CN102373246A

CN102373246A - 一种制备l-高苯丙氨酸的方法

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Publication number: CN102373246A
Application number: CN2010102602924A
Authority: CN
Inventors: 吴旭日; 陈依军; 张洁琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2030-08-24
Also published as: CN102373246B

Abstract

本发明公开了一种以高苯丙氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-高苯丙氨酸的工艺方法，具体包括以下步骤：在反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡或搅动反应后从反应体系中过滤直接得到L-高苯丙氨酸产物，滤液循环用于下一轮反应，反应温度为15～40℃。本发明利用高苯丙氨酸脱氢酶，配合辅酶循环再生体系，采用简单过滤循环工艺制备L-高苯丙氨酸，底物浓度达到560mM，所需的辅酶NAD⁺浓度较低，并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平，得率超过95％，具有重要应用价值。

Description

一种制备L-高苯丙氨酸的方法

技术领域

本发明属于手性医药中间体制备领域，涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法，具体涉及一种以2-氧代-4-苯基丁酸及其酯为底物，以高苯丙氨酸脱氢酶为生物催化剂，实现单一光学纯度的L-高苯丙氨酸高效制备的工艺方法。

背景技术

L-高苯丙氨酸，即(S)-2-氨基-4-苯基丁酸，分子式为C₁₀H₁₃NO₂，分子量为179.22，CAS号为943-73-7。L-高苯丙氨酸是一种非天然的手性α-氨基酸，该类氨基酸及其酯是用来制备血管紧张素(ACE)抑制剂类药物的重要原料。它是目前世界上约20种抗高血压新药的共同中间体，例如一方面可以直接用于制造如Enalapril(依那普利)、Benazepril(贝那普利)、Lisinopril(赖诺普利)、Captopril(卡托普利)、Temocapril、Cilazapril(西拉普利)等，另一方面可以通过制成双胜肽化合物(NEPA)来制造多种抗高血压药物如Sprirapril、Delapril(地拉普利)、Imidapril(咪哒普利)、Quinapril(喹那普利)等。

目前，合成普利类药物中间体L-高苯丙氨酸的方法主要为化学方法，包括化学拆分法和化学不对称合成法。前者利用手性拆分试剂对外消旋体进行拆分，但最大收率一般不超过50％(参见：Chem.Pharm.Bull.1989，37：280-283)；不对称合成法则利用手性催化剂催化直接得到对映异构体，但是存在诸多不足：反应过程复杂、反应条件苛刻(-60℃)、生产成本高、环境污染严重(参见：J.Am.Chem.Soc.1988，110：1547-1557)。

由于生物催化技术具有催化效率高、专一性强、反应条件温和环境污染小等优点，已逐渐被用于制备L-高苯丙氨酸。例如，利用乙内酰脲酶协同氨甲酰水解酶不对称分解相应的乙内酰脲，得到L-高苯丙氨酸(参见：J.Biotechnol.2008，134：231-239)，产率接近100％，但该法在原料合成中需要使用有毒性的物质。另一种较为通用的方法是氨基酸氨基转移酶催化相应的酮酸转氨的方法，例如专利号为200710021346.X的中国发明专利及Lo等(Biotechnol.Prog.2005，21：411-415)使用天冬氨酸转氨酶和美国专利US6146859使用色氨酸转氨酶成功合成L-高苯丙氨酸，获得大于95％的产率和高度立体选择性，但该法原料所用的氨基供体氨基酸增加生产成本，且转氨酶活性通常在高底物浓度时受到抑制。此外，采用高苯丙氨酸脱氢酶还原氨化2-氧代-4-苯基丁酸的方法亦被用于制备L-高苯丙氨酸，该方法转化率达99.1％，ee值大于99.1％，但是该方法受到反应底物浓度相对较低(200mM)、辅酶投入量大(10mM)导致成本过高、膜反应器操作复杂等因素的制约(参见：J.Org.Chem.1990，55：5567-5571；Biotechnol.Adv.2009，27：286-296)。

