CN109706191B - 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法 - Google Patents

一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109706191B
CN109706191B CN201910054868.2A CN201910054868A CN109706191B CN 109706191 B CN109706191 B CN 109706191B CN 201910054868 A CN201910054868 A CN 201910054868A CN 109706191 B CN109706191 B CN 109706191B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ketocarbonyl
reductase
phenyl
enzyme
tomoxetine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910054868.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109706191A (zh
Inventor
陈本顺
江涛
何伟
毛玲妙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN201910054868.2A priority Critical patent/CN109706191B/zh
Publication of CN109706191A publication Critical patent/CN109706191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109706191B publication Critical patent/CN109706191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/584—Recycling of catalysts

Abstract

本发明公开了一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。所述方法以苯基‑3‑丁烯‑1‑酮为底物，在酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和PB缓冲液的存在下，发生生物催化反应生成(S)‑1‑苯基‑3‑丁烯‑1‑醇。本发明能耗低，操作简便，反应条件温和，酶用量小，副产物少，实现了托莫西汀手性中间体的高效合成。

Description

一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。
背景技术
托莫西汀(atomoxetine)是一种有效地且耐受性良好的治疗儿童、青少年和成人注意缺陷多动障碍的非兴奋性药物，目前已在包括我国在内的多个国家上市。托莫西汀有一个手性中心，R型药物疗效是S型的9倍，因而合成过程主要围绕提高手性选择性和异构混合物的拆分展开。其中，采用各种手段还原潜手性酮从而制备手性醇中间体是药物合成研究的热点。
手性化合物中间体(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇
Figure BDA0001952083890000011
是合成托莫西汀的关键中间体，其合成方法主要有化学合成法(Journal of Organic Chemistry,1983,48(19):3351-3353)。目前化学方法合成路线，化学试剂锂铝氢的使用，导致成本较高，手性纯度低等问题。
与纯化学合成路线相比，酶催化反应不需要高温高压等极端催化环境，也可以减少使用对人及环境有危害的催化剂，降低了废物的产生，环境友好性好；更重要地是，酶具有优异的立体选择性，可以有效提高产率和产品的光学纯度，具有极好的产业化潜力。
文献(Tetrahedron:Asymmetry 2003,14(11):1529-1534)中采用脂肪酶合成托莫西汀中间体，合成路线如下：
Figure BDA0001952083890000012
该方法以1-苯基-3-丁烯-1-醇为原料，制备(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇，但是收率仅40％。此外该方法还存在原料价格高，收率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。该方法利用重组羰基还原酶催化进行不对称还原反应制备手性醇。
实现本发明的目的的技术方案如下：
一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法，具体步骤如下：
以1-苯基-3-丁烯-1-酮为底物，在酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和磷酸(PB)缓冲液的存在下，室温下生物催化反应生成(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇，合成路线如下：
Figure BDA0001952083890000021
所述的酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的1-苯基-3-丁烯-1-酮与酮羰基还原酶的质量比为1:0.1～1。
所述的助溶剂选自异丙醇，甲醇或乙醇等醇溶剂。
所述的1-苯基-3-丁烯-1-酮与助溶剂的质量体积比为1:15～45，g：mL。
所述的PB缓冲液的浓度为0.1mM，pH为7.0。
所述的辅酶循环酶选自葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶。
所述的辅酶循环酶与酮羰基还原酶的质量比为0.1:1。
所述的酮羰基还原酶通过酮羰基还原酶表达工程菌发酵制得，具体步骤为：将酮羰基还原酶的合成基因导入pet-28a(+)的HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点得到重组表达质粒，再将重组表达质粒转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，最后将重组表达载体转入E.coli BL21中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到酮羰基还原酶。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以1-苯基-3-丁烯-1-酮为底物，采用可大量制备的、重组酮羰基还原酶表达工程菌表达的酮羰基还原酶，在酶法还原阶段，底物和所有酶“一锅法”反应，直接得到终产物(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇，方法操作简单，反应条件温和，酶用量小，产率可高达95.9％，光学纯度高，ee值可达99.8％，适合工业生产。
附图说明
图1是重组PET-28a(+)质粒的构建示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
步骤1：酮羰基还原酶基因工程菌的制备
酮羰基还原酶的氨基酸序列的Genbank登录号为AAP94029.1。将来源于Lactobacillus kefiri DSM 20587酮羰基还原酶序列优化后，进行全序列合成，使用PET-28a(+)作为表达质粒，双酶切位点为HindⅢ和EcoRⅠ，引物为F:atgaccgatcgtctgaagag(SEQID No.2)和R:tcactgtgcggtatacccg(SEQ ID No.3)，将重组表达质粒(图1)转入E.coliDH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，将重组表达载体载入E.coli BL21细胞，获得酮羰基还原酶表达工程菌。
步骤2：酮羰基还原酶的制备
将酮羰基还原酶表达工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液。将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1％。然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的IPTG，置于30℃继续培养16h后，4000rmp，4℃下离心收集菌体，采用pH值为7.5的100mmol/L的PB缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为150W，运行5S，间隔5S，共运行3min，获得酮羰基还原酶粗酶液，冻干后获得冻干粉。
步骤3：(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇的制备
于250ml反应器中，加入85ml PB缓冲液(0.1mM，pH7.0)，依次溶解800mg酮羰基还原酶，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgNADP+/NADPH。1g底物1-苯基-3-丁烯-1-酮溶于15ml异丙醇中，加入反应器，600rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇。反应结果经HPLC检测，转化率85.9％，ee值99.7％。
实施例2(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇的制备
于250ml反应器中，加入55ml PB缓冲液(0.1mM，pH7.0)，依次溶解800mg酮羰基还原酶，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgNADP+/NADPH。1g底物1-苯基-3-丁烯-1-酮溶于45ml异丙醇中，加入反应器，600rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇。反应结果经HPLC检测，转化率95.9％，ee值99.8％。
实施例3(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇的制备
于250ml反应器中，加入70ml PB缓冲液(0.1mM，pH7.0)，依次溶解800mg酮羰基还原酶，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgNADP+/NADPH。1g底物1-苯基-3-丁烯-1-酮溶于30ml异丙醇中，加入反应器，600rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇。反应结果经HPLC检测，转化率71.6％，ee值99.3％。
实施例4
Figure BDA0001952083890000041
1)按实施例1所述的方法制备(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇。
2)(R)-1-甲基-2-[(1-苯基-3-丁烯基)氧基]-苯的制备
在氮气下，将(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇(5.9g，0.04mol)，2-甲基苯酚(0.045mol)和Ph3P(11.8g，0.045mol)的无水甲苯(80mL)溶液冷却，再滴加入偶氮二甲酸二乙酯溶液(40％甲苯溶液，21mL，0.045mmol)中。将混合物在室温下搅拌1天，过滤。滤液用水洗，乙酸乙酯萃取，真空浓缩，得到化合物Ⅲ。
3)(R)-3-苯基-3-(邻甲苯基氧基)-1-丙醇的制备
将化合物Ⅲ(4.7g，0.014mol)溶解在甲醇(20mL)中。将臭氧氧混合物在-78℃下鼓泡通过该溶液10min。加入50g NaBH4甲醇(150mL)溶液后，搅拌下将溶液升至室温。然后将溶液用水稀释并用乙酸乙酯萃取。干燥，真空浓缩，得到化合物Ⅳ。
4)(R)-3-苯基-3-(2-甲基苯氧基)丙基甲烷磺酸酯的制备
在氮气保护，0℃下，将化合物Ⅳ(1.8g，0.0075mol)溶解在THF(5mL)和三乙胺(8g)的混合物中，将甲磺酰氯(1mL，0.013mol)的THF(2mL)溶液滴加到搅拌的混合物中。搅拌反应1天后，加入乙醚，有机层用冷H2SO4(20％)和冷饱和NaHCO3溶液洗。干燥并真空浓缩，得到化合物Ⅴ。
5)盐酸托莫西汀的制备
将化合物Ⅴ(4.5g，0.0145mol)和甲胺(100mL，40％水溶液)的THF(100mL)溶液加热至65℃，搅拌反应3小时。冷却后，加入乙醚，用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，干燥。浓缩，得到浅黄色油状物。将油状物溶于乙醚中，并将氯化氢气体，直至形成白色沉淀(pH2-3)。沉淀在乙腈中重结晶，得到盐酸托莫西汀(4g，94％)。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Figure IDA0003525150720000011
Figure IDA0003525150720000021

Claims (1)

1.一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
于 250ml 反应器中，加入55ml浓度为0.1mM、pH 为7.0的PB 缓冲液，依次溶解800mg酮羰基还原酶，200mg 异丙醇脱氢酶酶粉，15mgNADP+/NADPH；1g 底物1-苯基-3-丁烯-1-酮溶于45ml 异丙醇中，加入反应器，600rpm 搅拌，于25℃下反应24h，得到(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇；反应结果经HPLC 检测，转化率95.9%，ee值99.8%；
所述的酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1 所示；所述的酮羰基还原酶通过酮羰基还原酶表达工程菌发酵制得，具体步骤为：将酮羰基还原酶的合成基因导入pet-28a(+)的Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切位点得到重组表达质粒，再将重组表达质粒转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，最后将重组表达载体转入E.coliBL21 中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到酮羰基还原酶。
CN201910054868.2A 2019-01-21 2019-01-21 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法 Active CN109706191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910054868.2A CN109706191B (zh) 2019-01-21 2019-01-21 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910054868.2A CN109706191B (zh) 2019-01-21 2019-01-21 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109706191A CN109706191A (zh) 2019-05-03
CN109706191B true CN109706191B (zh) 2022-09-09

Family

ID=66261746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910054868.2A Active CN109706191B (zh) 2019-01-21 2019-01-21 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109706191B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763700B (zh) * 2020-06-23 2023-07-04 南京欧信医药技术有限公司 一种达泊西汀中间体的生物合成方法
CN112359028B (zh) * 2020-11-27 2022-05-31 江苏阿尔法药业股份有限公司 一种托莫西汀中间体的生物合成方法及羰基还原酶
CN112980895B (zh) * 2021-01-11 2023-09-26 宿迁阿尔法科技有限公司 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法
CN112941124B (zh) * 2021-02-09 2023-12-29 江苏阿尔法药业股份有限公司 一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法
CN113416756B (zh) * 2021-07-12 2023-10-31 上海克琴科技有限公司 一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法
CN113528606B (zh) * 2021-07-22 2023-05-05 湖州颐盛生物科技有限公司 一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0710725A1 (en) * 1994-11-01 1996-05-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of optically active compounds
CN101855342A (zh) * 2007-09-13 2010-10-06 科德克希思公司 用于还原苯乙酮的酮还原酶多肽
CN104450852A (zh) * 2014-02-28 2015-03-25 宁夏大学 一种高烯丙醇类化合物的制备方法
CN104805142A (zh) * 2015-02-13 2015-07-29 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种醇脱氢酶在不对称还原反应中的应用
CN107354179A (zh) * 2016-05-09 2017-11-17 上海医药工业研究院 一种制备含有羟基的手性化合物的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015000981A2 (en) * 2013-07-03 2015-01-08 Scientist Of Fortune S.A. Method for the enzymatic production of 3-buten-2-one
CN106520849B (zh) * 2015-09-11 2022-08-09 杭州酶易生物技术有限公司 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0710725A1 (en) * 1994-11-01 1996-05-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of optically active compounds
CN101855342A (zh) * 2007-09-13 2010-10-06 科德克希思公司 用于还原苯乙酮的酮还原酶多肽
CN104450852A (zh) * 2014-02-28 2015-03-25 宁夏大学 一种高烯丙醇类化合物的制备方法
CN104805142A (zh) * 2015-02-13 2015-07-29 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种醇脱氢酶在不对称还原反应中的应用
CN107354179A (zh) * 2016-05-09 2017-11-17 上海医药工业研究院 一种制备含有羟基的手性化合物的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Application of a High-Throughput Enantiomeric Excess Optical Assay Involving a Dynamic Covalent Assembly: Parallel Asymmetric Allylation and Ee Sensing of Homoallylic Alcohols;H H Jo等;《Chemical science》;20150813;第6卷(第12期);第6747-6753页 *
Asymmetric [2,3]-Wittig Rearrangement: Synthesis of Homoallylic, Allenylic, and Enynyl α-Benzyl Alcohols;Ricardo I Rodríguez等;《Organic Letters》;20181221;第20卷(第24期);第8047-8051页 *
Biocatalytic Dynamic Kinetic Resolution for the Synthesis of Atropisomeric Biaryl N-Oxide Lewis Base Catalysts;Samantha Staniland等;《Angewandte Chemie (International ed. in English)》;20060826;第55卷(第36期);第10755-10759页 *
Chiral alcohol production by NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase coupled with in situ regeneration of NADH;Nobuya Itoh等;《European Journal of Biochemistry》;20020424;第269卷(第9期);第2394-2402页 *
Synthetically amenable amide derivatives of tosylated-amino acids as organocatalysts for enantioselective allylation of aldehydes: computational rationale for enantioselectivity;Debashis Ghosh;《Organic & Biomolecular Chemistry》;20130607;第11卷(第21期);第3451-3460页 *
盐酸氟西汀的不对称合成;曹贺等;《化学工业与工程》;20080515;第25卷(第3期);第251-258页 *
锌粉促进水相"一锅"合成1-苯基-3-丁烯-1-醇;严文君等;《重庆电子工程职业学院学报》;20100320;第19卷(第2期);第149-151页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109706191A (zh) 2019-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109706191B (zh) 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法
CN106520849B (zh) 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
CN110564788B (zh) 一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法
WO2023077817A1 (zh) 一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法
EP4086343A1 (en) Use of biological enzyme for preparing orlistat intermediate, and preparation method
CN110527656A (zh) 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
CN109468291B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN112662709A (zh) 一种双酶偶联合成(r)-香茅醇的方法
CN108359626B (zh) 一种工程菌及其在制备(r)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN110004162B (zh) 一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用
CN113817693A (zh) 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用
CN110577940B (zh) 马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用
CN107828752B (zh) 一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α-熊果苷中的应用
CN111378694A (zh) 一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法
CN116814572A (zh) 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用
CN108060203B (zh) 一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法
CN101469318B (zh) (r)-羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联促进(r)-苯基乙二醇的合成
CN114908028A (zh) 一种双相体系下化学酶法级联催化腈类化合物的一锅法合成工艺
CN113930457A (zh) 一种双酶偶联合成(s)-香茅醇的方法
CN108441433B (zh) 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用
CN109576313B (zh) 一种制备（s）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法
CN113881719A (zh) 一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法
CN111575258B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN111635893A (zh) 一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用
CN110684705A (zh) 一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant