CN108359626B - 一种工程菌及其在制备(r)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体公开一种工程菌及其在制备（R）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯（I）中的应用。本发明的工程菌包括宿主细胞和共转入该宿主细胞的两个目的基因，分别为碱基序列如SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因和SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶基因。本发明将SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因和SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶基因共同导入宿主细胞构建的工程菌可表达酮还原酶KRED以及异丙醇脱氢酶IPD，通过KRED的催化作用以及IPD对于辅酶NADPH的循环，实现3‑羰基‑5‑己烯酸酯（II）的高效、高立体选择性还原生成（R）‑3‑羟基‑5‑己烯酸酯（I）。

Description

一种工程菌及其在制备(R)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及工程菌及其在制备(R)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用。

背景技术

(R)-3-羟基-5-己烯酸酯是一种被广泛应用于医药化工中间体包括他汀类降血脂药物合成的重要手性化合物，其结构式如下所示，式中R为C₁-C₈烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基。

作为目前合成化合物(I)及其结构类似物的主要途径，化学方法存在其不足之处，例如常需要用到极端反应条件，包括-20℃至-50℃低温(美国专利US6355822)和高氢气压力(欧洲专利 EP1176135)等。这些苛刻的反应条件严重地限制了化学方法制备该类化合物的工业前景。

最近，本团队报道了利用酮还原酶催化还原化合物(II)，高效、高立体选择性(>99％ee) 地生成(R)-3-羟基-5-己烯酸酯(I)(中国专利申请CN107119081A)。与传统化学方法相比，该方法具有反应条件温和、反应收率高的优点，具备良好的工业应用价值。但是，在该报道中，用于催化反应的酮还原酶和用于辅酶再生的异丙醇脱氢酶需要分别发酵制备得到，这个特点使生产操作变得繁琐、增加了工业生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供制备(R)-3-羟基-5-己烯酸酯的方法，与之前报道的生物催化方法相比，该方法具有操作简便、效率高、成本低的优点，适合工业生产。

本发明首先提供一种工程菌，包括宿主细胞和共转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因分别为酮还原酶基因和异丙醇脱氢酶基因；其中，酮还原酶基因的碱基序列如SEQID NO.1所示，或者是在保持该酮还原酶催化活性的前提下，其碱基序列与SEQ ID NO.1相同度不小于50％；异丙醇脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；或者是在保持该异丙醇脱氢酶催化活性的前提下，其碱基序列与SEQ ID NO.2的相同度不小于50％。

用于基因表达的载体可以是领域内通用的兼容共表达载体，优选pET-duet(酮还原酶基因) 和pRSF-duet(异丙醇脱氢酶基因)；宿主细胞为大肠杆菌，优选地，为大肠杆菌JM109(DE3)菌株。所述酮还原酶基因和异丙醇脱氢酶基因在大肠杆菌JM109(DE3)中共同表达，使工程菌表达酮还原酶和异丙醇脱氢酶。

本发明提供所述的工程菌在以3-羰基-5-己烯酸酯(II)为底物制备(R)-3-羟基-5-己烯酸酯(I)中的应用。

具体地，本发明提供一种(R)-3-羟基-5-己烯酸酯(I)的制备方法，具体步骤为：

(1)制备包含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因和SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶基因的工程菌；

(2)制备所述工程菌的粗酶液；

(3)将粗酶液、异丙醇、辅酶NADP⁺与底物3-羰基-5-己烯酸酯(II)混合，反应制得(R) -3-羟基-5-己烯酸酯(I)；

本发明的反应式为：

式中，R为C₁-C₈烷基或环烷基，单取代或多取代芳基或芳烷基。

如上述反应式所示，该反应中底物3-羰基-5-己烯酸酯(II)在工程菌粗酶液的催化下发生还原反应生成产物(R)-3-羟基-5-己烯酸酯(I)，反应结束后，从反应液中分离纯化，即得到目标产物。

作为优选，在反应体系中加入的辅酶NADP⁺用量为底物用量(w/w)的0.003％-0.01％。

优选地，在起始反应体系中，底物的质量百分浓度为1％-30％(w/v)，更优选的为10％-20％。所述工程菌粗酶液的用量(按湿菌体计算)为底物质量的1％-15％，更优选的为10％-15％。

作为优选，所述反应的温度为15-35℃，更优选的为25-30℃；所述反应的时间为1-15h。

作为优选，反应液的pH为6-9，更优选的为7-8。

优选地，在起始反应体系中，异丙醇的百分浓度为3％-25％(v/v)，更优选的为10％-20％。

上述反应结束后，反应液需经后处理才能获得成品，所述后处理为：向反应液中加入硅胶，搅拌15-20min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取2-3次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物成品。

与现有生物技术相比，本发明具有以下有益效果：操作简便、效率高、成本低，具有优良的实际工业应用价值。

附图说明

图1为本发明酮还原酶基因KRED和异丙醇脱氢酶基因IPD的电泳图；M:核酸Marker；1:酮还原酶基因KRED的PCR产物；2:异丙醇脱氢酶基因IPD的PCR产物。

图2为质粒pET-duet-KRED(1)的图谱。

图3为质粒pRSF-duet-IPD(1)的图谱。

图4为本发明实施例4中反应6h后取样所得的样品的GC-MS(TIC)图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1，重组质粒pET-duet-KRED(1)的制备

以此前报道(中国专利申请CN107119081A)的重组质粒pET-24b-KRED为模板，用引物 F_KRED/R_KRED克隆酮还原酶(KRED)基因，得到长度为759bp的KRED基因(SEQ IDNO.1)。

引物F_KRED的序列为：

5’-TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCGACCGTCTGAAAGGTAAAG(SEQ ID NO.3)

引物R_KRED的序列为：

5’-CTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTCACTGCGCGGTCCAGCCGCCAT(SEQ ID NO.4)

将含酮还原酶基因的基因片段与pET-duet质粒的双酶切产物(NcoI和EcoRI)重组连接，转化克隆宿主E.coli DH5。用引物F_KRED/R_KRED进行菌落PCR验证，转化重组子，提取重组质粒，进行测序。测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pET-duet-KRED(1)。

实施例2，重组质粒pRSF-duet-IPD(1)的制备

以此前报道(中国专利申请CN107119081A)的重组质粒pET-22b-IPD为模板，用引物 F_IPD/R_IPD克隆异丙醇脱氢酶(IPD)基因，得到长度为759bp的IPD基因(SEQ IDNO.2)。引物F_IPD的序列为：

5’-TTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAGT(SEQ ID NO.5)

引物R_IPD的序列为：

5’-CTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTGAGCAGTGTATCCACCAT(SEQ ID NO.6)

将含异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pRSF-duet质粒的双酶切产物(NcoI和EcoRI)重组连接，转化克隆宿主E.coli DH5。用引物F_IPD/R_IPD进行菌落PCR验证，转化重组子，提取重组质粒，进行测序。测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pRSF-duet-IPD(1)。

实施例3，基因工程菌的构建及诱导表达

用实施例1和2中构建的质粒pET-duet-KRED(1)及pRSF-duet-IPD(1)来共同转化表达宿主 E.coli JM109(DE3)，筛选得到阳性克隆子，命名此工程菌为Eco-KRED-IPD。

将该工程菌接种到5mL含卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基活化8h(37℃，180rpm)。取上述活化的培养物，以1/100的接种量转接到50mL含卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基培养过夜(37℃，180rpm)。取过夜的培养物，以1/100的接种量转接到5L含卡那霉素(50mg) 和氨苄青霉素(50mg)的液体培养基中(置于7L发酵罐中，含2％胰蛋白胨，1％酵母粉，1％NaCl) 发酵培养(30℃，300rpm)至OD₆₀₀达到10，加入IPTG(70mg),于25℃下培养过夜(过程中补充甘油，控制pH在6.8)。离心收集细胞(湿菌体)，用1.2L磷酸缓冲液(100mM，pH7.5)悬浮细胞。用高压细胞破碎仪(800bar)破碎细胞，离心，上清液即为工程菌粗酶液。

实施例4，酮还原酶催化不对称还原生成(R)-3-羟基-5-己烯酸甲酯(百克级)

在2L反应瓶中加入0.65L磷酸缓冲液(100mM，pH7.5)和0.1L异丙醇，混合均匀后加入0.1L实施例3中获得的工程菌粗酶液，再加入10mg辅酶NADP⁺，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸甲酯150g。在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应6h后，转化率大于99％，终止反应。

向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物 134.3g(收率88.3％，ee值99.9％)。¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ/ppm 5.87(m,1H),5.15 (d,J＝6.0Hz,1H),5.12(s,1H),4.08(m,1H),3.78(s,3H),2.48-2.20(m,4H)。

实施例5，酮还原酶催化不对称还原生成(R)-3-羟基-5-己烯酸苄酯(百克级)

在2L反应瓶中加入0.63L磷酸缓冲液(100mM，pH7.5)和0.15L异丙醇，混合均匀后加入 0.12L实施例3中获得的工程菌粗酶液，再加入10mg辅酶NADP⁺，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸苄酯100g。在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应8h后，转化率大于99％，终止反应。

向反应液中加入硅胶，搅拌15min，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液分层，水层用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，用水、饱和食盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干得产物 81.7g(收率81.0％，ee值99.7％)。¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ/ppm 7.38-7.15(m,5H), 5.88(m,1H),5.23(s,2H),5.14(d,J＝6.0Hz,1H),5.11(s,1H),4.09(m,1H), 2.51-2.24(m,4H)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的任何修改、等同替换、改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种工程菌及其在制备（R）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用

<130> 001

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaccgacc gtctgaaagg taaagttgcg atcgttaccg gtggcaccct gggtattggt 60

ctggcgattg cggacaaatt cgttgaagaa ggtgcaaaag tggttatcac cggtcgtcgt 120

gcggacgttg gtgaacgtgc ggcgaaatct atcggcggta ctgacgttat ccgttttatc 180

cagcacgatg cgtccgacga agcgggttgg accaaactgt tcgacactac cgaggaagct 240

ttcggtccgg ttaccactgt ggttaacaac gcgggtatcg acgttgtgaa atctgttgag 300

gacaccacca ctgaggaatg gcacaaactg ctgtctgtga acctggatgg tgttttcttc 360

ggcacccgtc tgggcattca gcgtatgaaa aacaaaggtc tgggtgcatc tatcatcaac 420

atgtcttcta tcttcggtat ggttggcgac ccgactgtgg gcgcttataa cgcgtctaaa 480

ggtgcggttc gtatcatgtc taaatctgcg gcgctggact gcgcgctgaa agactacgac 540

gttcgcgtta acaccgtgca tccgggtccg atcaagactc cgatgctgga cgacgtggaa 600

ggcgcggaag aaatgtggtc tcagcgcacc aaaaccccga tgggtcacat cggtgagccg 660

aacgacatcg cgtgggtttg cgtttacctg gcgtctggtg aatctaaatt cgcgactggt 720

gcggagtttg ttatcgatgg cggctggacc gcgcagtga 759

<210> 2

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180

caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240

tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg cggtcagcaa gagtgttgaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaactctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

gttcgggtta acactgttca tccaggttat atcaagacac cattggttga cgatcttgaa 600

ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaacttta agaaggagat ataccatgac cgaccgtctg aaaggtaaag 50

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcaggcgc gccgagctcg aattctcact gcgcggtcca gccgccat 48

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttaacttta ataaggagat ataccatgac tgatcgttta aaaggcaaag t 51

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgcaggcgc gccgagctcg aattcttatt gagcagtgta tccaccat 48

Claims (8)

1.一种(R)-3-羟基-5-己烯酸酯的制备方法，其具体步骤为：

（1）制备包含酮还原酶基因和异丙醇脱氢酶基因的工程菌，其包括：

a）将含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因的基因片段与pET-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，得到重组质粒pET-duet-KRED(1)；

b）将含异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pRSF-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，得到重组质粒pRSF-duet-IPD(1)；

c）用质粒pET-duet-KRED(1)及pRSF-duet-IPD(1)来共同转化表达宿主 E.coli JM109(DE3)，得到工程菌Eco-KRED-IPD；

（2）制备所述工程菌的粗酶液，其包括：

将培养的所述工程菌离心收集细胞，用磷酸缓冲液悬浮细胞，用高压细胞破碎仪破碎细胞，离心，上清液即为工程菌粗酶液；

（3）将粗酶液、异丙醇、辅酶NADP+与底物3-羰基-5-己烯酸酯混合，反应制得（R）-3-羟基-5-己烯酸酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在起始反应体系中，底物的质量百分浓度为1%-30%。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌的粗酶液的用量按湿菌体计算为底物质量的1%-15%。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的辅酶NADP+用量为底物用量的0.003%-0.01%（w/w）。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应的温度为15-35℃，反应液的pH为6-9。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在起始反应体系中，异丙醇的百分浓度为3%-25%（v/v）。

7.如权利要求1所述的方法，其包括：

（1）制备包含酮还原酶基因和异丙醇脱氢酶基因的工程菌，其包括：

a）将含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因的基因片段与pET-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，转化克隆宿主E.coli DH5，用引物F_KRED/R_KRED进行菌落PCR验证，转化重组子，提取重组质粒，进行测序，测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pET-duet-KRED(1)；

b）将含异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pRSF-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，用引物F_IPD/R_IPD进行菌落PCR验证，转化重组子，提取重组质粒，进行测序，测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pRSF-duet-IPD(1)；

c）用质粒pET-duet-KRED(1)及pRSF-duet-IPD(1)来共同转化表达宿主 E.coli JM109(DE3)，筛选得到阳性克隆子，命名此工程菌为Eco-KRED-IPD；

（2）制备所述工程菌的粗酶液，其包括：

将该工程菌接种到5mL含卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基于37℃、180rpm活化8h，取上述活化的培养物，以1/100的接种量转接到50mL含卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基于37℃、180rpm培养过夜，取过夜的培养物，以1/100的接种量转接到5L含50mg卡那霉素和50mg氨苄青霉素的含2％胰蛋白胨、1％酵母粉、1％NaCl的液体培养基中，置于7L发酵罐中，于30℃、300rpm发酵培养至OD600达到10，加入70mg IPTG,于25℃下培养过夜，过程中补充甘油，控制pH在6.8，离心收集细胞，用1.2L 100mM、pH7.5磷酸缓冲液悬浮细胞，用800bar高压细胞破碎仪破碎细胞，离心，上清液即为工程菌粗酶液；

（3）将粗酶液、异丙醇、辅酶NADP+与底物3-羰基-5-己烯酸酯混合，反应制得（R）-3-羟基-5-己烯酸酯，其包括如下a）或b）的步骤：

a）在2L反应瓶中加入0.65L100mM、pH7.5磷酸缓冲液和0.1L异丙醇，混合均匀后加入0.1L上述工程菌粗酶液，再加入10mg辅酶NADP+，最后加入底物3-羰基-5-己烯酸甲酯150g，在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应6h后，转化率大于99％，终止反应；

b）在2L反应瓶中加入0.63L100mM、pH7.5磷酸缓冲液和0.15L异丙醇，混合均匀后加入0.12L上述工程菌粗酶液，再加入10mg辅酶NADP+，最后加入底物3-羰基-5-己烯 酸苄酯100g，在30℃下反应，利用GC-MS监控，反应8h后，转化率大于99％，终止反应。

8.包含酮还原酶基因和异丙醇脱氢酶基因的工程菌在权利要求1-7之任一所述的方法中的应用，其中，所述工程菌的制备方法包括：

a）将含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的酮还原酶基因的基因片段与pET-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，得到重组质粒pET-duet-KRED(1)；

b）将含异丙醇脱氢酶基因的基因片段与pRSF-duet质粒的NcoI和EcoRI双酶切产物重组连接，得到重组质粒pRSF-duet-IPD(1)；

c）用质粒pET-duet-KRED(1)及pRSF-duet-IPD(1)来共同转化表达宿主 E.coli JM109(DE3)，得到工程菌Eco-KRED-IPD。

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