因此，建立一种高效制备L-高苯丙氨酸的生物催化工艺以提高底物浓度、减少辅酶投入和简化生产流程，对降低生产成本具有广泛的实用价值和重要意义。

发明内容

本发明的目的是建立一种制备L-高苯丙氨酸的方法，在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；

所述反应液为水或pH为7.0～9.0的缓冲液；

所述底物为2-氧代-4-苯基丁酸或其酯，其结构式为：

其中R为H或C_1～2的烷基，底物浓度为10mM～680mM；优选底物浓度为10mM～565mM；更优选200～565mM；

所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1～10∶1；

所述高苯丙氨酸脱氢酶的浓度大于等于5U/mL，高苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比例为0.8～1.0∶1；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD⁺浓度大于等于0.1mM；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环体系属于本领域技术人员公知的常规现有技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶；

上述技术方案中，各试剂的添加顺序为任意随机的次序，无严格要求；

(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液pH至7.0～9.0，于15～50℃下，反应制备L-高苯丙氨酸，反应完成后过滤分离L-高苯丙氨酸和滤液，得到L-高苯丙氨酸。

优选的技术方案中，步骤(2)中，在保持反应进行的同时，补加底物；补加底物的方式选自：一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于等于680mM。

进一步的技术方案中，步骤(2)之后还包括以下步骤：

(3)循环利用滤液，向滤液中补加底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶；用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液pH至7.0～9.0，振荡或搅拌条件下，于15～50℃下，反应制备L-高苯丙氨酸，重复该步骤直至转化率低于90％；

其中，高苯丙氨酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中高苯丙氨酸脱氢酶用量的一半，甲酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中甲酸脱氢酶用量的一半；补加后，底物和甲酸铵的浓度与步骤(1)相同，即底物浓度为10mM～680mM；所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1～10∶1。

其中，步骤(3)中，向滤液中补加底物时，补加的方式选自：一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种。

上述技术方案中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种：[a]将甲酸铵和底物按照摩尔比为1∶1～10∶1溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM；[b]将底物和助溶剂混合溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到的底物储液浓度小于等于2191mM；所述助溶剂选自：十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或一种以上的混合物；优选的技术方案中，所述助溶剂选自：1％正己烷(v/v)或1％乙醇(v/v)。

上述技术方案中，所述高苯丙氨酸脱氢酶的制备见文献Enzyme Microb.Technol.2000，26：348-358，反应形式为酶或全细胞。所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系是常规技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD⁺和甲酸脱氢酶，本领域的技术人员可以根据实际情况选择合适的组分和用量。

上述技术方案中，所述步骤(2)中所述过滤分离的步骤可以采用自然过滤、抽滤、加压过滤或离心过滤等方式去所述L-高苯丙氨酸，过滤分离后向滤液中补加底物、甲酸铵、甲酸脱氢酶和高苯丙氨酸脱氢酶，无需重新补加辅酶及其循环体系，然后进行新一轮反应。

进一步的技术方案，经过滤、洗涤以及干燥后获得高纯度L-高苯丙氨酸。

上述技术方案中，所述pH值为7.0～9.0的缓冲液的制备方法为现有技术，优选缓冲液为磷酸盐缓冲液、水或Tris-Hcl缓冲液。

上述技术方案中，优选的反应温度为15～40℃；优选的pH值为8.0～9.0。

优选的技术方案中，反应液中加入二硫苏糖醇(DTT)，稳定酶的活性。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、由于本发明采用甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，有效地与高苯丙氨酸脱氢酶配合，实现辅酶再生；同时，采用循环反应的方式实现了辅酶的反复利用，使辅酶成本降低至可以忽略的水平。

2、由于本发明采用底物补加方式，因此能够避免酶的底物抑制现象，有利于提高底物浓度。

3、底物浓度在一次完全加入的情况下，现有技术一般只有200mM，而本发明在反应pH(pH 7.0～9.0)范围内可以达到500mM以上。

4、由于本发明采用的氨基供体为铵盐，价格低廉，因此可以降低成本。

5、本发明工艺简单，成本低廉，一步过滤即可得到纯度大于95％的L-高苯丙氨酸产物，得率极高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例中制备L-高苯丙氨酸的示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，制备过程示意图参见图1，具体包括如下步骤：在5mL的反应体系中，依次加入底物2-氧代-4-苯基丁酸，甲酸铵，磷酸缓冲液，NAD⁺，高苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，所述反应体系含有：底物2-氧代-4-苯基丁酸2g/L(11mM)，甲酸铵11～110mM，0.1M(pH 8.0)磷酸缓冲液，NAD⁺0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶5U/mL，甲酸脱氢酶5.6U/ml，用浓氢氧化钾和磷酸维持pH，室温搅动反应15～20小时，反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率为99.9％。

所述的高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶可以通过下述方法得到：将表达的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌用50mM(pH 8.0)NH₄COOH溶液，按20％重悬，30kpsi高压破碎，4℃，12,000g离心10-20min，得上清，PDH酶活力为12.0U/mL，FDH酶活力为13.4U/mL。

2-氧代-4-苯基丁酸的转化率和产物纯度用反相C18柱(5μm，4.6×250mm，Shimadzu，Japan)进行高效液相(Shimadzu 2010A HT，Japan)分析，流动相为：A泵水(含0.1％三氟乙酸)，B泵乙腈(含0.1％三氟乙酸)，10-90％的梯度洗脱时间为14min，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长220nm；出峰顺序依次为：S-2-氨基-4-苯基丁酸(7.05min)，2-氧代-4-苯基丁酸(11.0min)；S-2-氨基-4-苯基丁酸乙酯(9.4min)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(14.1min)。

实施例二

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制1mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯5g/L(25mM，50μl乙醇助溶)，甲酸铵25～250mM，0.1M(pH 8.5)磷酸缓冲液，NAD⁺0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶5U/mL，甲酸脱氢酶5.6U/ml，室温摇动反应20小时。反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率为99.9％。

实施例三

底物储液制备包括如下步骤：将甲酸铵和底物按照摩尔比为1∶1～10∶1溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液或水，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM。

实施例四

底物储液制备包括如下步骤：将底物和助溶剂SDS、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或一种以上的混合物，按照一定比例混合溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0。当十二烷基硫酸钠SDS的用量(w/v)分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％和1.5％时，底物储液浓度分别可达到1573mM、1742mM、1966mM、2022mM、2079mM、2191mM和2191mM，其他助溶剂配置底物储液的结果如下：

N表示底物溶解度小于其在水或缓冲液中的溶解度(850mM).

实施例五

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸18g/L(100mM)，甲酸铵100～1000mM，0.1M(pH 7.0)磷酸缓冲液或0.1M(pH 9.0)磷酸缓冲液，NAD⁺0.5mM，DTT 0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶5U/mL，甲酸脱氢酶5.6U/ml，并用氢氧化钠和硫酸维持pH，室温搅动反应20小时。反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。pH7.0时底物转化率为80.1％，pH 9.0时底物转化率为99.0％。

实施例六

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸18g/L(100mM)，甲酸铵100～1000mM，水(pH 8.0)或0.1M(pH 8.5)Tris-HCl缓冲液或0.1M(pH8.0)硼酸缓冲液，NAD⁺0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶5U/mL，甲酸脱氢酶5.6U/ml，并用浓氨水和醋酸维持反应pH，室温搅动反应20小时。反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率分别为99.0％、99.5％和31.5％。

实施例七

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：依次加入底物2-氧代-4-苯基丁酸18g/L(100mM)，甲酸铵100～1000mM，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.5mM，DTT 0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶5U/mL，甲酸脱氢酶5.6U/ml，15℃或40℃或50℃，并用氢氧化钾和盐酸维持反应pH，搅动反应20小时。反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，15℃底物转化率为99.5％，40℃底物转化率为99.4％，50℃底物转化率为75.3％。

实施例八

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸20g/L(112mM)，甲酸铵0.45～4.5M，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶7U/mL，甲酸脱氢酶7.8U/ml，室温下振荡反应，起始后分别补加用0.2％SDS(w/v)、0.4％SDS(w/v)、0.6％SDS(w/v)、1％石油醚(v/v)、1％乙酸乙酯(v/v)、1％乙醇(v/v)、1％正丁醇(v/v)、1％二氧六环(v/v)、1％正戊烷(v/v)或1％正己烷(v/v)助溶的底物0.3g，并用浓氨水和盐酸维持pH，室温搅动反应5小时。反应结束后，过滤获得L-高苯丙氨酸，高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率分别为0.3％、0.3％、0.3％、52.9％、68.3％、89.1％、61.3％、69.7％、77.0％和82.1％。

实施例九

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制1mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸10mM，甲酸铵10～100mM，0.1M(pH 8.0)磷酸缓冲液，NAD⁺0.5mM，含高苯丙氨酸脱氢酶的大肠杆菌5U，含甲酸脱氢酶大肠杆菌5.0U，室温摇动反应10小时，底物转化率为99.5％。

实施例十

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸20g/L(112mM)，甲酸铵112～1120mM，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.5mM，DTT 0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶7U/mL，甲酸脱氢酶7.8U/ml，室温下振荡反应，起始后补加底物0.2g，并用0.5N NaOH和0.5N盐酸维持反应pH。反应3小时后，过滤反应液，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，共循环四次，共投入底物1.2g，甲酸铵0.85g，每一个循环底物浓度均为60g/L(336mM)，用酸碱溶液控制反应pH在7.5～8.5之间，转化率为99.5％。相同方法平行三组实验，每组循环四次，共投入底物分别为1.6g、2.0g和2.4g，甲酸铵1.13g、1.42g和1.70g，底物浓度分别为80g/L(450mM)，100g/L(562mM)和120g/L(674mM)。相应的转化率为98％，94.5％和3.75％。

实施例十一

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸20g/L(112mM)，甲酸铵112～1120mM，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.1～0.5mM，DTT 0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶7U/mL，甲酸脱氢酶7.8U/ml，室温下振荡反应，起始后补加底物0.4g，并用0.5N NaOH和0.5N硫酸维持反应pH。反应3小时后，过滤反应液，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，共循环四次，共投入底物2.0g，甲酸铵1.78g，每一个循环底物浓度均为100g/L(562mM)，用0.5N NaOH和0.5N硫酸维持反应pH在7.5～8.5之间。当NAD⁺浓度大于或等于0.2mM时转化率大于95％。

实施例十二

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸20g/L(112mM)，甲酸铵112～1120mM，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.2mM，高苯丙氨酸脱氢酶7U/mL，甲酸脱氢酶7.8U/ml，室温下振荡反应，起始后补加底物0.3g，并用0.5N NaOH和0.5N甲酸维持pH。反应3小时后，过滤反应液，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，共循环8次，共投入底物3.2g，甲酸铵2.84g，反应pH始终维持在7.5～8.5之间，最终产物得率为95％。

实施例十三

一种制备L-高苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：配制5mL的反应体系，所述反应体系包括：底物2-氧代-4-苯基丁酸20g/L(112mM)，甲酸铵112～120mM，0.1M(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，NAD⁺0.3mM，DTT 0.5mM，高苯丙氨酸脱氢酶7U/mL，甲酸脱氢酶7.8U/ml，室温下振荡反应，起始后补加底物0.3g，并用0.5N NaOH和0.5N醋酸维持pH。反应3小时后，过滤反应液，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，共循环12次，共投入底物4.8g，甲酸铵3.40g，反应pH始终维持在7.5～8.5之间，最终产物得率为95％。

Claims

1.一种制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述反应液为水或pH为7.0～9.0的缓冲液；

所述底物为2-氧代-4-苯基丁酸或其酯，其结构式为：

其中R为H或C_1～2的烷基，底物浓度为10mM～680mM；

所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1～10∶1；

所述高苯丙氨酸脱氢酶的浓度大于等于5U/mL，高苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比例为0.8～1.0∶1；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD⁺浓度大于等于0.1mM；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，底物浓度为200mM～565mM。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在保持反应进行的同时，补加底物；补加底物的方式选自：一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于等于680mM；其中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种：[a]将甲酸铵和底物按照摩尔比为1∶1～10∶1溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM；[b]将底物和助溶剂混合溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到的底物储液浓度小于或等于2191mM。

4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)之后还包括以下步骤：

其中，高苯丙氨酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中高苯丙氨酸脱氢酶用量的一半，甲酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中甲酸脱氢酶用量的一半；补加后，底物浓度为10mM～680mM；所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1～10∶1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，向滤液中补加底物时，补加的方式选自：一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；其中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种：[a]将甲酸铵和底物按照摩尔比为1∶1～10∶1溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM；[b]将底物和助溶剂混合溶于pH值为7.0～9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0～9.0，配制得到的底物储液浓度小于或等于2191mM。

6.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于，所述助溶剂选自：十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或一种以上的混合物。