CN103361388B - L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L-环状烷基氨基酸的合成方法及药物组合物。该合成方法包括：步骤A，制备具有结构式（Ⅰ）或结构式（II）的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐；步骤B，将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，进行还原氨基化反应，生成L-环状烷基氨基酸，其中，结构式（Ⅰ）为n₁≥1，m1_≥0，M₁为H或一价阳离子；结构式（II）为n₂≥0，m₂≥0，M₂为H或一价阳离子；亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ？ID？No.1。利用特定亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶、辅酶NAD⁺使环状烷基酮酸或盐发生还原氨基化反应生成L-环状烷基氨基酸，原料转化率高，手性选择性高。

Description

L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药合成领域，具体而言，涉及一种L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物。

背景技术

目前，合成手性非天然的环状烷基氨基酸，主要是采用化学方法，包括使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化、使用手性试剂拆分消旋体、利用手性辅基不对称合成、使用手性原料的定向合成等方法。然而这些方法存在以下一些缺陷：

(1)使用贵重金属不对称催化氢化来对某一关键中间体实现单一构型的转化，其缺点是贵重金属不对称催化剂价格昂贵，反应需要大量有机溶剂，产物中有重金属残留且可能存在过度还原的副产物，而且因为合成的原料中含有杂环，常常会干扰贵重金属与配体的结合，造成催化效率不高。

(2)采用传统的手性拆分方法，得到消旋体中一个需要的异构体，会造成另外一半的原料浪费。

(3)利用手性辅基或手性原料的不对称合成，涉及到价格昂贵的手性原料、较长的合成路线以及大量的有机溶剂，而且对于某些环状烷基氨基酸的合成，得到的产品光学纯度不高，或者产品和杂质不易分离。

现有技术中也有一些文献报道采用生物合成的方法，通过使用特定的酶催化，将一些简单烷基的酮酸转化为对应的氨基酸。但是，由于环状烷基氨基酸的性质比较特殊，现有技术目前还没有找到合适的酶以及相应的反应条件，来通过生物转化合成带手性环状烷基结构的氨基酸。

发明内容

本发明旨在提供一种L-环状烷基氨基酸的合成方法及具有其的药物组合物，得到了光学纯度较高的L-环状烷基氨基酸。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种L-环状烷基氨基酸的合成方法，包括：步骤A，制备具有结构式(Ⅰ)或结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐；步骤B，将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，进行还原氨基化反应，生成L-环状烷基氨基酸，其中，结构式(Ⅰ)为n₁≥1，m₁≥0，M₁为H或一价阳离子；结构式(Ⅱ)为n₂≥0，m₂≥0，M₂为H或一价阳离子；亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNo.1。

进一步地，编码上述亮氨酸脱氢酶的基因序列为SEQIDNo.2。

进一步地，上述亮氨酸脱氢酶的表达过程包括：将包含基因序列SEQIDNo.2的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；将基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生；对宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，粗酶混合液中包含亮氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶。

进一步地，上述粗酶混合液中，亮氨酸脱氢酶的酶比活为50～100U/ml，甲酸脱氢酶的酶比活为20～50U/ml。

进一步地，上述步骤B包括：将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐和甲酸铵在水中混合后调节pH值至8.0～8.5得到混合溶液，向混合溶液中加入粗酶混合液以及辅酶NAD⁺后于30～40℃下反应，生成L-环状烷基氨基酸。

进一步地，对应于每摩尔环状烷基酮酸，粗酶混合液的添加量为2～12ml；对应于每摩尔环状烷基酮酸，辅酶NAD⁺的添加量为0.005～0.1摩尔，甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。

进一步地，上述合成方法在步骤B之后还包括：在反应后的体系中加入浓盐酸调节体系的pH值≤1，过硅藻土，得到滤出液；将滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；将粗品浓缩，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的L-环状烷基氨基酸。

进一步地，上述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸，其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素。

进一步地，上述结构式(Ⅲ)中的n₁为1或2，中间产物在生物酶作用下发生水解反应。

进一步地，上述结构式(Ⅲ)中的n₁≥3，中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。

进一步地，上述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸；使环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到环状烷基酮酸盐，其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素，M₁’为一价阳离子。

