CN107119081A - 一种制备（r）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯的方法 - Google Patents

一种制备（r）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107119081A
CN107119081A CN201710384245.2A CN201710384245A CN107119081A CN 107119081 A CN107119081 A CN 107119081A CN 201710384245 A CN201710384245 A CN 201710384245A CN 107119081 A CN107119081 A CN 107119081A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ketoreductase
acid esters
hydroxyl
reaction
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710384245.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107119081B (zh
Inventor
陈芬儿
黄则度
彭海辉
熊方均
吴妍
陶媛
李祉宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN201710384245.2A priority Critical patent/CN107119081B/zh
Publication of CN107119081A publication Critical patent/CN107119081A/zh
Priority to US15/871,039 priority patent/US10526622B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN107119081B publication Critical patent/CN107119081B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/28—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the hydroxylic moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/732—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids of unsaturated hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0108—Isopropanol dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.80)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/025—Gas chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物化工技术领域，具体公开了一种制备（R）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯的方法。本发明方法以3‑羰基‑5‑己烯酸酯为底物，利用酮还原酶催化还原底物，生成（R）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用生物催化剂酮还原酶进行不对称还原反应，获得手性纯度极高的（R）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯，操作简便、反应条件温和、反应产率高，具有良好的实际工业应用价值。

