CN111378694A - 一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法，所述方法以含羰基还原酶基因的工程菌经诱导培养的湿菌体超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以3‑氯苯丙酮为底物，加入NADH及异丙醇，以pH6.5‑7.5磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30‑40℃下磁搅拌反应完全，反应液分离纯化，获得(R)‑3‑氯苯丙醇。本发明采用新型的羰基还原酶催化还原反应，具有生物催化剂使用量小、反应条件温和(30‑40℃)、反应时间短(6‑12h)、收率高达95.2％、光学纯度好(大于99)等优势。

Description

一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法
(一)技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法。
(二)背景技术
达泊西汀(Dapoxetine，商品名Priligy必利劲)，化学名称S-(+)-N,N-二甲基-a-[2-(萘氧基)乙基]苯甲胺盐酸盐(N,N-dimethyl-a-[2-(naphthalenyloxy)ethyl]benyenemethanamine hydrochloride)，属于一种快速起效和代谢的选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)，是一款用于治疗16至84周岁男性早泄的药物。达泊西汀最早由美国礼来公司开发，后在2003年被售予美国强生公司，并于2004年作为治疗早发性射精的药物被提交给美国食品药品监督管理局进行批准。
达泊西汀的化学结构式如下:
Figure BDA0002393878260000011
(R)-3-氯苯丙醇是达泊西汀化学合成过程中一个重要的中间体。但目前主要以化学合成为主，但该方法步骤繁琐，产品收率低，污染大，不适于规模化生产(CN103396320)。目前(R)-3-氯苯丙醇的生物制备方法，在催化过程中需要额外添加昂贵的辅酶NADH或使用葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生，不利于该中间体的廉价制备。
生物催化法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。
(三)发明内容
本发明目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法，所述方法简单易行，产品收率高，生产成本低、环保，从而满足达泊西汀的大规模工业化生产要求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法，所述方法以含羰基还原酶基因的工程菌经诱导培养的湿菌体超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以3-氯苯丙酮为底物，加入NADH(辅因子)及异丙醇(氢供体)，以pH6.5-7.5(优选7.0)磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-40℃(优选35℃)下磁搅拌反应完全(优选6-12h)，反应液分离纯化，获得(R)-3-氯苯丙醇。
进一步，所述羰基还原酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述羰基还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，反应体系中，底物加入终浓度为20-100g/L，优选50g/L；所述催化剂加入量以破碎前菌体干重计为2-50g/L，优选10g/L；所述NADH加入量以反应体系体积计为0.02-0.2g/L，优选0.05g/L；所述异丙醇体积加入量以反应体系体积计为1-50％，优选10％。
进一步，所述含羰基还原酶基因的工程菌是将SEQ ID NO.1所示羰基还原酶基因转入载体pET30a(+)构建重组表达载体pET30a(+)-Nov，通过转化法转到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)-Nov。
进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：
将含羰基还原酶基因的工程菌涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养；挑取单菌落接入到添加50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜；取菌液按体积浓度1％的接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃下振荡培养至OD600至3.0，然后添加IPTG至终浓度为0.05mM，25℃下诱导培养过夜；培养液4000rpm离心10min后收集菌体，用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)重悬菌体，超声破碎后所得破碎混合液即为所述催化剂。
进一步，所述超声破碎条件为：在冰水浴中，超声破碎仪功率300W，工作3秒，间隔5秒，循环99次。
所述LB平板：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH7.2。
所述LB培养液：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2。
所述反应液分离纯化方法为：反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，滤饼即为(R)-3-氯苯丙醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明采用新型的羰基还原酶催化还原反应，具有生物催化剂使用量小、反应条件温和(30-40℃)、反应时间短(6-12h)、收率高达95.2％、光学纯度好(大于99)等优势。与现有技术的化学法相比，经济性高、污染小，具有重要的工业应用价值。
(四)附图说明
图1是本发明的工艺路线图。
图2是本发明构建的重组羰基还原酶的表达质粒pET30a(+)-Nov。
图3是大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a(+)-Nov诱导表达后重组羰基还原酶的SDS-PAGE电泳图；其中M是蛋白分子量标准品，1号是纯化后的重组羰基还原酶。
图4是反应过程中底物和产物GC图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：羰基还原酶编码基因的合成
根据羰基还原酶的原始基因序列(NCBI Reference Sequence:WP_011906790.1)，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化并进行目的基因的全合成，基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行，获得的编码基因序列如SEQ IDNO.1所示，翻译后的羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。合成后的编码基因两端分别带用BamI和XhoI酶切位点并连接到pET30a(+)上，获得重组表达载体pET30a(+)-Nov(见图2)。
实施例2：羰基还原酶的表达
LB平板：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH7.2。
LB培养液：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2。
将实施例1构建的重组表达载体pET30a(+)-Nov通过转化法转到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)-Nov。涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日，挑取单菌落，将单菌落接入到5mL添加50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。次日取1mL菌液加入到含50μg/mL卡那霉素的100mL LB培养液中，37℃下振荡培养至OD600至3.0，然后添加IPTG至终浓度为0.05mM，25℃下诱导培养过夜，培养液400ml离心，转速4000rpm，10min后收集湿菌体。取2g(干重计)湿菌体用10mL、0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)重悬菌体，将重悬菌体置于冰水浴中，超声破碎仪功率300W，工作3秒，间隔5秒，循环99次，超声破碎后所得破碎混合液即为粗酶液，作为羰基还原酶用于生物催化反应。
实施例3：羰基还原酶的动力学参数
在标准条件下(20℃、101KPa)，通过改变实施例4反应体系中底物的浓度进行酶活的测定，根据双倒数作图法计算相应的动力学常数。动力学常数计算中所用底物及其浓度如下：(3)-氯-(1)-苯丙酮(0～50.0mM)，催化相应底物的表观动力学参数如表1所示。每单位酶可催化4.945mM底物，催化1分子底物只需要0.11秒。
表1羰基还原酶Nov表观动力学参数
Figure BDA0002393878260000041
实施例4：生物催化反应
将1g底物3-氯苯丙酮加入到含有17mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的50mL反应器中，随后，将2mL异丙醇，1mg NADH，1mL实施例2方法制备的粗酶液(破碎前菌体干重为400mg，用pH7.0、0.1M磷酸缓冲液重悬破碎)加入该反应器中，构成反应体系20mL。在35℃下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。GC检测底物完全消耗(约6-12小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即为(R)-3-氯苯丙醇0.95g，手性ee值大于99，收率为95.2％。GC图见图4，说明利用该重组羰基还原酶可以催化底物生成产物，6h后产物峰明显增大，底物峰减小。
GC检测条件为：
用配备有HYDRODEXβ-TBDAc色谱柱(德国Macherey-Nagel的气相色谱仪)的气相色谱仪(GC 9709系统，Fuli)检测。载气为氢气和氮气，压力0.1MPa，柱箱温度150℃，检测器温度230℃，3-氯苯丙酮出峰时间为5.3min，(R)-3-氯苯丙醇出峰时间为5.8分钟。
实施例5
将2g底物3-氯苯丙酮加入到含有17mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的50mL反应器中，随后，将0.5mL异丙醇，1mg NADH，2.5mL实施例2方法制备的粗酶液(破碎前湿菌体干重为0.25g，用pH7.0、0.1M磷酸缓冲液重悬破碎)加入该反应器中，构成20mL反应体系。在35℃下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。GC检测底物完全消耗(约6-12小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即为(R)-3-氯苯丙醇1.52g，手性ee值大于99，产品收率为76.2％。
实施例6
将5g底物3-氯苯丙酮加入到含有85mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的的250mL反应器中，随后，将10mL异丙醇，5mg NADH，5mL实施例2方法制备的粗酶液(破碎前湿菌体干重为1g，用pH7.0、0.1M磷酸缓冲液重悬破碎)加入该反应器中，构成100mL反应体系。在35℃下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。GC检测底物完全消耗(约6-12小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即为(R)-3-氯苯丙醇4.48g，手性ee值大于99，产品收率为89.5％。
实施例7
将100g底物3-氯苯丙酮加入到含有850mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的的2.5L反应器中，随后，将100mL异丙醇，50mg NADH，50mL实施例2方法制备的粗酶液(破碎前湿菌体干重为10g，用pH7.0、0.1M磷酸缓冲液重悬破碎)加入该反应器中，构成反应体系1L。在35℃下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。GC检测底物完全消耗(约6-12小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即为(R)-3-氯苯丙醇80.40g，手性ee值大于99，产品收率为80.4％。
实施例8
将100g底物3-氯苯丙酮加入到含有400mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)的的2.5L反应器中，随后，将500mL异丙醇，200mg NADH，100mL实施例2方法制备的粗酶液(破碎前湿菌体干重为50g，用pH7.0、0.1M磷酸缓冲液重悬破碎)加入该反应器中，构成反应体系1L。在35℃下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使其维持在7.0左右。GC检测底物完全消耗(约6-12小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即为(R)-3-氯苯丙醇91.10g，手性ee值大于99，产品收率为91.1％。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gacctggctg aagccgccgt ccatcacgaa ttccgtgcag gtgacgaagc ttgctgcgtc 60
ggagcagaga tagaccacgc cgccgcccat ttcggcaggg cgacccatgc gaccgatcgg 120
gtggcgcatt tccatcgcgg cctgggccac ctcgcgcgag ggggcagcgc cgagttcgac 180
gtacttgtcc atgatcgagc cgagcatcgg ggtatcgatg ccgcccggat gcacggagtt 240
gacgcggatg ttgtagccga gcgccgcgaa ttccgcgccg aggcacttcg agagcatctt 300
caccgccgcc ttgctggtgc aataggccgc attgaacgcc gcgccgcgca ggcccccgac 360
gctggagaag ttgaccaccg aggcgccccc tgcgcgcgcc ttgccgcctt ccttgagcag 420
cggcagcagg acctgcgtac cgatgatgat ggaatcgacg ttgaccgtgt tcacgcggtg 480
gaaatcggac agcggagtgt cttcgaactt cgtgacgatc gagatgcccg cgttgtgcac 540
cagcgcatcg acgcgcccgt acttttcctg ggccagcgcc gcgacggcct tccagccggc 600
ctcgctcgtc acgtcgtgct ggagataatg gtccgcgcct tcgacatcgg ccgagggggc 660
catgtcggtg gcgatgacga tggcgttggc ggccttcatc gccttgacca gttcgcggcc 720
gatgcctccc gccgcgccgg tgacgacggc gaccacattg ttgagagcaa tcgtcat 777
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Pro Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Pro His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Pro Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Pro Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Pro Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Pro Val Thr Cys Thr Glu Pro Val Met Asp Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Gln Val

Claims (7)

1.一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法，其特征在于所述方法以含羰基还原酶基因的工程菌经诱导培养的湿菌体超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以3-氯苯丙酮为底物，加入NADH及异丙醇，以pH6.5-7.5磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-40℃下磁搅拌反应完全，反应液分离纯化，获得(R)-3-氯苯丙醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述羰基还原酶基因核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中，底物加入终浓度为20-100g/L；所述催化剂加入量以破碎前菌体干重计为2-50g/L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述NADH加入量以反应体系体积计为0.02-0.2g/L；所述异丙醇体积加入量以反应体系体积计为1-50％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含羰基还原酶基因的工程菌是将SEQ IDNO.1所示羰基还原酶基因转入载体pET30a(+)构建重组表达载体pET30a(+)-Nov，通过转化法转到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)-Nov。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
将含羰基还原酶基因的工程菌涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养；挑取单菌落接入到添加50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜；取菌液按体积浓度1％的接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃下振荡培养至OD600至3.0，然后添加IPTG至终浓度为0.05mM，25℃下诱导培养过夜；培养液离心后收集菌体，用0.1M、pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，于冰水浴中超声破碎后所得破碎混合液即为所述催化剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述超声破碎条件为：超声破碎仪功率300W，工作3秒，间隔5秒，循环99次。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763700A (zh) * 2020-06-23 2020-10-13 南京欧信医药技术有限公司 一种达泊西汀中间体的生物合成方法
CN112980895A (zh) * 2021-01-11 2021-06-18 宿迁阿尔法科技有限公司 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101205548A (zh) * 2007-12-14 2008-06-25 浙江工业大学 酿酒酵母在制备(s)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用
CN102492668A (zh) * 2011-11-29 2012-06-13 华东理工大学 一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用
CN103834694A (zh) * 2014-03-20 2014-06-04 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途
CN108342418A (zh) * 2018-05-10 2018-07-31 浙江海洋大学 一种利用羰基还原酶催化生产(s)-3-氯代苯丙醇的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101205548A (zh) * 2007-12-14 2008-06-25 浙江工业大学 酿酒酵母在制备(s)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用
CN102492668A (zh) * 2011-11-29 2012-06-13 华东理工大学 一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用
CN103834694A (zh) * 2014-03-20 2014-06-04 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途
CN108342418A (zh) * 2018-05-10 2018-07-31 浙江海洋大学 一种利用羰基还原酶催化生产(s)-3-氯代苯丙醇的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "MULTISPECIES: SDR family oxidoreductase [Novosphingobium]", 《GENBANK DATABASE》 *
袁芳爱等: "抗抑郁药重要手性中间体(R)一3一氯一苯丙醇的不对称合成研究", 《化工技术与开发》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763700A (zh) * 2020-06-23 2020-10-13 南京欧信医药技术有限公司 一种达泊西汀中间体的生物合成方法
CN111763700B (zh) * 2020-06-23 2023-07-04 南京欧信医药技术有限公司 一种达泊西汀中间体的生物合成方法
CN112980895A (zh) * 2021-01-11 2021-06-18 宿迁阿尔法科技有限公司 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法
CN112980895B (zh) * 2021-01-11 2023-09-26 宿迁阿尔法科技有限公司 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法

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