CN115044627B - 高效生产l-高苯丙氨酸的方法及一种产l-高苯丙氨酸的菌株 - Google Patents

高效生产l-高苯丙氨酸的方法及一种产l-高苯丙氨酸的菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效生产L‑高苯丙氨酸的方法及一种产L‑高苯丙氨酸的菌株，本发明设计了一条以廉价的苯甲醛和丙酮酸为原料，利用级联酶法合成L‑高苯丙氨酸的新路线，通过将路径酶构建到同一株大肠杆菌中，利用获得的重组大肠杆菌进行催化，在5L反应器中进行反应，产量在100.9g/L，转化率在94％，ee>99％。与目前主要的生产L‑HPA的方法相比，极大的降低了L‑高苯丙氨酸的生产成本，具有很好的应用前景。

Description

高效生产L-高苯丙氨酸的方法及一种产L-高苯丙氨酸的菌株
技术领域
本发明涉及一种高效生产L-高苯丙氨酸的方法及一种产L-高苯丙氨酸的菌株，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-高苯丙氨酸(L-HPA)主要是血管紧张素转换酶抑制剂的主要合成原料，当前，世界上大概有20种用于医治高血压的新药的共同中间体是L-HPA。包括依那普利、贝那普利、西拉普利、咪达普利、喹那普利等。另外，L-HPA还是蛋白酶抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、中性内肽酶抑制剂和β-内酰胺抗生素等手性药物的重要组成部分。
目前，L-HPA的主要生产方法为化学合成法。以N-邻苯二甲酰-L-天冬氨酸酐为原料，经傅克反应，氢化还原，脱保护等过程合成L-HPA，但是这种方法收率较低，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物酶法制备L-HPA具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效生产L-HPA。
目前，生物酶法生产L-HPA的主要方法有：(1)脱氢酶法。Yao Nie等在大肠杆菌中异源表达苯丙氨酸脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶，利用OPBA(2-氧代-4-苯基丁酸)作为底物，以游离的铵根离子作为氨基供体合成L-HPA。通过分批补料策略，1.08M的OPBA经过四次分批补料转化为L-HPA，转化率为90.2％。Lirong Yang等通过半理性设计对谷氨酸脱氢酶进行酶改造，I406F突变体对底物OPBA的比活力提高了30.1倍，底物投料量为17.5g/L的情况下，产量达到17.13g/L，转化率为99％。(2)转氨酶法。Byung-Kwan Cho等通过芳香族氨基酸转氨酶(AroAT)，以OPBA作为底物，L-天冬氨酸为氨基供体生产L-HPA，其转化率>97％。(3)海因酶法。Wen-Hwei Hsu等以D,L型苯乙基海因混合物通过海因外消旋酶得到L-HPAH，随后通过海因酶获得氨甲酰-L-高苯丙氨酸，最后通过氨甲酰水解酶得到L-HPA，转化率达到49％。
在现有的L-HPA的生物合成途径中，尽管取得了一定的成果，但是其所利用的底物包括OPBA、苯乙基海因等价格昂贵且难以获得，比L-HPA的价格高，这是极不利于工业化生产。为了实现从廉价起始原料合成L-HPA，前期的研究工作中，我们开发了一条利用廉价的甘氨酸和苯乙醛为原料，利用共表达苏氨酸醛缩酶，苏氨酸脱氨酶，苯丙氨酸脱氢酶，和甲酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌株生产L-HPA，但产量仅有1.226g/L，转化率仅为34.2％，这限制了工业化应用，因此，我们开发了其他利用廉价原料合成L-HPA的合成路线来实现L-HPA的工业化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明设计了一条以廉价的苯甲醛和丙酮酸为原料，利用级联酶法合成L-高苯丙氨酸的新路线，首先通过醛缩酶催化的羟醛缩合反应生成(E)2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸，随后利用醌氧化还原酶催化的C＝C双键还原生成2-氧代-4-苯基丁酸，最终利用苯丙氨酸脱氢酶催化的还原胺化生成L-高苯丙氨酸，在此过程中，利用甲酸脱氢酶进行NADH的再生。
本发明的第一个目的是提供一种高效生产L-高苯丙氨酸的方法，所述方法是以苯甲醛和丙酮酸为底物，采用醛缩酶(PpNahE)、醌氧化还原酶(EcQOR)、苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)进行级联酶反应，催化底物生成L-高苯丙氨酸。
在本发明中，首先通过醛缩酶催化的羟醛缩合反应生成(E)2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸，随后利用醌氧化还原酶催化的C＝C双键还原生成2-氧代-4-苯基丁酸，最终利用苯丙氨酸脱氢酶催化的还原胺化生成L-高苯丙氨酸，在此过程中，利用甲酸脱氢酶进行NADH的再生。
进一步地，所述醛缩酶(PpNahE)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶(EcQOR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶(CbFDH)氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
在本发明中，进一步对苯丙氨酸脱氢酶进行了突变，获得了氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示的苯丙氨酸脱氢酶突变体，L-高苯丙氨酸转化率更高。
进一步地，所述的醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达在同一株宿主菌中或分别表达在不同株宿主菌中。
本发明的第二个目的是提供一种产L-高苯丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌共表达醛缩酶(PpNahE)、醌氧化还原酶(EcQOR)、苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)。
进一步地，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.10所示；所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
进一步地，所述的大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
进一步地，所述的醛缩酶和醌氧化还原酶以pCDFDuet-1为载体进行表达，所述的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶以pRSFDuet-1为载体进行表达。
本发明的第三个目的是提供所述的基因工程菌在生产L-高苯丙氨酸中的应用。
进一步地，所述的应用是在如下条件下，以所述的基因工程菌为催化剂，催化苯甲醛和丙酮酸合成L-高苯丙氨酸：
基因工程菌的菌体量为20～30g/L，辅酶NAD+为0.1～0.3mM，反应体系pH为7.5～8.5，反应温度为28～32℃，在反应过程中分批补加底物苯甲醛和丙酮酸，每批底物的补料量为40～60mM苯甲醛和40～60mM丙酮酸，在反应过程中，还包括分批补加甲酸铵，每批的补料量为90～130mM。
本发明的有益效果是：
本发明设计了一条以廉价的苯甲醛和丙酮酸为原料，利用级联酶法合成L-高苯丙氨酸的新路线，通过将路径酶构建到同一株大肠杆菌中，利用获得的重组大肠杆菌进行催化，在5L反应器中进行反应，产量在100.9g/L，转化率在94％，ee>99％。与目前主要的生产L-HPA的方法相比，极大的降低了L-高苯丙氨酸的生产成本，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为L-高苯丙氨酸合成路线；
图2为酶转化苯甲醛和丙酮酸合成2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸的HPLC(A)和MS(B)产物鉴定；
图3为酶法转化2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸合成2-氧代-4-苯基丁酸的HPLC(A)和MS(B)产物鉴定；
图4为酶法转化2-氧代-4-苯基丁酸合成L-高苯丙氨酸的HPLC(A)和MS(C)鉴定以及产物手性(B)鉴定；
图5为W13菌株反应条件优化；
图6为W13菌株在5L反应器中通过分批补料生产L-HPA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：L-高苯丙氨酸的级联路径
如图1所示：第一步首先以苯甲醛(1)和丙酮酸(2)为原料，通过醛缩酶(PpNahE)转化为4-羟基-2-氧代-4-苯基丁酸(3)，随后(3)自发脱水形成(E)-2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸(4)；第二步通过醌氧化还原酶(EcQOR)，以NAD+作为辅酶，将化合物(4)转化为化合物2-氧代-4-苯基丁酸(5)，第三步通过苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)，以NAD+作为辅酶，以游离的铵根离子作为供体，将化合物(5)转化为化合物L-高苯丙氨酸(6)，在此过程中，由于EcQOR和TiPheDH都需要消耗辅酶NADH，因此利用甲酸脱氢酶(CbFDH)通过消耗甲酸钠再生NADH。
实施例2：PpNahE-pET28a-BL21(DE3)工程菌的构建、表达与产物鉴定
以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida中目的蛋白序列通过金唯智公司进行合成(SEQ ID NO.1所示)并经过密码子优化后通过NdeI和XhoI连接在pET28a载体上。获得重组表达质粒PpNahE-pET-28a，将重组质粒PpNahE-pET-28a转化入E.coli BL21(DE3)，获得阳性的工程菌命名为PpNahE-pET28a-BL21(DE3)。
将PpNahE-pET28a-BL21(DE3)菌株转移至5mL LB液体培养基中(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)，37℃下过夜培养，随后，转接于200mL TB液体培养基中(胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，KH2PO4 2.31g/L和K2HPO4 12.31g/L。)，以200rpm、37℃下恒温培养，当OD值达到0.6-0.8之间后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，于16℃下诱导培养18h，离心后收集菌体。
随后，通过5mL催化反应体系为：50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 8.0)，湿菌体量为20g/L，苯甲醛(1)和丙酮酸(2)分别为50mM，在30℃下进行反应，取样，并过0.22μmol的滤膜。
通过Agilent 1260HPLC系统利用紫外检测器在210nm下检测底物的消耗和产物的生成。流动相A为含有0.1％TFA的水溶液，流动相B为含有0.1％TFA的乙腈溶液，液相柱采用ZORBAX SB-C18(4.6X 150mm，5μm)，流速为1mL，柱温为25℃，以75％的A和25％的B运行25min。如图2中A所示：酶催化得到的化合物(4)与标准品的出峰时间一致。随后将样品通过阴离子质谱分析，如图2中B所示，进一步确定了产物的生成。
实施例3：EcQOR-pET28a-BL21(DE3)工程菌的构建、表达与产物鉴定
以大肠杆菌E.coli.1655基因组中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.3所示)为模板，利用F1和R1为引物(下划线分别是NdeI和XhoI限制性酶切位点)PCR扩增，扩增条件为：
98℃30s，30个循环(98℃10s，55℃15s，72℃10s)，72℃10min。
F1：GGAATTCCATATGGCAACACGAATTGAATTTC(SEQ ID NO.11)；
R1：CCGCTCGAGTTATGGAATCAGCAGGCTGG(SEQ ID NO.12)。
获得的EcQOR基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与经同样双酶切的pET-28a质粒载体通过酶切连接，获得重组表达质粒，将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，获得阳性的工程菌命名EcQOR-pET28a-BL21(DE3)。
按照实施例2中表达条件得到菌体。随后，通过5mL催化反应体系为：50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 8.0)，湿菌体量为20g/L，化合物(4)为20mM，NADH为30mM，在30℃下进行反应，取样，并过0.22μmol的滤膜。
通过Agilent 1260HPLC系统利用紫外检测器在210nm下检测底物的消耗和产物的生成，液相柱采用ZORBAX SB-C18(4.6X 150mm,5μm)，流速为1mL/min，柱温为25℃，流动相为A为纯乙腈，流动相B为50mM的磷酸氢二铵，以16％的A和84％的B运行15min。如图3中A所示：经过生物催化，有与标准品相同的峰出现，说明有化合物(5)的生成，随后进一步通过阴离子质谱，如图3中B所示，进一步证明有产物(5)的生成。
实施例4：TiPheDH-pET22b-BL21(DE3)重组菌的构建、表达与产物鉴定
以中温放线菌Thermoactinomyces intermedius中目的蛋白序列通过金唯智公司进行合成(SEQ ID NO.5所示)并通过NdeI和XhoI连接在pET22b载体上。获得重组表达质粒TiPheDH-pET-22b，将重组质粒TiPheDH-pET-22b转化入E.coli BL21(DE3)，获得阳性的工程菌命名为TiPheDH-pET22b-BL21(DE3)。
采用实施例2相同的诱导方法，收集菌体，通过5mL催化反应体系为：50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 8.0)，湿菌体量为20g/L，化合物(5)为20mM，NADH为30mM，在30℃下反应后，取样，并过0.22μmol的滤膜。采用实施例2所描述的液相方法进行检测，如图4中A所示，有与标准品相同的峰出现，说明有L-HPA(6)的生成，随后进一步通过阴离子质谱，如图4中C所示，进一步证明有L-HPA(6)的生成。
随后通过Waters Alliance e2695 HPLC系统利用紫外检测器在210nm检测产物手性,液相柱采用DAICEL CHIRALPAK AD-H(250×4.6mm,5μm)，流速为1mL/min，柱温为25℃，流动相采用正己烷/乙醇＝90/10，并加入0.1％的TFA，运行时间为10min。如图4中B所示，与标准品L-高苯丙氨酸的出峰时间一致，且产物ee>99％。
实施例5：四酶共表达菌株的构建、表达与筛选
以Candida boidinii基因组中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.7所示)，以及实施例2、3和4中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5为模板。通过表一所示引物进行PCR获得目的基因，首先PpNahE和TipheDH通过EcoRI和HindIII与经同样双酶切的pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1质粒载体通过T4连接酶连接，随后将CbFDH和EcQOR再次通过NdeI和XhoI进行双酶切通过T4连接酶连接，获得8个质粒。
表1引物序列
Figure BDA0003710925390000061
注：下划线代表酶切位点
表2四酶共表达菌株
Figure BDA0003710925390000062
随后，将所获得的8个重组质粒，通过双抗性平板进行化转到BL21(DE3)，得到W1-W12基因工程菌(如表2所示)。采用实施例2相同的诱导方法，收集菌体。随后，通过以下5mL筛选体系进行筛选：50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 8.0)，20mM苯甲醛，20mM丙酮酸，0.2mM的NAD+，50mM的甲酸铵以及20g/L的湿菌体。如表2所示，W11菌株的转化率达到51.5％，为最佳菌株。
实施例6：限速酶苯丙氨酸脱氢酶TipheDH的改造
为了进一步提高L-HPA的产量，我们对W11菌株中的限速酶(TipheDH)进行了改造，首先对位点C70和T115进行半饱和突变，得到双突变体TipheDHC70A/T115E，其次，在双突变体的基础上，对蛋白表面的2个半胱氨酸C256和C282进行定点突变，得到四突变体TipheDHC70A//T115E/C256A/C282L，最后，在四突变体的基础上，将C端6个氨基酸截短，得到最终的突变体r360TipheDHC70A//T115E/C256A/C282L，其基因序列信息和氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQID NO.10所示。相比于野生型，其活性提高了0.82倍，表达量提高了2.54倍。将突变体r360TipheDHC70A//T115E/C256A/C282L代替W11菌株中的野生型TipheDH，得到最佳菌株W13，W13菌株的转化率达到95.3％。突变体采用全质粒PCR的方式得到，所用引物如表3所示。
所采用的蛋白纯化方法为：将收集的突变体通过超声破碎，将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。通过镍亲和层析，得到纯蛋白。
所采用的酶活检测方法为：使用酶标仪检测340nm波长下的紫外吸收来评价苯丙氨酸脱氢酶的活性。体系包括50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)，10mM(5)，1mM NADH和5μMTipheDH。一个酶活性单位是在1分钟内转化1μM NADH所需的酶量。
表3引物序列
Figure BDA0003710925390000071
实施例7：5L规模化生产
通过W13菌株优化了苯甲醛和丙酮酸生产L-HPA的反应条件。如图5所示，最佳反应条件为在pH 8.0，温度为30℃，菌体浓度为25g/L，辅酶NAD+的浓度为0.2mM。
最后，通过在5L发酵罐中进行反应，在最佳反应条件下，采用W13菌株进行分批补料催化，每批次分别加入50mM苯甲醛和丙酮酸和110mM的甲酸铵，共反应12批次，在反应过程中，通过6M HCI控制pH值在8.0。如图6所示，在12批次反应过程中，产量在100.9g/L，转化率在94％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 高效生产L-高苯丙氨酸的方法及一种产L-高苯丙氨酸的菌株
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgctgaaca aagtgattaa aaccacccgc ctgaccgcgg aagatattaa cggcgcgtgg 60
accattatgc cgaccccgag caccccggat gcgagcgatt ggcgcagcac caacaccgtg 120
gacctggatg aaaccgcgcg cattgtggaa gaactgattg cggcgggcgt gaacggcatt 180
ctgagcatgg gcacctttgg cgaatgcgcg accctgacct gggaagaaaa acgcgattat 240
gtgagcaccg tggtggaaac cattcgcggc cgcgtgccgt atttttgcgg caccaccgcg 300
ctgaacaccc gcgaagtgat tcgtcagacc cgcgaactga ttgatattgg cgcgaacggc 360
accatgctgg gcgtgccgat gtgggtgaaa atggacctgc cgaccgcggt gcagttttat 420
cgcgatgtgg cgggcgcggt gccggaagcg gcgattgcga tttatgcgaa cccggaagcg 480
tttaaatttg attttccgcg cccgttttgg gcggaaatga gcaaaattcc gcaagtggtg 540
accgcgaaat atctgggcat tggcatgctg gacctggacc tgaaactggc gccgaacatt 600
cgctttctgc cgcatgaaga tgattattat gcggccgcgc gcattaaccc ggaacgcatt 660
accgcgtttt ggagcagcgg cgcgatgtgc ggcccggcga ccgcgattat gctgcgcgat 720
gaagtggaac gcgcgaaaag caccggcgat tggattaaag cgaaagcgat tagcgatgat 780
atgcgcgcgg cggatagcac cctgtttccg cgcggcgatt ttagcgaatt tagcaaatat 840
aacattggcc tggaaaaagc gcgcatggat gcggcgggct ggctgaaagc gggcccgtgc 900
cgcccgccgt ataacctggt gccggaagat tatctggtgg gcgcgcagaa aagcggcaaa 960
gcgtgggcgg cgctgcatgc gaaatatagc aaataa 996
<210> 2
<211> 331
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Leu Asn Lys Val Ile Lys Thr Thr Arg Leu Thr Ala Glu Asp Ile
1               5                   10                  15
Asn Gly Ala Trp Thr Ile Met Pro Thr Pro Ser Thr Pro Asp Ala Ser
            20                  25                  30
Asp Trp Arg Ser Thr Asn Thr Val Asp Leu Asp Glu Thr Ala Arg Ile
        35                  40                  45
Val Glu Glu Leu Ile Ala Ala Gly Val Asn Gly Ile Leu Ser Met Gly
    50                  55                  60
Thr Phe Gly Glu Cys Ala Thr Leu Thr Trp Glu Glu Lys Arg Asp Tyr
65                  70                  75                  80
Val Ser Thr Val Val Glu Thr Ile Arg Gly Arg Val Pro Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Gly Thr Thr Ala Leu Asn Thr Arg Glu Val Ile Arg Gln Thr Arg Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Asp Ile Gly Ala Asn Gly Thr Met Leu Gly Val Pro Met Trp
        115                 120                 125
Val Lys Met Asp Leu Pro Thr Ala Val Gln Phe Tyr Arg Asp Val Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Val Pro Glu Ala Ala Ile Ala Ile Tyr Ala Asn Pro Glu Ala
145                 150                 155                 160
Phe Lys Phe Asp Phe Pro Arg Pro Phe Trp Ala Glu Met Ser Lys Ile
                165                 170                 175
Pro Gln Val Val Thr Ala Lys Tyr Leu Gly Ile Gly Met Leu Asp Leu
            180                 185                 190
Asp Leu Lys Leu Ala Pro Asn Ile Arg Phe Leu Pro His Glu Asp Asp
        195                 200                 205
Tyr Tyr Ala Ala Ala Arg Ile Asn Pro Glu Arg Ile Thr Ala Phe Trp
    210                 215                 220
Ser Ser Gly Ala Met Cys Gly Pro Ala Thr Ala Ile Met Leu Arg Asp
225                 230                 235                 240
Glu Val Glu Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asp Trp Ile Lys Ala Lys Ala
                245                 250                 255
Ile Ser Asp Asp Met Arg Ala Ala Asp Ser Thr Leu Phe Pro Arg Gly
            260                 265                 270
Asp Phe Ser Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Ile Gly Leu Glu Lys Ala Arg
        275                 280                 285
Met Asp Ala Ala Gly Trp Leu Lys Ala Gly Pro Cys Arg Pro Pro Tyr
    290                 295                 300
Asn Leu Val Pro Glu Asp Tyr Leu Val Gly Ala Gln Lys Ser Gly Lys
305                 310                 315                 320
Ala Trp Ala Ala Leu His Ala Lys Tyr Ser Lys
                325                 330
<210> 3
<211> 984
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atggcaacac gaattgaatt tcacaagcac ggtggcccgg aagtacttca agccgtagag 60
ttcactcctg ccgatccggc ggagaatgaa atccaggtcg aaaataaagc catcggcatc 120
aattttatcg acacatatat ccgcagcggc ctttacccgc cgccatcgct acccagcgga 180
ttaggcaccg aagcagcagg catcgtgagt aaagtcggca gtggtgtaaa gcatattaag 240
gcaggcgatc gtgtagtcta tgcgcagtcg gcgttaggcg cttacagctc tgtgcataac 300
attattgcgg ataaagcggc gattctgcct gcggcaattt cttttgagca agctgcggca 360
tccttcctga aaggcttaac ggtttattat ctgctgcgca aaacctatga aattaaaccc 420
gatgagcagt tcctgttcca cgcagcagct ggcggcgttg gcttgattgc ctgccagtgg 480
gcaaaagccc tgggcgcgaa acttatcggc accgtaggaa ccgcgcaaaa agcgcagagc 540
gcgctaaaag cgggcgcgtg gcaggttatt aactatcgtg aagagaatct ggtcgagcgg 600
ttaaaagaga tcaccggcgg taagaaagtg cgcgtggtgt acgattccgt gggcagagac 660
acctgggaac ggtcgctgga ttgcctgcaa cgccgcggct taatggtgag ttttggcaac 720
tcatcaggtg cggttaccgg tgtgaactta ggcattctca atcagaaagg ctcgttgtat 780
gtgacacgcc cttccctgca aggctatatc accacgcggg aggaattaac cgaggccagt 840
aatgaactgt tctctttgat tgccagcggt gtgattaagg tcgatgtcgc cgagcagcag 900
aaatatccgc tgaaggatgc gcagcgtgcg catgaaattc tggaaagccg ggcaacgcaa 960
ggttccagcc tgctgattcc ataa 984
<210> 4
<211> 327
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Ala Thr Arg Ile Glu Phe His Lys His Gly Gly Pro Glu Val Leu
1               5                   10                  15
Gln Ala Val Glu Phe Thr Pro Ala Asp Pro Ala Glu Asn Glu Ile Gln
            20                  25                  30
Val Glu Asn Lys Ala Ile Gly Ile Asn Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Arg
        35                  40                  45
Ser Gly Leu Tyr Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Gly Leu Gly Thr Glu
    50                  55                  60
Ala Ala Gly Ile Val Ser Lys Val Gly Ser Gly Val Lys His Ile Lys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Arg Val Val Tyr Ala Gln Ser Ala Leu Gly Ala Tyr Ser
                85                  90                  95
Ser Val His Asn Ile Ile Ala Asp Lys Ala Ala Ile Leu Pro Ala Ala
            100                 105                 110
Ile Ser Phe Glu Gln Ala Ala Ala Ser Phe Leu Lys Gly Leu Thr Val
        115                 120                 125
Tyr Tyr Leu Leu Arg Lys Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Asp Glu Gln Phe
    130                 135                 140
Leu Phe His Ala Ala Ala Gly Gly Val Gly Leu Ile Ala Cys Gln Trp
145                 150                 155                 160
Ala Lys Ala Leu Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Val Gly Thr Ala Gln
                165                 170                 175
Lys Ala Gln Ser Ala Leu Lys Ala Gly Ala Trp Gln Val Ile Asn Tyr
            180                 185                 190
Arg Glu Glu Asn Leu Val Glu Arg Leu Lys Glu Ile Thr Gly Gly Lys
        195                 200                 205
Lys Val Arg Val Val Tyr Asp Ser Val Gly Arg Asp Thr Trp Glu Arg
    210                 215                 220
Ser Leu Asp Cys Leu Gln Arg Arg Gly Leu Met Val Ser Phe Gly Asn
225                 230                 235                 240
Ser Ser Gly Ala Val Thr Gly Val Asn Leu Gly Ile Leu Asn Gln Lys
                245                 250                 255
Gly Ser Leu Tyr Val Thr Arg Pro Ser Leu Gln Gly Tyr Ile Thr Thr
            260                 265                 270
Arg Glu Glu Leu Thr Glu Ala Ser Asn Glu Leu Phe Ser Leu Ile Ala
        275                 280                 285
Ser Gly Val Ile Lys Val Asp Val Ala Glu Gln Gln Lys Tyr Pro Leu
    290                 295                 300
Lys Asp Ala Gln Arg Ala His Glu Ile Leu Glu Ser Arg Ala Thr Gln
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ser Leu Leu Ile Pro
                325
<210> 5
<211> 1101
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atgcgcgacg tgtttgaaat gatggaccgc tatggccacg agcaggtcat tttttgccgt 60
catccgcaaa ccggtctcaa agcgatcatc gccttgcata atacaaccgc ggggccggct 120
ttgggtggat gccgcatgat cccgtatgct tcgacggacg aagccttgga ggatgttttg 180
cggttgtcca aaggcatgac ctataaatgc agtctggcgg atgtggactt tggcggggga 240
aaaatggtta tcatcggcga tccgaaaaaa gataaatcgc cggagttgtt tcgcgtgatc 300
ggccgttttg tgggcgggtt aaacggccgt ttctataccg gaaccgacat gggaaccaat 360
ccggaagatt ttgtccatgc cgccagggaa tcgaaatctt ttgccggatt gccgaaatcg 420
tacggcggaa agggggacac atccattccc accgcgctcg gggtgtttca cggaatgcgg 480
gccaccgccc ggtttttatg ggggacggat cagctgaaag ggcgtgtggt tgccatccaa 540
ggagtcggca aggtgggaga gcgcttgttg cagcttttgg tcgaagtggg ggcttactgc 600
aaaattgccg acatcgattc ggtgcgatgc gaacagctga aagaaaagta tggcgacaag 660
gtccaattgg tggatgtgaa ccggattcac aaggagagtt gcgatatttt ctcgccttgc 720
gccaaaggcg gcgtggtcaa tgatgacacc attgacgagt tccgttgcct ggccattgtc 780
ggatccgcca acaaccaact ggtggaagac cggcatgggg cactgcttca aaaacggagc 840
atttgttatg cacccgatta tctggtgaat gccggcgggc tgattcaagt ggctgatgaa 900
ctggaaggct tccatgaaga gagagtgctc gccaaaaccg aagcgattta tgacatggtc 960
ctggatattt ttcaccgggc gaaaaatgag aatattacca cttgtgaggc agcggaccgg 1020
atcgtgatgg agcgtttgaa aaagttaacc gatattcgcc ggatcttgtt ggaggatccc 1080
cgcaacagcg caaggaggta a 1101
<210> 6
<211> 366
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 6
Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val
1               5                   10                  15
Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu
            20                  25                  30
His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro
        35                  40                  45
Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys
    50                  55                  60
Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu
                85                  90                  95
Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr
            100                 105                 110
Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala
        115                 120                 125
Arg Glu Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg
145                 150                 155                 160
Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val
                165                 170                 175
Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu
            180                 185                 190
Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val
        195                 200                 205
Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val
    210                 215                 220
Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Cys
                245                 250                 255
Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His
            260                 265                 270
Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Cys Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu
        275                 280                 285
Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe
    290                 295                 300
His Glu Glu Arg Val Leu Ala Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Met Val
305                 310                 315                 320
Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu
                325                 330                 335
Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile
            340                 345                 350
Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro Arg Asn Ser Ala Arg Arg
        355                 360                 365
<210> 7
<211> 1095
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
atgaagattg tcttagttct ttatgatgct ggtaagcacg ctgctgatga agaaaaatta 60
tatggttgta ctgaaaataa attaggtatt gctaattggt taaaagatca aggtcatgaa 120
ctaattacta cttctgataa agaaggtgaa acaagtgaat tggataaaca tatcccagat 180
gctgatatta tcatcaccac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagacttgac 240
aaggctaaga acttaaaatt agtcgttgtc gctggtgttg gttctgatca cattgattta 300
gattatatta atcaaacagg taagaaaatc tcagtcctgg aagttacagg ttctaatgtt 360
gtctctgttg ctgaacacgt tgtcatgacc atgcttgtct tggttagaaa tttcgttcca 420
gcacatgaac aaattattaa ccacgattgg gaggttgctg ctatcgctaa ggatgcttac 480
gatatcgaag gtaaaactat cgctaccatt ggtgctggta gaattggtta cagagtcttg 540
gaaagattac tcccatttaa tccaaaagaa ttattatact acgattatca agctttacca 600
aaagaagctg aagaaaaagt tggtgctaga agagttgaaa atattgaaga attagttgct 660
caagctgata tcgttacagt taatgctcca ttacacgcag gtacaaaagg tttaattaat 720
aaggaattat tatctaaatt taaaaaaggt gcttggttag tcaataccgc aagaggtgct 780
atttgtgttg ctgaagatgt tgcagcagct ttagaatctg gtcaattaag aggttacggt 840
ggtgatgttt ggttcccaca accagctcca aaggatcacc catggagaga tatgagaaat 900
aaatatggtg ctggtaatgc catgactcct cactactctg gtactacttt agacgctcaa 960
acaagatacg ctgaaggtac taaaaatatt ttggaatcat tctttaccgg taaatttgat 1020
tacagaccac aagatattat cttattaaat ggtgaatacg ttactaaagc ttacggtaaa 1080
cacgataaga aataa 1095
<210> 8
<211> 364
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 8
Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn
            20                  25                  30
Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu
        35                  40                  45
Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile
    50                  55                  60
Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp
65                  70                  75                  80
Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp
                85                  90                  95
His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
            100                 105                 110
Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val
        115                 120                 125
Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln
    130                 135                 140
Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly
                165                 170                 175
Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu
            180                 185                 190
Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly
        195                 200                 205
Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile
    210                 215                 220
Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn
225                 230                 235                 240
Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr
                245                 250                 255
Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro
        275                 280                 285
Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala
    290                 295                 300
Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln
305                 310                 315                 320
Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr
                325                 330                 335
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu
            340                 345                 350
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
        355                 360
<210> 9
<211> 1080
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
atgcgcgacg tgtttgaaat gatggaccgc tatggccacg agcaggtcat tttttgccgt 60
catccgcaaa ccggtctcaa agcgatcatc gccttgcata atacaaccgc ggggccggct 120
ttgggtggat gccgcatgat cccgtatgct tcgacggacg aagccttgga ggatgttttg 180
cggttgtcca aaggcatgac ctataaagct agtctggcgg atgtggactt tggcggggga 240
aaaatggtta tcatcggcga tccgaaaaaa gataaatcgc cggagttgtt tcgcgtgatc 300
ggccgttttg tgggcgggtt aaacggccgt ttctataccg gagaagacat gggaaccaat 360
ccggaagatt ttgtccatgc cgccagggaa tcgaaatctt ttgccggatt gccgaaatcg 420
tacggcggaa agggggacac atccattccc accgcgctcg gggtgtttca cggaatgcgg 480
gccaccgccc ggtttttatg ggggacggat cagctgaaag ggcgtgtggt tgccatccaa 540
ggagtcggca aggtgggaga gcgcttgttg cagcttttgg tcgaagtggg ggcttactgc 600
aaaattgccg acatcgattc ggtgcgatgc gaacagctga aagaaaagta tggcgacaag 660
gtccaattgg tggatgtgaa ccggattcac aaggagagtt gcgatatttt ctcgccttgc 720
gccaaaggcg gcgtggtcaa tgatgacacc attgacgagt tccgtgccct ggccattgtc 780
ggatccgcca acaaccaact ggtggaagac cggcatgggg cactgcttca aaaacggagc 840
attctgtatg cacccgatta tctggtgaat gccggcgggc tgattcaagt ggctgatgaa 900
ctggaaggct tccatgaaga gagagtgctc gccaaaaccg aagcgattta tgacatggtc 960
ctggatattt ttcaccgggc gaaaaatgag aatattacca cttgtgaggc agcggaccgg 1020
atcgtgatgg agcgtttgaa aaagttaacc gatattcgcc ggatcttgtt ggaggatccc 1080
<210> 10
<211> 360
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 10
Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val
1               5                   10                  15
Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu
            20                  25                  30
His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro
        35                  40                  45
Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys
    50                  55                  60
Gly Met Thr Tyr Lys Ala Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu
                85                  90                  95
Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr
            100                 105                 110
Thr Gly Glu Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala
        115                 120                 125
Arg Glu Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg
145                 150                 155                 160
Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val
                165                 170                 175
Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu
            180                 185                 190
Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val
        195                 200                 205
Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val