Description

一种制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的制备方法。
背景技术
（R）-3-羟基-5-己烯酸酯是一种重要的手性化合物，其结构式如下图（I）所示，式中R为C1-C8烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基。化合物（I）被广泛应用于医药化工中间体的合成，例如，陈芬儿等（WO2016074324）披露了从化合物（I）的衍生物出发，高效制备用于合成他汀类降血脂药物的重要化工中间体（III）的路线。
文献检索表明化学方法是目前合成化合物（I）及其结构类似物的主要途径。例如，美国专利US6355822报道了一种以L-酒石酸和硼氢化钠原位反应生成的产物为手性还原剂来还原3-羰基-5-己烯酸酯（II）结构类似物从而立体选择性地制备相应3-羟基-5-己烯酸酯（I）的方法。该还原反应需要在低温下进行（-20℃至-50℃），反应条件苛刻，其实际工业应用前景受到限制。
欧洲专利EP1176135披露了一种通过钌和手性膦配体的络合物来不对称催化氢化3-羰基-5-己烯酸酯（II）结构类似物从而生成相应光学纯3-羟基-5-己烯酸酯（I）结构类似物的方法。该反应需要在高温、高氢气压力下进行，给工业生产带来不便。
有少数报道通过生物催化选择性生成（R）-3-羟基-5-己烯酸酯。例如，J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 1991, 133-140报道了酿酒酵母（baker’s yeast）催化还原化合物（II），选择性地生成（R）-3-羟基-5-己烯酸酯（I），ee值为78%（甲酯）和43%（乙酯）。该方法立体选择性差，不适合工业生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产物收率高、立体选择性优异、对环境友好的制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法。
所述（R）-3-羟基-5-己烯酸酯，其结构式为（I）所示：
式中，R为C1-C8烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基；
本发明提供的制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法，是以3-羰基-5-己烯酸酯为底物，利用酮还原酶催化还原底物，生成（R）-3-羟基-5-己烯酸酯（I）。
所述的酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者是在保持该酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
反应体系还可加入辅酶NADP+。
作为优选，在反应体系中加入的辅酶NADP+用量为底物用量（w/w）的0.005%-0.01%。
反应体系还包括辅酶NADPH的再生体系。
反应中辅酶NADPH的再生体系可以是本领域现有的再生NADPH的任何体系。较佳的是异丙醇和异丙醇脱氢酶的联合使用来再生辅酶NADPH。更佳的是氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶；或者是在保持该异丙醇脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
反应的合成路线为：
式中，R为C1-C8烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基。
上述酮还原酶和异丙醇脱氢酶的氨基酸序列均可通过商业化的全基因合成制得。
酮还原酶催化还原底物生成的（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的立体中心为R构型。
本发明中，所述酮还原酶和异丙醇脱氢酶均可采用本领域常规的技术手段进行制备，具体为：将含酮还原酶基因或者异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pET-24b或者pET-22b质粒的酶切产物连接，转入感受态的大肠杆菌E.coli JM109(DE3)中，获得转化的重组子；将重组子进行诱导表达，细胞破碎，离心，取上清获得酮还原酶和异丙醇脱氢酶。
优选地，在起始反应体系中，底物的质量百分浓度为1%-20%（w/v），更优选的为5%-15%。
所述酮还原酶的用量（按湿菌体计算）为底物质量的1%-30%，更优选的为20%-30%。所述异丙醇脱氢酶的用量（按湿菌体计算）为底物质量的1%-15%，更优选的为10%-15%。
作为优选，所述反应的温度为15-35℃，更优选的为25-30℃；所述反应的时间为2-18h。
作为优选，反应液的pH为6-9，更优选的为7-8。
优选地，在起始反应体系中，异丙醇的百分浓度为5%-20%（v/v），更优选的为10%-20%。
上述反应结束后，反应液需经后处理才能获得成品，所述后处理为：向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物成品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
操作简便、反应条件温和、反应产率高、立体选择性优异、对环境友好，具有良好的实际工业应用价值。
附图说明
图1为酮还原酶和异丙醇脱氢酶诱导表达的蛋白质SDS-PAGE电泳图。其中。M:蛋白质Marker; 1:酮还原酶诱导菌体的破胞上清；2:酮还原酶诱导菌体的破胞沉淀；3:异丙醇脱氢酶诱导菌体的破胞上清；4:异丙醇脱氢酶诱导菌体的破胞沉淀。
图2为本发明实施例3中反应1h后取样所得的样品的GC-MS（TIC）图谱。
图3为本发明实施例3中反应16h后取样所得的样品的GC-MS（TIC）图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1，酮还原酶粗酶的发酵罐生产工艺
将含酮还原酶基因的基因片段与pET-24b质粒的酶切产物连接，转入感受态大肠杆菌E.coli JM109(DE3)菌株中，筛选得到阳性克隆子，接种到5mL含卡那霉素的液体LB培养基活化8h（37℃，180rpm）。
取上述活化的培养物，以1/100的接种量转接到50mL含卡那霉素的液体LB培养基培养过夜（37℃，180rpm）。
取过夜的培养物，以1/100的接种量转接到5L含卡那霉素（100mg）的液体培养基中（置于7L发酵罐中，含2%胰蛋白胨，1%酵母粉，1%NaCl）发酵培养（30℃，300rpm）至OD600达到10，加入IPTG（50mg）,于25℃下培养过夜（过程中补充甘油，控制pH在6.8）。离心收集细胞（湿菌体），用1.2L磷酸缓冲液（100mM，pH7.5）悬浮细胞。用高压细胞破碎仪（800bar）破碎细胞，离心，上清液即为酮还原酶粗酶液。
实施例2，异丙醇脱氢酶的发酵罐生产工艺
将含异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pET-22b质粒的酶切产物连接，转入感受态大肠杆菌E.coli JM109(DE3)菌株中，筛选得到阳性克隆子，接种到5mL含氨苄青霉素的液体LB培养基活化8h（37℃，180rpm）。
取上述活化的培养物，以1/100的接种量转接到50mL含氨苄青霉素的液体LB培养基培养过夜（37℃，180rpm）。
取过夜的培养物，以1/100的接种量转接到5L含氨苄青霉素（100mg）的液体培养基中（置于7L发酵罐中，含2%胰蛋白胨，1%酵母粉，1%NaCl）发酵培养（30℃，300rpm）至OD600达到10，加入IPTG（50mg）,于25℃下培养过夜（过程中补充甘油，控制pH在6.8）。离心收集细胞（湿菌体），用1.2L磷酸缓冲液（100mM，pH7.5）悬浮细胞。用高压细胞破碎仪（800bar）破碎细胞，离心，上清液即为异丙醇脱氢酶粗酶液。
实施例3，酮还原酶催化不对称还原生成（R）-3-羟基-5-己烯酸甲酯（百克级）
在2L反应瓶中加入0.5L磷酸缓冲液（100mM，pH7.5）和0.1L异丙醇，混合均匀后加入0.2L实施例1中获得的酮还原酶粗酶液和0.1L实施例2中获得的异丙醇脱氢酶粗酶液，再加入5mg辅酶NADP+，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸甲酯100g。在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应16h后，产物转化率大于99%，终止反应。
向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物87.2g（收率86.0%，ee值99.9%）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): d/ppm 5.85 (m,1H), 5.16 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.12 (s, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.79 (s, 3H),2.50-2.21 (m, 4H)。
实施例4，酮还原酶催化不对称还原生成（R）-3-羟基-5-己烯酸乙酯（百克级）
在2L反应瓶中加入0.55L磷酸缓冲液（100mM，pH7.5）和0.15L异丙醇，混合均匀后加入0.1L实施例1中获得的酮还原酶粗酶液和0.1L实施例2中获得的异丙醇脱氢酶粗酶液，再加入10mg辅酶NADP+，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸乙酯100g。在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应14h后，产物转化率大于99%，终止反应。
向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物89.4g（收率88.3%，ee值99.9%）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): d/ppm 5.86 (m,1H), 5.15 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.11 (s, 1H), 4.18 (q, J =7.2 Hz, 2H)，4.04 (m,1H), 2.52-2.20 (m, 4H)，1.28 (t, J =7.2 Hz, 3H)。
实施例5，酮还原酶催化不对称还原生成（R）-3-羟基-5-己烯酸环丙酯（十克级）
在250mL反应瓶中加入55mL磷酸缓冲液（100mM，pH7.5）和15mL异丙醇，混合均匀后加入15mL实施例1中获得的酮还原酶粗酶液和5mL实施例2中获得的异丙醇脱氢酶粗酶液，再加入1mg辅酶NADP+，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸环丙酯10g。在25℃下反应，利用GC-MS监控，反应16h后，产物转化率大于97%，终止反应。
向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物8.1g（收率80.0%，ee值99.8%）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): d/ppm 5.88 (m, 1H),5.19 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.07 (s, 1H),，4.06 (m, 1H), 3.58 (m,1H), 2.51-2.18(m, 4H)，0.62 (m,2H),0.37 (m,2H)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的任何修改、等同替换、改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法
<130> 001
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213>
<400> 1
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asp Val Gly Glu Arg Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Ile Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Asp Val Val
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Phe Gly Met Val Gly Asp Pro Thr Val Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Met Leu Asp Asp Val Glu Gly Ala Glu Glu Met Trp Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Val Cys Val Tyr Leu Ala Ser Gly Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Ile Asp Gly Gly Trp Thr Ala Gln
245 250
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213>
<400> 2
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (9)