进一步地，上述结构式(Ⅲ)中的3≤n₁≤5，中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。

进一步地，上述环状烷基酮酸盐为环丙基酮酸盐，环丙基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙基酮酸盐。

进一步地，上述氧化过程采用KMnO₄为氧化剂，并且在氧化反应完成之后将氧化剂还原至消失。

进一步地，上述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基醇；使环状烷基甲基醇进行卤代反应得到具有结构式(Ⅳ)的第二环状烷基甲基卤代物；制备第二环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸；使环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到环状烷基酮酸盐，其中，结构式(Ⅳ)为n₁≥1，m₁＝1，X为卤素，M₁’为一价阳离子。

进一步地，上述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法还包括环状烷基甲醛的制作过程，制作过程包括：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；使格氏试剂进行Bouveault醛合成反应得到环状烷基甲醛；其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素。

进一步地，上述具有结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：具有结构式(Ⅴ)的羧酸进行格氏试剂加成反应，得到中间产物；将中间产物在碱性条件下进行水解反应，得到环状烷基酮酸，其中，结构式(Ⅴ)为n₂≥0，m₂≥0。

进一步地，n₂＝1，m₂＝0。

根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，包括药物有效剂量的L-环状烷基氨基酸以及药用载体，L-环状烷基氨基酸按照上述的合成方法制备而成。

应用本发明的技术方案，利用氨基酸序列为SEQIDNo.1的特定亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺进行配合使环状烷基酮酸发生还原氨基化反应生成L-环状烷基氨基酸，手性中心在亮氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成，原料的转化率达80％以上，手性选择性高；而且以酮酸为底物通过两步即可完成L-环状氨基酸的合成，同时，由于原料转化率高，得到的产物不涉及异构体的分离和纯化，进而简化了L-环状烷基氨基酸的合成工艺；此外，整个合成过程的反应条件温和，更能适应L-环状烷基氨基酸的工业化大规模生产。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明，在此需要说明的是与本领域的常规表示方法一致，环状结构内部的虚线环表示支链可以与环状结构的任意一个碳位相连。

在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种L-环状烷基氨基酸的合成方法，包括：步骤A，制备具有结构式(Ⅰ)或结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐；步骤B，将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，进行还原氨基化反应，生成L-环状烷基氨基酸，其中，结构式(Ⅰ)为n₁≥1，m₁≥0，M₁为H或一价阳离子；结构式(Ⅱ)为n₂≥0，m₂≥0，M₂为H或一价阳离子；亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNo.1。

上述合成方法利用氨基酸序列为SEQIDNo.1的特定亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺进行配合使环状烷基酮酸发生还原氨基化反应生成L-环状烷基氨基酸，手性中心在亮氨酸脱氢酶和辅酶的催化作用下转化形成，原料的转化率达80％以上，手性选择性高；而且以酮酸为底物通过两步即可完成L-环状氨基酸的合成，同时，由于原料转化率高，得到的产物不涉及异构体的分离和纯化，进而简化了L-环状烷基氨基酸的合成工艺；此外，整个合成过程的反应条件温和，更能适应L-环状烷基氨基酸的工业化大规模生产。可用于本申请的一价阳离子包括但不限于碱金属离子，氨基、巯基等，只要能够和酸形成盐的一价阳离子都可应用于本发明。

上述合成方法中，编码亮氨酸脱氢酶的基因序列为SEQIDNo.2。上述基因序列编码的亮氨酸脱氢酶对催化环状烷基酮酸与甲酸铵合成L-环状烷基氨基酸的选择性和催化转化率均较好。

在本发明的一种优选的实施例中，上述亮氨酸脱氢酶的表达过程包括：将包含上述基因序列SEQIDNo.2的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；将上述基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生；对宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，该粗酶混合液中包含亮氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶。

上述利用具有上述基因序列的DNA片段插入载体后得到基因重组质粒，并且利用该基因重组质粒配合诱导剂的诱导作用得到的亮氨酸脱氢酶的活力和含量均较好，将宿主菌破碎、离心后得到的粗酶混合液中既含有亮氨酸脱氢酶又含有甲基营养型宿主菌本身所含有的甲酸脱氢酶，本发明可直接利用该粗酶混合液催化酮酸向氨基酸的转化。

