CN103276025B - L-杂环氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L-杂环氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物。该合成方法包括：步骤A，制备杂环酮酸，其中，杂环酮酸中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环酮酸中的酮酸基的结构式为且位于杂环的任一碳位上；步骤B，将杂环酮酸与甲酸铵、苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，进行还原氨基化反应，生成L-杂环氨基酸，其中，苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。利用特定苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶、辅酶NAD+使杂环酮酸发生还原氨基化反应生成L-杂环氨基酸，原料转化率高，手性选择性高。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体而言，涉及一种L-杂环氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物。
背景技术
目前，合成手性非天然的杂环氨基酸，主要是采用化学方法，包括使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化、使用手性试剂拆分消旋体、利用手性辅基不对称合成、使用手性原料的定向合成等方法。然而这些方法存在以下一些缺陷：
（1）使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化，其缺点是贵重金属不对称催化剂价格昂贵，反应需要大量有机溶剂，产物中有重金属残留且可能存在过度还原的副产物，而且因为合成的原料中含有杂环，常常会干扰贵重金属与配体的结合，造成催化效率不高。
（2）采用传统的手性拆分方法，得到消旋体中一个需要的异构体，会造成另外一半的原料浪费。
（3）利用手性辅基或手性原料的不对称合成，涉及到价格昂贵的手性原料、较长的合成路线以及大量的有机溶剂，而且对于某些杂环氨基酸的合成，得到的产品光学纯度不高，或者产品和杂质不易分离。
现有技术中也有一些文献报道采用生物合成的方法，通过使用特定的酶催化，将一些简单烷基的酮酸转化为对应的氨基酸。但是，由于杂环氨基酸的性质比较特殊，现有技术目前还没有找到合适的酶以及相应的反应条件，来通过生物转化合成带手性杂环结构的氨基酸。
发明内容
本发明旨在提供一种L-杂环氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物，得到了光学纯度较高的L-杂环氨基酸。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种L-杂环氨基酸的合成方法，包括：步骤A，制备杂环酮酸，其中，杂环酮酸中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环酮酸中的酮酸基的结构式为且位于杂环的任一碳位上；步骤B，将杂环酮酸与甲酸铵、苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，进行还原氨基化反应，生成L-杂环氨基酸，其中，苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
进一步地，编码上述苯丙氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.2。
进一步地，上述苯丙氨酸脱氢酶的表达过程包括：将包含基因序列的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；将基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导苯丙氨酸脱氢酶的产生；对宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，粗酶混合液中包含苯丙氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶。
进一步地，上述粗酶混合液中，苯丙氨酸脱氢酶的酶比活为40～60U/ml，甲酸脱氢酶的酶比活为20～30U/ml。
进一步地，上述步骤B包括：将杂环酮酸和甲酸铵加入水溶液中，调节pH值至8.2～8.5，加入粗酶混合液以及辅酶NAD+，于30～40℃下反应至原料转化完毕，得到L-杂环氨基酸。
进一步地，上述对应于每摩尔杂环酮酸，粗酶混合液的添加量为2～10ml；对应于每摩尔杂环酮酸，辅酶NAD+的添加量为0.005～0.1摩尔，甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。
进一步地，上述合成方法在步骤B之后还包括：在反应后的体系中加入浓盐酸，过硅藻土，得到滤出液；将滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；将粗品浓缩，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的L-杂环氨基酸。