1.一种制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法，（R）-3-羟基-5-己烯酸酯的结构式为（I）式所示：
式中，R为C1-C8烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基；其特征在于，酮还原酶催化不对称还原3-羰基-5-己烯酸酯（II）生成（R）-3-羟基-5-己烯酸酯（I）。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酮还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；或者是在保持该酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，反应体系还加入辅酶NADP+，所述的NADP+用量为底物用量（w/w）的0.005%-0.01%。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系还包括辅酶NADPH的再生体系。
5. 如权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于，反应中辅酶NADPH的再生体系是氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶，或者是在保持该异丙醇脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在起始反应体系中，底物的质量百分浓度为1%-20%；所述酮还原酶的用量按湿菌体计算，为底物质量的1%-30%，所述异丙醇脱氢酶的用量按湿菌体计算，为底物质量的1%-15%。
7.如权利要求1、2、4或6所述的方法，其特征在于，反应的温度为15-35℃。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应液的pH为6-9。
9.如权利要求1、2、4、6或8所述的方法，其特征在于，在起始反应体系中，异丙醇的百分浓度为5%-20%（v/v）。
CN201710384245.2A 2017-05-26 2017-05-26 一种制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法 Active CN107119081B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710384245.2A CN107119081B (zh) 2017-05-26 2017-05-26 一种制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法
US15/871,039 US10526622B2 (en) 2017-05-26 2018-01-14 Preparation method for (R)-3-hydroxyl-5-hexenoate

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710384245.2A CN107119081B (zh) 2017-05-26 2017-05-26 一种制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107119081A true CN107119081A (zh) 2017-09-01
CN107119081B CN107119081B (zh) 2021-01-26

Family

ID=59728968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710384245.2A Active CN107119081B (zh) 2017-05-26 2017-05-26 一种制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯的方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10526622B2 (zh)
CN (1) CN107119081B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359626A (zh) * 2018-01-05 2018-08-03 复旦大学 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN111686809A (zh) * 2020-06-21 2020-09-22 复旦大学 羰基还原酶/异丙醇脱氢酶共固载催化剂及其制备方法和应用
CN108486075B (zh) * 2018-02-14 2020-11-13 浙江工业大学 一种重组羰基还原酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN112694406A (zh) * 2020-07-03 2021-04-23 中国地质大学（北京） 两种二聚己基衣康酸衍生物的制备方法和应用
CN113046395A (zh) * 2021-03-18 2021-06-29 宁波酶赛生物工程有限公司 （2s,5s）-2,5-己二醇的生产工艺及其应用
US11913055B2 (en) 2020-10-22 2024-02-27 Fudan University Continuous flow method for preparing (R)-3-hydroxy-5-hexenoate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100173369A1 (en) * 2008-08-27 2010-07-08 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
CN102492668A (zh) * 2011-11-29 2012-06-13 华东理工大学 一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用
CN103224484A (zh) * 2013-04-07 2013-07-31 复旦大学 一种2-((4r,6s)-6-氯代甲基-2-烷基-1,3-二氧六环-4-基)乙酸的制备方法
EP2263643A3 (de) * 2009-06-18 2015-06-10 Henkel AG & Co. KGaA Antifalten-Kosmetikum enthaltend Pflanzenextrakte