    210                 215                 220
Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Ala
                245                 250                 255
Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His
            260                 265                 270
Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu
        275                 280                 285
Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe
    290                 295                 300
His Glu Glu Arg Val Leu Ala Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Met Val
305                 310                 315                 320
Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu
                325                 330                 335
Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile
            340                 345                 350
Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro
        355                 360
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
ggaattccat atggcaacac gaattgaatt tc 32
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
ccgctcgagt tatggaatca gcaggctgg 29
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ggaattccat atgaagattg tcttagttct ttatg 35
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
ccgctcgagt tatttcttat cgtgtttacc g 31
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
cggaattcga tgcgcgacgt gtttgaaatg atgg 34
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
cccaagcttt tacctccttg cgctgttgcg gg 32
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
cggaattcga tgctgaacaa agtgattaaa acc 33
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
cccaagcttt tatttgctat atttcgcatg c 31
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
catgacctat aaanbtagtc tg 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
cagactavnt ttataggtca tg 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
tctataccgg agnngacatg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
catgtcnnct ccggtataga 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
attgacgagt tccgtgccct ggc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
gccagggcac ggaactcgtc aat 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
attgacgagt tccgtgtcct ggc 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
gccaggacac ggaactcgtc aat 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
caaaaacgga gcattctgta tgc 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
gcatacagaa tgctccgttt ttg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
caaaaacgga gcattgtgta tgc 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
gcatacacaa tgctccgttt ttg 23
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
ggatcttgtt ggaggatccc ctcgagcacc accaccacc 39
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
ggtggtggtg gtgctcgagg ggatcctcca acaagatcc 39

Claims (10)

1.一种高效生产L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以苯甲醛和丙酮酸为底物，采用醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶进行级联酶反应，催化底物生成L-高苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达在同一株宿主菌中或分别表达在不同株宿主菌中。
4.一种产L-高苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌共表达醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为Escherichiacoli BL21(DE3)。
8.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的醛缩酶和醌氧化还原酶以pCDFDuet-1为载体进行表达，所述的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶以pRSFDuet-1为载体进行表达。
9.权利要求4～8任一项所述的基因工程菌在生产L-高苯丙氨酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用是在如下条件下，以所述的基因工程菌为催化剂，催化苯甲醛和丙酮酸合成L-高苯丙氨酸：
基因工程菌的菌体量为20～30g/L，辅酶NAD+为0.1～0.3mM，反应体系pH为7.5～8.5，反应温度为28～32℃，在反应过程中分批补加底物苯甲醛和丙酮酸，每批底物的补料量为40～60mM苯甲醛和40～60mM丙酮酸，在反应过程中，还包括分批补加甲酸铵，每批的补料量为90～130mM。
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