进一步地，上述杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：使杂环酮与乙酐、乙酸钠、N-乙酰基甘氨酸反应，得到中间产物，其中，杂环酮中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环酮的酮基的结构式为且位于杂环酮的任一碳位上；使中间产物在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化后得到杂环酮酸。
进一步地，上述杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：将杂环烷基化合物与草酸二乙酯在正丁基锂或叔丁醇钾存在的条件下反应，生成杂环酮酸酯，其中，杂环烷基化合物中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环烷基化合物的烷基为甲基且位于杂环烷基化合物的任一碳位上；将杂环酮酸酯在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化得到杂环酮酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，包括药物有效剂量的如权利要求1至9中任一项的合成方法合成得到的L-杂环氨基酸以及药用载体。
应用本发明的技术方案，利用氨基酸序列为SEQ ID No.1的特定苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+进行配合使杂环酮酸发生还原氨基化反应生成L-杂环氨基酸，手性中心在苯丙氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成，原料的转化率达80%以上，手性选择性高，得到的产物不涉及异构体的分离和纯化，进而简化了L-杂环氨基酸的合成工艺；而且，整个合成过程的反应条件温和，更能适应L-杂环氨基酸的工业化大规模生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种L-杂环氨基酸的合成方法，包括：步骤A，制备杂环酮酸，其中，杂环酮酸中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环酮酸中的酮酸基的结构式为且位于杂环的任一碳位上；步骤B，将杂环酮酸与甲酸铵、苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，进行还原氨基化反应，生成L-杂环氨基酸，其中，苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
上述合成方法利用氨基酸序列为SEQ ID No.1的特定苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+进行配合使杂环酮酸发生还原氨基化反应生成L-杂环氨基酸，手性中心在苯丙氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成，原料的转化率达80%以上，手性选择性高，得到的产物不涉及异构体的分离和纯化，进而简化了L-杂环氨基酸的合成工艺；而且，整个合成过程的反应条件温和，更能适应L-杂环氨基酸的工业化大规模生产。
本发明的五元单杂环、五元烷基取代单杂环包括但不限于吡咯、咪唑、三唑、呋喃、吡唑、噻吩及其对应的化学可接受的烷基取代单杂化环，六元单杂环、六元烷基取代单杂化包括但不限于吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪及其对应的化学可接受的烷基取代单杂环，七元单杂环、七元烷基取代单杂环包括但不限于吲哚、喹啉、蝶啶、吖啶及其对应的化学可接受的烷基取代单杂环，且其中的烷基选自甲基、乙基、丙基和丁基中的任一种，优选甲基。上述合成方法中，编码苯丙氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.2。
上述基因序列编码的苯丙氨酸脱氢酶对催化杂环酮酸与甲酸铵合成L-杂环氨基酸的选择性和催化转化率均较好。
在本发明的一种优选的实施例中，上述苯丙氨酸脱氢酶的表达过程包括：将包含上述基因序列的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；将上述基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导苯丙氨酸脱氢酶的产生；对宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，该粗酶混合液中包含苯丙氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶。
上述利用具有上述基因序列的DNA片段插入载体后得到基因重组质粒，并且利用该基因重组质粒配合诱导剂的诱导作用得到的苯丙氨酸脱氢酶的活力和含量均较好，将宿主菌破碎、离心后得到的粗酶混合液中既含有苯丙氨酸脱氢酶又含有甲基营养型宿主菌本身所含有的甲酸脱氢酶，本发明可直接利用该粗酶混合液催化酮酸向氨基酸的转化。
在上述实施例的实施过程中，温度、培养基的改变都会影响所得到的粗酶液中苯丙氨酸脱氢酶的以及甲酸脱氢酶的酶比活，所得到的粗酶混合液都能应用于本发明，且优选得到的粗酶混合液中，苯丙氨酸脱氢酶的酶比活为40～60U/ml，甲酸脱氢酶的酶比活为20～30U/ml。利用具有上述酶比活的粗酶混合液在催化酮酸向L-杂环氨基酸的转化过程中不仅手性选择性更高，催化效率更好。
在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法的步骤B包括：将杂环酮酸和甲酸铵加入水溶液中，调节pH值至8.2～8.5，加入粗酶混合液以及辅酶NAD+，于30～40℃下反应至原料转化完毕，得到L-杂环氨基酸。上述步骤B中利用水做溶剂从而大大降低了生产成本，而且无有机溶剂的产生，合成工艺绿色环保，进一步适应工业化的大规模生产。
为了进一步从原料上控制成本并且通过调控各原料的用量比来得到尽量多的产物，优选对应于每克杂环酮酸，粗酶混合液的添加量为2～10ml；对应于每摩尔杂环酮酸，辅酶NAD+的添加量为0.005～0.1摩尔，甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。
在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法在步骤B之后还包括：在反应后的体系中加入浓盐酸，过硅藻土，得到滤出液；将滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；将粗品浓缩，调节pH值至7.0，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的L-杂环氨基酸。由于本发明的手性选择性较高，在对产物的分离纯化中不涉及异构体的分离和纯化，进而使得本发明的分离方法比较简单，只需要将产物与酶、原料等进行分离即可。
在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法中所应用的杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：使杂环酮与乙酐、乙酸钠、N-乙酰基甘氨酸反应，得到中间产物，其中，杂环酮中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环酮的酮基的结构式为且位于杂环酮的任一碳位上；使上述中间产物在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化后得到杂环酮酸。
上述合成杂环酮酸的路线较短，而且并没设计使用贵重金属催化剂，从而保证了得到的杂环酮酸中不存在重金属残留的问题；在后续的合成L-杂环氨基酸的过程中叶没有使用贵重金属催化剂，进一步保证了得到的L-杂环氨基酸中也不存在重金属残留的问题。
在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法中所应用的杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：将杂环烷基与草酸二乙酯在正丁基锂或叔丁醇钾存在的条件下反应，生成杂环酮酸酯，其中，杂环烷基化合物中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，杂环烷基化合物的烷基为甲基且位于杂环烷基化合物的任一碳位上；将杂环酮酸酯在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化得到杂环酮酸。
同样，上述合成杂环酮酸的路线较短，而且并没设计使用贵重金属催化剂，从而保证了得到的杂环酮酸中不存在重金属残留的问题；在后续的合成L-杂环氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂，进一步保证了得到的L-杂环氨基酸中也不存在重金属残留的问题。
在本发明的另一种典型的实施方式中，提供了一种药物组合物，包括药物有效剂量的上述合成方法合成得到的L-杂环氨基酸以及药用载体。本发明的L-杂环氨基酸的纯度较高，因此具有其的药物组合物的相对于现有技术中的具有L-杂环氨基酸的药物组合物的靶点更小、副作用更低。
下面将结合实施例和对比例进一步说明本发明的有益效果。
以下实施例所用的苯丙氨酸脱氢酶为氨基酸序列为SEQ ID No.1的苯丙氨酸脱氢酶，其中编码实施例1至8的苯丙氨酸脱氢酶的基因序列来源于球形芽孢杆菌。
苯丙氨酸脱氢酶的表达过程如下：
将包含基因序列SEQ ID No.2的DNA片段插入pET-22b(+)载体，得到基因重组质粒；将上述基因重组质粒转化入大肠杆菌BL21，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导苯丙氨酸脱氢酶的产生；对大肠杆菌BL21进行超声波破碎，然后离心分离得到具有酶比活为38～70U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为15～35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液。
实施例1
L-4-吡啶基丙氨酸的合成
1）、向四口瓶加入904.2g、1.5eq叔丁醇钾、2L四氢呋喃和500g4-甲基吡啶，室温搅拌2.5h，滴加941.1g草酸二乙酯，加毕，室温搅拌过夜至反应完毕，具体反应如下式。体系暂存直接投第二步。
2）、将上一体系加入瓶中，然后向其中加入1L甲醇、2L H2O，783.6g叔丁醇钾，保温反应至无原料，具体反应如下式。然后浓缩，并将浓缩后的体系降至室温，用6mol/L盐酸调节pH值在2～3之间，向其中加3体积倍的水稀释，抽滤，滤液降至0～5℃抽滤，得到640g固体，两步收率72.2%。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.45（d，2H），8.03(d，2H)，7.55(d，1H)。
3）、向2L四口瓶中加入150mL纯化水、12.1g氢氧化钠，搅拌至全溶，然后加入50g酮酸，继续搅拌至体系全溶，并检测到pH值在9～10之间，向其中加28.6甲酸铵，用NaOH将体系pH值调节至8.2～8.5，加入具有酶比活为50U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为25U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液500mL、2.0g NAD+，然后将体系升温至30～40℃反应至无原料，具体反应式如下。将反应后的体系用100mL浓盐酸调至pH值在1～2之间，过硅藻土得滤液，然后用NaOH将滤液调至pH值在6～7之间，过强酸性盐离子交换树脂得到粗品；将粗品浓缩然后用甲酸调至pH值为7，加乙醇洗涤，得到类白色固体，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.5%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.58（d，2H），7.90(d，2H)，4.45(t，1H)，3.47（dd，2H）
实施例2
L-2-吡啶基丙氨酸的合成
1）、2L四口瓶中加入800mL四氢呋喃和152g(1.4eg)重蒸二异丙胺，搅拌降温至-50～-40℃，在-50～-40℃下滴加590mL正丁基锂（2.55N，1.4eq）,后搅拌0.5h，继续降温至-80～-70度，在-80～-70度滴加100g2-甲基吡啶后保温反应2h后TLC跟踪至原料消失，得体系A；
向3L四口瓶加入200mL四氢呋喃和172g草酸二乙酯，搅拌均匀后降温至-80～-70℃，得体系B；
在-80～-70℃下将体系A压入体系B中，搅拌1h后TLC跟踪至反应毕，回温至-60℃，控制体系温度低于-20℃用2mol/L的盐酸将体系PH调节至5～6之间，将体系升温至室温，分液后水相分别用300mL乙酸乙酯萃取三次，萃取后的有机相合并后用硫酸钠干燥过夜，抽滤后母液浓缩至有大量固体析出，继续抽滤得到105g粗品1。
2）、将100g上述粗品1溶于200mL浓度为2mol/L氢氧化钠溶液中，升温至60～70℃，保温反应6～8h后，TLC跟踪反应完毕，降温至15～25℃后用200mL乙酸乙酯洗涤，得到的水相降温至0～5℃，并在0～5℃下用浓盐酸将水相的pH值调节至1～2析出固体，抽滤，滤饼用40mL冰水洗涤，得到26g粗品2。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.50（d，1H），7.89(t，1H)，7.47(d，1H)，7.29(t，1H)，6.53（s，1H）。
3）、向1L四口瓶中加入7.91g NaOH、100mL纯化水、酮酸32.6g、甲酸铵24.9g，体系pH值在8.2～8.5之间，向其中加入326ml具有酶比活为40U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为30U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液和1.31g NAD+，然后将体系升温至30～40℃，反应过夜后跟踪原料转化完毕，然后向体系中加入65mL浓盐酸，过硅藻土后得滤液，用NaOH将该滤液的pH值调节至7，然后经过强酸性阳离子交换树脂得到粗品3，将该粗品3浓缩，然后用甲酸将该粗品3的pH值调节至7，利用异丙醇水洗后得到12.8g固体，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.6%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.66（d，1H），8.48(t，1H)，7.97(d，1H)，7.91(t，1H)，4.23（t，1H），3.58（d，2H）。
实施例3
L-3-吡啶基丙氨酸的合成
1）、向20L四口瓶中加入5.7L乙酐、946g乙酸钠、1350g乙酰基甘氨酸和950g3-吡啶甲醛，升温至100～105℃后反应4h，然后将体系降温至5℃以下，抽滤，滤饼使用冰水洗，得到1100g固体产物1。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ9.01（s，1H），8.58(d，1H)，8.55（d，1H）,7.38(t，1H)，7.04(s，1H)，2.15（s，3H）。
2）、向20L四口瓶中加入1100g固体产物1、5.5L二氧六环和5.5L浓度为4mol/L的盐酸，体系回流反应3.5h后降至室温，然后将体系浓缩至大部分液体被蒸出，然后将浓缩后的体系抽滤，滤饼用550mL冰水淋洗，再用550mL丙酮淋洗得到391g黄色固体产物2。1HNMR(400MHz,DMSO)：δ10.13（d，1H），9.80(d，1H)，9.72(d，1H)，9.01(t，1H)，7.56（s，1H）。
3）、室温下，向3L四口瓶中加入纯水及36gNaOH，向体系中加入60g2-羰基-3-（吡啶-3-基）丙酸，搅拌至全溶，向其中加入45.4g甲酸铵，600mL具有酶比活为60U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为20U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液和2.39gβ-NAD+，以浓氨水将体系pH值调节至8.5后升温至30～40℃反应4天，4天后向体系中缓慢滴加100mL浓盐酸以调节体系pH值为1～2，分液后水相过1～2cm的硅藻土垫得滤液，将滤液在冰浴下利用氢氧化钠将pH值调节至7后，与投料量分别为63g和50g并通过上述过程得到的滤液合批过树脂柱纯化(树脂型号001×7强酸性阳离子交换树脂，树脂量15L)，所得粗品在冰盐浴下加依次采用90mL和60mL纯水搅拌洗涤，抽滤得滤饼，所得滤饼先后以异丙醇100mL、无水乙醇80mL淋洗，烘干得77g淡黄色固体，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.5%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.43（d，2H），7.87(d，1H)，7.50(t，1H)，3.97(t，1H)，3.24（dd，2H）。
实施例4
L-2-吡唑基丙氨酸的合成
1）、在-20℃氮气保护下，向560ml溶有50g化合物1的四氢呋喃的溶液滴加入244ml正丁基锂，将混合物在-20℃下搅拌1h后向其中逐滴加入135克二甲基甲酰胺，继续搅拌2h后，具体反应式如下，将反应物用1mol/L的氯化铵淬灭，并浓缩以除去四氢呋喃，将残余物溶于乙胺和水中，分离、洗涤、合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥、过滤、浓缩得到棕色油状物的粗化合物2，直接用于下一个步骤。
2）、在室温下向286ml含有57.2g化合物D的水溶液中加入17.4克化合物E、63g化合物2形成混合物，将该混合物加热至100℃。搅拌3h后冷却至室温，过滤得沉淀物，将该沉淀物用水洗涤后干燥，得到45g黄色固体即化合物3。1H NMR(400MHz，DMSO)：δ7.47（d，1H），6.93(d，1H)，6.34(s，1H)，3.88(s，3H)。
3）、向300ml溶有52gNaOH的水溶液中加入50克化合物3的混合溶液，将所得的混合溶液加热至100℃，并搅拌2h后冷却至室温得混合物，具体反应式如下，用浓盐酸调整该混合物的pH值至3～4，过滤该混合物，将沉淀物用水洗涤干燥，得到26g白色固体产物59%收率。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.68（d，1H），6.96(d，1H)，6.68(s，1H)，4.09(s，3H)。
4）、向10mL溶有0.475gNaOH的水溶液中加入2.0g上步骤得到的白色固体产物和1.51g甲酸铵，该混合物的pH值为7.5～8.0，向其中加入具有酶比活为50U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为25U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液20mL和80mg的NAD+，用氨水将pH值调节到8.5，然后将混合物在30℃下反应7天，具体反应式如下，7天后将约2.5ml的浓盐酸加入到混合物中，过硅藻土过滤，将滤液用NaOH调节pH值至7.0，通过强酸性阳离子交换树脂纯化产物得1，L-杂环氨基酸的手性纯度为98.5％。1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.50（d，2H），3.5(t，1H)，2.87(d，2H)。
实施例5
L-2-噻吩基丙氨酸的合成
1）、向2L四口瓶中加入196.6g2-醛基噻吩、267gN-乙酰基甘氨酸、187g乙酸钠、1180mL乙酸酐后将体系升温至100～110℃反应约24h，跟踪至原料转化毕，具体反应式如下，将体系降温至室温，并向其中加入540mL正庚烷后抽滤，滤饼用2L冰水淋洗、烘干得到154.8粗品，收率45.7%。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.60（d，1H），7.48(d，1H)，7.03(t，1H)，2.28(s，3H)。
2）、向1L四口瓶中加入81.84g上述粗品、654mL水、266.6g LiOH-H2O，搅拌升温至60～70℃反应约11h，跟踪至原料转化毕，具体反应式如下，降温至室温后向体系中滴加580mL浓盐酸使pH值调节至3，抽滤析出的固体，将该固体水洗后直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.39（d，1H），7.09(d，1H)，6.99(t，1H)，6.50(s，1H)。
3）、向2L四口瓶中加入11.7g NaOH、250mL纯水，全溶后加入50g酮酸和36.9g甲酸铵，将所形成的体系的pH值调节至8.2～8.5，然后向其中具有酶比活为50U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为25U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液500mL和和1.94g NAD+，将体系升温至30～40℃反应约40h跟踪原料反应毕，继续向体系中滴加100mL浓盐酸终止反应，体系过硅藻土后得滤液，用氢氧化钠固体将所得滤液的pH值调节至5～6之间，继续降温至-18℃以析晶，母液过强酸性阳离子交换树脂回收产品，所有产品合并，异丙醇洗后烘干得到类白色固体，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.7%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ7.30（d，1H），7.02(t，1H)，6.93(s，1H)，3.50(t，1H，3.15（d，2H）。
实施例6
L-3-噻吩基丙氨酸的合成
1）、向500mL四口瓶中加入25g3-醛基噻吩、33.9g N-乙酰基甘氨酸、150mL乙酸酐和23.8g乙酸钠，搅拌升温至97～103℃反应2h。，具体反应式如下，反应毕后将体系降温至室温，倒入200g冰水中，抽滤、滤饼用100mL水洗，得到28.7g黄色固体产物1。
2）、向1L四口瓶中加入23.8g黄色固体1、77.6g一水合氢氧化锂和190mL水，升温至50～60℃反应2h后加入50mL甲醇，继续反应约3h后将体系降温至室温，控制体系温度小于20℃用6mol/L的盐酸将体系的pH至调节至1～2，然后向体系中加入600mL乙胺过滤后水相再用300mL乙胺萃取两次，萃取后的有机相合并后用活性炭脱色，浓缩后的粗品使用40mL二氯甲烷洗，得到5.75g产物2。1H NMR（400MHz,（CD2）2CO)7.83（d，1H），7.51(d，1H)，7.46(d，1H)，6.67(s，1H)。
3）、向50mL反应瓶中加入1.0g酮酸、2mL纯水、1.11g甲酸铵、39mg NAD+以及11.3mL具有酶比活为60U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比活为20U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液，体系的pH值在8.2～8.5之间，于30～40℃反应，反应约3天跟踪原料转化完毕，向体系中加入6mL浓盐酸终止，过硅藻土后得到的滤液用NaOH使体系的pH值调节至5～6之间，然后使用强酸性阳离子交换树脂纯化得到0.2g目标化合物，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.5%。1H NMR（400MHz,D2O)：δ7.51（d，1H），7.26(s，1H)，7.11(d，1H)，3.58(t，1H)，3.04（d，2H）。
实施例7
L-4-吡啶基丙氨酸的合成
1）、向四口瓶加入904.2g、1.5eq叔丁醇钾、2L四氢呋喃和500g4-甲基吡啶，室温搅拌2.5h，滴加941.1g草酸二乙酯，加毕，室温搅拌过夜至反应完毕，具体反应如下式。体系暂存直接投第二步。
2）、将上一体系加入瓶中，然后向其中加入1L甲醇、2L H2O，783.6g叔丁醇钾，保温反应至无原料，具体反应如下式。然后浓缩，并将浓缩后的体系降至室温，用6mol/L盐酸调节pH值在2～3之间，向其中加3体积倍的水稀释，抽滤，滤液降至0～5℃抽滤得到640g固体，两步收率72.2%。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.45（d，2H），8.03(d，2H)，7.55(d，1H)。
3）、条件一：
向2L四口瓶中加入150mL纯化水、12.1g氢氧化钠，搅拌至全溶，然后加入50g酮酸，继续搅拌至体系全溶，并检测到pH值在9～10之间，向其中加入28.6g甲酸铵，用NaOH将体系pH值调节至8.2～8.5，加入500ml具有酶比活为70U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比为35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、2.0g NAD+，然后将体系升温至30～40℃反应至无原料，具体反应式如下。将反应后的体系用100mL浓盐酸调至pH值在1～2之间，过硅藻土得滤液，然后用NaOH将滤液调至pH值在6～7之间，过强酸性盐离子交换树脂得到粗品；将粗品浓缩然后用甲酸调至pH值为7.0，加乙醇洗涤，得到类白色固体，手性纯度为99.1%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.58（d，2H），7.90(d，2H)，4.45(t，1H)，3.47（dd，2H）。
条件二：
向2L四口瓶中加入150mL纯化水、12.1g氢氧化钠，搅拌至全溶，然后加入50g酮酸，继续搅拌至体系全溶，并检测到pH值在9～10之间，向其中加入28.6g甲酸铵，用NaOH将体系pH值调节至7.5～8.0，加入500ml具有酶比活为70U/ml的苯丙氨酸脱氢酶和酶比为35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、2.0g NAD+，然后将体系升温至25～27℃反应至无原料，具体反应式如下。将反应后的体系用100mL浓盐酸调至pH值在1～2之间，过硅藻土得滤液，然后NaOH将滤液调至pH值在4.5左右，过强酸性盐离子交换树脂得到粗品；将粗品浓缩然后用甲酸调至pH值为8.0，加乙醇洗涤，得到类白色固体，L-杂环氨基酸的手性纯度为99.1%。1HNMR(400MHz,D2O)：δ8.58（d，2H），7.90(d，2H)，4.45(t，1H)，3.47（dd，2H）。
对比例1
按照文献“Transition-Metal-Assisted Asymmetric Synthesis of Amino Acid Analogues.A NewSynthesis of Optically Pure D-and L-Pyridylalanines”中记载的方法合成L-甲基-2-乙酰氨基-3-（4-吡啶基）-丙酸甲酯
将500mg甲基-2-乙酰胺及-3-（4-吡啶基）乙烯酸甲酯、60mg(R，R)-[Rh(DIPAMP)(COD)]+(BF4-)和12mL甲醇加入到高压釜中，通H2使压力达到65psi，跟踪至反应完后，柱层析分离出产品360mg，放置3个月后析出固体中间体，结构验证数据如下：'H NMR(CDC13)1.99(s,3H,NHC-(OICH,)，3.07(dd,1H,CH2CH)，3.18(dd,1H,CH2CH)，3.75(8,3H,COOCH3)，4.94(9,1H,CH2CH)，6.88(br s,1H,NH)，7.08(d,2H,aromatic)，8.45(d,2H,aromatic)；'3c NMR(CDCld22.51,36.81,52.17,123.11,124.31,145.42,149.31,169.88,171.43；IR(neat)3272,3038,2955,1744,1661,1605,1549,1437,1420,1374,1285,1217,1179,1003；MS(CI)[M+HI m/e223；GC,97:3中间体的手性纯度为94%。将此中间体使用6mol/L盐酸水解后得到手性纯度为96%的L-氨基酸。
对比例2
利用L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶来催化吡啶类酮酸转化成氨基酸的反应，使用核磁跟踪，未检测到产品产生。
利用NMR内标得到实施例1至7以及对比例1至2的L-杂环氨基酸的手性纯度，并记录在表1中。
表1
由表1中的数据可以看出，实施例1至实施例7采用本发明的制备方法得到的L-杂环氨基酸的手性纯度均大于98%，而且，由实施例1与对比例1至2的对比可以发现，采用本发明特定的苯丙氨酸脱氢酶对L-杂环氨基酸的选择性得到了明显提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种L-杂环氨基酸的合成方法，其特征在于，包括：
步骤A，制备杂环酮酸，其中，所述杂环酮酸 或
步骤B，将所述杂环酮酸与甲酸铵、苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，进行还原氨基化反应，生成L-杂环氨基酸，其中，所述苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述步骤B包括：
将所述杂环酮酸和所述甲酸铵加入水溶液中，调节pH值至8.2～8.5，加入粗酶混合液以及辅酶NAD+，于30～40℃下反应至原料转化完毕，得到所述L-杂环氨基酸，所述粗酶混合液中包含所述苯丙氨酸脱氢酶以及所述甲酸脱氢酶，所述苯丙氨酸脱氢酶的酶比活为40～60U/ml，所述甲酸脱氢酶的酶比活为20～30U/ml；
对应于每摩尔所述杂环酮酸，所述粗酶混合液的添加量为2～10ml；
对应于每摩尔所述杂环酮酸，所述辅酶NAD+的添加量为0.005～0.1摩尔，所述甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，编码所述苯丙氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.2。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脱氢酶的表达过程包括：
将包含所述基因序列的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；
将所述基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导所述苯丙氨酸脱氢酶的产生；
对所述宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，所述粗酶混合液中包含所述苯丙氨酸脱氢酶以及所述甲酸脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法在所述步骤B之后还包括：
在反应后的体系中加入浓盐酸，过硅藻土，得到滤出液；
将所述滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；
将所述粗品浓缩，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的所述L-杂环氨基酸。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：
使杂环酮与乙酐、乙酸钠、N-乙酰基甘氨酸反应，得到中间产物，其中，所述杂环酮中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，所述杂环酮的酮基的结构式为-C＝O且位于所述杂环酮的任一碳位上；
使所述中间产物在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化后得到所述杂环酮酸。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述杂环酮酸的制备方法包括以下步骤：
将杂环烷基化合物与草酸二乙酯在正丁基锂或叔丁醇钾存在的条件下反应，生成杂环酮酸酯，其中，所述杂环烷基化合物中的杂环选自五元单杂环、六元单杂环、七元单杂环、五元烷基取代单杂环、六元烷基取代单杂环和七元烷基取代单杂环中的任一种，所述杂环烷基化合物的烷基为甲基且位于所述杂环烷基化合物的任一碳位上；
将所述杂环酮酸酯在路易斯碱存在的条件下发生水解反应，酸化得到所述杂环酮酸。
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