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT407638B (de) 1999-07-16 2001-05-25 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Verfahren zur selektiven reduktion von chiralen alpha- oder beta-ketoestern mit nabh4 und (d)- oder (l)- weinsäure
JP4601779B2 (ja) 2000-07-25 2010-12-22 高砂香料工業株式会社 光学活性アルコールの製造方法
CN104356109B (zh) 2014-11-12 2016-08-24 复旦大学 一种2-((4r,6s)-6-溴甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-基)乙酸酯的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100173369A1 (en) * 2008-08-27 2010-07-08 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
EP2263643A3 (de) * 2009-06-18 2015-06-10 Henkel AG & Co. KGaA Antifalten-Kosmetikum enthaltend Pflanzenextrakte
CN102492668A (zh) * 2011-11-29 2012-06-13 华东理工大学 一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用
CN103224484A (zh) * 2013-04-07 2013-07-31 复旦大学 一种2-((4r,6s)-6-氯代甲基-2-烷基-1,3-二氧六环-4-基)乙酸的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK DATABASE: "3-beta hydroxysteroid dehydrogenase [Lactobacillus Kefiri]", 《GENBANK DATABASE》 *
YAN XIE 等: "Isolation of a Bacillus strain producing ketone reductase with high substrate tolerance", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
张淑蓉 等: "酮还原酶在罗苏伐他汀制备中的应用", 《西南师范大学学报（自然科学版）》 *
李丹 等: "(3aS,6aR)-1,3-双(4-甲氧苄基)-四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2,4-二酮的不对称合成", 《中国医药工业杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359626A (zh) * 2018-01-05 2018-08-03 复旦大学 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN108359626B (zh) * 2018-01-05 2021-10-26 复旦大学 一种工程菌及其在制备(r)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN108486075B (zh) * 2018-02-14 2020-11-13 浙江工业大学 一种重组羰基还原酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN111686809A (zh) * 2020-06-21 2020-09-22 复旦大学 羰基还原酶/异丙醇脱氢酶共固载催化剂及其制备方法和应用
CN112694406A (zh) * 2020-07-03 2021-04-23 中国地质大学（北京） 两种二聚己基衣康酸衍生物的制备方法和应用
US11913055B2 (en) 2020-10-22 2024-02-27 Fudan University Continuous flow method for preparing (R)-3-hydroxy-5-hexenoate
CN113046395A (zh) * 2021-03-18 2021-06-29 宁波酶赛生物工程有限公司 （2s,5s）-2,5-己二醇的生产工艺及其应用
CN113046395B (zh) * 2021-03-18 2023-03-28 宁波酶赛生物工程有限公司 （2s,5s）-2,5-己二醇的生产工艺及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US10526622B2 (en) 2020-01-07
US20180340196A1 (en) 2018-11-29
CN107119081B (zh) 2021-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107119081A (zh) 一种制备（r）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯的方法
CN105368828B (zh) 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法
CN108359649A (zh) 醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
CN109750009B (zh) 一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用
CN105274070B (zh) 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法
CN108220276B (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用
JPH0523191A (ja) Ｄ−パントテン酸の製造法
CN110527637A (zh) 一种产乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用
CN108504641A (zh) 醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
CN112410276B (zh) 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用
CN107460138A (zh) 一种产fad依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用
CN104152505A (zh) 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-l-异亮氨酸的方法
CN106520715B (zh) 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用
CN108118035A (zh) 一种环己酮单加氧酶及其应用
CN105274027B (zh) 类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用
CN108359626A (zh) 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN106399398A (zh) (r)‑3,5‑双(三氟甲基)苯乙醇的生物制备方法
CN109370998A (zh) 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体I215F
CN106191151B (zh) 一种生物转化联产d-赖氨酸和5-氨基戊酸的方法
JP2006296358A5 (zh)
CN111621528A (zh) 一种生物合成乙醇胺的方法
CN105950595B (zh) (-)-γ-内酰胺酶、基因、突变体、载体及其制备与应用
JP2012005396A (ja) （ｒ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの工業的な製造方法
CN105671098A (zh) 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法
CN107653236B (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant