，得到成熟的菌种；
种子罐配方葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，VB110mg/L，VH20mg/L，硫酸亚铁75mg/L，硫酸锰100mg/L，消泡剂0.25ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵前期，即培养至15h前，通过微孔过滤除菌技术，向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）,发酵过程温度两阶控制，发酵前期控制温度在34-37℃，待菌体生长至对数中期时，调整温度到30-33℃培养；
发酵罐罐配方葡萄糖8g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁2g/L，VB120mg/L，VH50mg/L，硫酸亚铁112mg/L，硫酸锰230mg/L，消泡剂0.35ml/L，其余为水。
（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过2.5Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用1.5%氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品，纯度为97.3%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度33℃-37℃，ph为6.5-7.5，溶氧控制在15%以上，移种OD为9-25，得到成熟的菌种；
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵前期，即培养至15h前，通过微孔过滤除菌技术，向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1至0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），或者通过流加技术，在15h前将所需量的IPTG添加完毕,发酵过程温度两阶控制，发酵前期控制温度在34-37℃，待菌体生长至对数中期时，调整温度到30-33℃培养；
（3）、发酵结束后，发酵液液先经过陶瓷膜除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用732性离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-2-氨基丁酸粗品。
2.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-100g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-10g/L，硫酸铵0.5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，VB10-50mg/L，VH0.5-50mg/L，硫酸亚铁0.5-100mg/L，硫酸锰0.5-500mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
3.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-100g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-10g/L，硫酸铵0.5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-10g/L，硫酸镁0.5-5g/L，VB10-50mg/L，VH0.5-50mg/L，硫酸亚铁0.5-100mg/L，硫酸锰0.5-500mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
4.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌先加热至60-80℃，并保持10-40min。
5.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为10-60min。
6.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中洗脱用的氨水浓度为1-5%。
7.如权利要求1所述一种发酵法生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中蒸发浓缩终浓度为200-350g/L。
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