在上述实施例的实施过程中，温度、培养基的改变都会影响所得到的粗酶液中亮氨酸脱氢酶的以及甲酸脱氢酶的酶比活，所得到的粗酶混合液都能应用于本发明，且优选得到的粗酶混合液中，亮氨酸脱氢酶的酶比活为50～100U/ml，甲酸脱氢酶的酶比活为20～50U/ml。利用具有上述酶比活的粗酶混合液在催化酮酸向L-环状烷基氨基酸的转化过程中不仅手性选择性更高，催化效率更好。

在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法的步骤B包括：将环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐和甲酸铵加入水溶液中，调节pH值至8.0～8.5，加入粗酶混合液以及辅酶NAD⁺，于30～40℃下反应至原料转化完毕，得到L-环状烷基氨基酸。上述步骤B中利用水做溶剂从而大大降低了生产成本，而且无有机溶剂的产生，合成工艺绿色环保，进一步适应工业化的大规模生产。

为了进一步从原料上控制成本并且通过调控各原料的用量比来得到尽量多的产物，优选对应于每克环状烷基酮酸，粗酶混合液的添加量为2～12ml；对应于每摩尔环状烷基酮酸，辅酶NAD⁺的添加量为0.005～0.1摩尔，甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。

在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法在步骤B之后还包括：在反应后的体系中加入浓盐酸调节体系的pH值≤1，过硅藻土，得到滤出液；将滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；将粗品浓缩，调节pH值至7.0，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的L-环状烷基氨基酸。由于本发明的手性选择性较高，在对产物的分离纯化中不涉及异构体的分离和纯化，进而使得本发明的分离方法比较简单，只需要将产物与酶、原料等进行分离即可。

在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法中具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸，其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素。

上述合成环状烷基酮酸的路线较短，而且并没涉及使用贵重金属催化剂，从而保证了得到的环状烷基酮酸中不存在重金属残留；在后续的合成L-环状烷基氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂，进一步保证了得到的L-环状烷基氨基酸中也不存在重金属残留。

在利用上述制作方法制作环丙基氨基酸或环丁基氨基酸时，优选使中间产物在生物酶作用下发生水解反应。生物酶条件下进行的反应不仅反应条件更温和，而且反应速率、反应产物的得率更容易控制。比如采用南极洲假丝酵母催化环丁基氧代乙酸乙酯合成环丁基酮酸。

当上述制作方法以具有结构式(Ⅲ)且n₁≥3的环状烷基卤代物为底物合成环状烷基酮酸时，优选使中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。在利用氢氧化钠或氢氧化钾等无机碱作用下进行水解反应时，使得中间产物的转化效率较高。

在本发明的又一种优选的实施例中，当不能以环状烷基酮酸为底物合成环状烷基氨基酸时，优选上述合成方法中具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸；使环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到环状烷基酮酸盐，其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素，M₁’为一价阳离子。

同样，上述合成环状烷基酮酸的路线较现有技术中的合成路线短，而且并没涉及使用贵重金属催化剂，从而保证了得到的环状烷基酮酸中不存在重金属残留；在后续的合成L-环状烷基氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂，进一步保证了得到的L-环状烷基氨基酸中也不存在重金属残留。

当上述制作方法以具有结构式(Ⅲ)且3≤n₁≤5的环状烷基卤代物为底物合成环状烷基酮酸时，优选使中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。在利用氢氧化钠或氢氧化钾等无机碱作用下进行水解反应时，使得中间产物的转化效率较高。

在本发明的又一种优选的实施例中，上述环状烷基酮酸盐为环丙基酮酸盐，环丙基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙基酮酸盐。本实施例利用环丙基甲基酮为底物合成环丙基氨基酸，只需要将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化反应即可得到环丙基酮酸盐，然后环丙基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，进行还原氨基化反应，生成L-环丙基甘氨酸，该过程只需两步，而且不涉及重金属催化剂，因此，进一步保证了L-环丙基甘氨酸的手性纯度和收率。

上述将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到环丙基酮酸盐的过程中，优选采用KMnO₄为氧化剂，并且在氧化反应完成之后将氧化剂还原至消失。在实际操作中本领域技术人员可以采用氢氧化钠营造碱性条件，氧化反应完成之后优选采用亚硫酸氢钠作为还原剂还原未反应的高锰酸钾，待高锰酸钾完全被还原后只需将体系进行过滤，滤液浓缩后即可用于下一步的反应。

在本发明的又一种优选的实施例中，上述合成方法中具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基醇；使环状甲基醇进行卤代反应得到具有结构式(Ⅳ)的第二环状烷基甲基卤代物；制备第二环状烷基卤代物的格氏试剂；将格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；使中间产物发生水解反应得到环状烷基酮酸；使环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到环状烷基酮酸盐，其中，结构式(Ⅳ)为n₁≥1，m₁＝1，X为卤素，M₁’为一价阳离子。

采用上述实施例的制备方法，其中没有重金属催化剂的参与，即可得到环状烷基酮酸盐，然后再进一步利用该环状烷基酮酸盐合成环状烷基丙氨酸的过程中也没有涉及使用贵重金属催化剂，从而保证了得到的环状烷基酮酸中不存在重金属残留；在后续的合成L-环状烷基氨基酸的过程中也没有使用贵重金属催化剂，进一步保证了得到的L-环状烷基氨基酸中也不存在重金属残留。

上述实施例中所用的环状烷基甲醛可以采用现有技术中以环烯烃为底物合成环状烷基甲醛的方法，优选上述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法还包括环状烷基甲醛的制作过程，制作过程包括：制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；使格氏试剂进行Bouveault醛合成反应得到环状烷基甲醛；其中，结构式(Ⅲ)为n₁≥1，X为卤素。上述制作过程步骤简单、操作条件易控，环状烷基甲醛的纯度和收率较高。

在本申请的一种优选的实施例中，上述具有结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：具有结构式(Ⅴ)的羧酸进行格氏试剂加成反应，得到中间产物；将中间产物在碱性条件下进行水解反应，得到环状烷基酮酸，其中，结构式(Ⅴ)为n₂≥0，m₂≥0。以带有羧基的杂环烷基为底物进行格式试剂加成反应，然后在碱性条件下进行水解反应，能够得到转化率较大的环状烷基酮酸，进而保证了所得到的环状烷基氨基酸的纯度。

优选上述具有结构式(Ⅴ)的羧酸为4-羧基吡喃，即n₂＝1，m₂＝0，将4-羧基吡喃溶解在四氢呋喃中，并在-10～0℃之间在I-PrMgCl/THF的催化作用下与二异丙胺进行反应，反应完成后再向体系中添加草酸乙酯进行加成反应，从而得到中间产物；再将中间产物在氢氧化钾或氢氧化钠形成的碱性条件下进行水解反应得到4-吡喃基酮酸。

在本发明的另一种典型的实施方式中，提供了一种药物组合物，包括药物有效剂量的L-环状烷基氨基酸以及药用载体，L-环状烷基氨基酸按照上述合成方法制备而成。本发明的L-环状烷基氨基酸的纯度较高，因此具有其的药物组合物的相对于现有技术中的具有L-环状烷基氨基酸的药物组合物的靶点更小、副作用更低。

下面将结合实施例和对比例进一步说明本发明的有益效果。

以下实施例所用的亮氨酸脱氢酶为氨基酸序列为SEQIDNo.1的亮氨酸脱氢酶，其中编码实施例1至7的亮氨酸脱氢酶的基因序列来源于球形芽孢杆菌。

亮氨酸脱氢酶的表达过程如下：

合成包含基因序列SEQIDNo.2的DNA片段，将上述合成的DNA片段插入pET-22b(+)载体，得到基因重组质粒；将上述基因重组质粒转化入大肠杆菌BL21，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导亮氨酸脱氢酶的产生；对大肠杆菌BL21进行超声波破碎，然后离心分离得到具有酶比活为50～100U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为20～50U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液。

实施例1

L-环丙基甘氨酸的合成

1)室温下，向20L四口瓶中加入500g环丙基甲基酮、15.6gNaOH、8.7L水形成混合体系，将混合体系加热至45～55℃后，向混合体系中滴加8.7L具有1864.8gKMnO₄的水溶液，未溶解的KMnO₄再分批加入到混合体系中，约10h加毕，反应跟踪原料反应完全，内标收率57.9％，向反应完成后的混合体系中滴加10％NaHSO₃破坏未反应的KMnO₄；抽滤，滤液浓缩至70％后直接投下一步使用。1HNMR(500MHz,CD₃Cl)：δ1.29(m，3H)，1.06(m，1H)，0.95(m，1H)。

2)室温下向5L四口瓶中加入上述步骤得到的1627g含量14.5％环丙基氧代乙酸钠的水溶液、193.3g甲酸铵、2350mL具有酶比活为60U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为50U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、10.18gβ-NAD⁺形成反应体系，调节反应体系的pH值在8.0～8.5，并将其升温至30～40℃，使反应体系按照下述化学式进行反应，反应16h后跟踪体系，检测原料反应完毕，降至室温，搅拌下缓慢向其中滴加750mL浓盐酸使反应后混合体系的pH值至1以下；将调酸后的体系过1～2cm的硅藻土垫，用235g氢氧化钠将得到的滤液pH值调节至5～6之间，得粗品水溶液。将粗品水溶液过型号为001×7的强酸性阳离子交换树脂树脂柱纯化，所得粗品用无水乙醇洗涤后进行抽滤，滤饼烘干得类白色固体产品；滤液过型号为001×7的强酸性阳离子交换树脂树脂柱纯化得类白色固体产品，两次所得类白色固体产品共计得到87g，NMR内标>97％，手性纯度>99％，收率49％。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ2.56(d，1H)，0.91(m，1H)，0.49(m，2H)，0.34(m，1H)，0.23(m，1H)。MS：(M+H)⁺＝116.1。

实施例2

L-环丁基甘氨酸的合成

1)向1L四口瓶中加入15.13g镁屑，160ml四氢呋喃，2颗碘粒，再向其中加入具有8g溴代环丁烷的32ml四氢呋喃溶液，加热四口瓶使体系中的溴代环丁烷格式试剂引发；然后将四口瓶降温至40℃，向其中滴加具有72g溴代环丁烷的288ml四氢呋喃溶液，约2.5h滴毕，溴代环丁烷按照以下反应式进行反应；升温至40～50℃保温约1h后得到格氏试剂，降温至室温氮气保护备用。

2)向1L四口瓶中加入具有112.6g草酸二乙酯的160ml四氢呋喃溶液，用液氮乙醇将四口瓶降温至-50℃以下；控温四口瓶温度在-35℃以下，将制备好的0.593mol格式试剂压入降温后的体系中按照以下反应式进行反应，约1h加完；1h后取样TLC检测直至反应完全，约1.5h；向反应体系中加入200ml浓度为3mol/L的盐酸终止反应，得到混合体系；然后160ml用甲基叔丁基醚分三次萃取该混合体系，萃取后得到的有机相合并浓缩得140g粗品环丁基氧代乙酸乙酯。1HNMR(400MHz,CD₃Cl)：δ4.30(m，2H)，3.78(m，1H)，2.20(m，2H)，2.01(m，2H)，1.83(m，2H)，1.33(t，3H)。

3)向500ml四口瓶中加入具有100g上述环丁基氧代乙酸乙酯且pH＝7的200ml磷酸盐缓冲溶液以及2g南极洲假丝酵母形成反应体系，然后将反应体系升温至30～40℃，反应过程中用氨水使反应体系的pH值保持在7～8，具体的反应过程见下述反应式；约50h后TLC检测反应毕。将体系抽滤，滤液用150ml甲基叔丁基醚萃取，得到酮酸的的水溶液，直接用于下步反应。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ3.66(m，1H)，2.17～1.75(m，6H)。

4)室温下将640g质量含量为6.46％的环丁基酮酸水溶液和17.42g氢氧化钠加入到1L烧杯中，搅拌，抽滤除去析出的固体。将滤液转至1L四口瓶中，并向其中加入40.65g甲酸铵、400mL具有酶比活为75U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、2.14gβ-NAD⁺形成混合体系，调节上述混合体系的pH值在8.0～8.5之间，并将其升温至30～40℃使该混合体系按照下述反应式进行反应；反应约44h后跟踪混合体系，检测原料反应完毕，降至室温，搅拌下向其中缓慢滴加130mL浓盐酸使反应后的混合体系pH值小于等于1；将经过上述调酸后的体系过1～2cm的硅藻土垫，使用氢氧化钠将收集到的滤液pH值调节至5～6，得粗品水溶液；粗品水溶液过型号为001×7强酸性阳离子交换树脂树脂柱，得到的纯化后的粗品用无水乙醇洗涤，然后依次经抽滤、滤饼烘干得类白色固体产品，抽滤得到的滤液过型号为001×7强酸性阳离子交换树脂树脂柱，纯化得类白色固体产品，两次固体产品共计24.8g产品，NMR内标>97％，手性纯度>99％，收率60％。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ3.12(d，1H)，2.40(m，1H)，2.0～1.75(m，6H)。MS：(M+H)⁺＝130.1。

实施例3

L-环戊基甘氨酸的合成

1)向干燥的5L四口瓶中加入300mL四氢呋喃、97.9gMg、30g溴代环戊烷、2粒碘，反应引发后继续滴加476g溴代环戊烷和2233mL四氢呋喃的混合液，控制温度60～65℃，约4h后全部滴毕，回流两小时后降至室温，得到格氏试剂。在另一干燥的5L四口瓶中加入679.9g草酸二乙酯，1176mL四氢呋喃，降温至-40℃以下，将上述格氏试剂压入到该四口瓶中形成反应体系，控制反应体系的温度在-40℃以下，约1h压毕，保温30min后将反应后的体系升温至室温，然后用3mol/L的盐酸调节体系pH值在3～4之间，将体系分液得到水相和有机相，水相用丙烯酸乙酯萃取后分离得有机相，两次得到的有机相合并后用饱和碳酸钠溶液洗至中性后再用饱和食盐水洗，浓缩，得到粗品413g，收率72％。

2)在2L四口瓶中加入400g上述粗品、400mL水形成混合体系，然后将该混合体系升温至80℃并向其中滴加440g质量浓度为50％NaOH水溶液，约1h滴毕使四口瓶中的物质按照以下反应式反应，然后自然降至室温，将降温后的体系抽滤，滤液用正庚烷萃取得到水相和有机相，水相直接投下一步。

3)将上步骤得到的水相(含钠盐385.7g)、13.74gβ-NAD+、443.5g甲酸铵、4.36L具有酶比活为70U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为35U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液加入到四口瓶中，搅拌使物质全部溶解形成混合体系，向该混合体系中加入约10mL浓氨水将混合体系的pH值调节至8左右，然后将该混合体系升温至30～40℃反应约3天后，取样跟踪原料转化完毕，向反应后的体系中共加入1.2L浓盐酸使体系的pH值在1以下，然后体系过硅藻土，得到的滤液用50％氢氧化钠溶液调节pH在5～6，在<30℃下将体系抽滤得到固体，将固体烘干后用4倍体积的纯水搅洗2h后抽滤，滤饼用乙醇淋洗后烘干得到134.6g产品，内标>97％，ee>99％，收率40％。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ2.79(d，1H)，1.89(m，1H)，1.65～1.43(m，6H),2.19(m，2H)。MS：(M+H)+＝144.1。

实施例4

L-环己基甘氨酸的合成

1)向20L四口瓶中加入3320g镁屑及500mL四氢呋喃，2g碘，在20℃下滴加1L具有203g溴代环己烷的四氢呋喃溶液，搅拌至体系引发；引发后分批滴加1.947kg溴代环己烷和10L四氢呋喃的混合溶液，控温55～60℃，滴加完毕后于60～65℃保温2h后停止加热，所得格氏试剂氮气保护暂存。

向另一干燥的20L反应瓶中加入2.07kg草酸二乙酯、2.5L四氢呋喃形成混合体系，利用液氮乙醇将上述混合体系降温至-40℃以下。将制好的格氏试剂利用氮气压入到上述混合体系中，控制滴加过程的温度小于-20℃，约2h滴加完毕；将反应后的混合体系升温至-10±5℃，保温1h；然后降温至-20℃，滴加约1.08L浓盐酸将体系pH值调节至4～5之间；然后向体系中加入1.5L水、0.5L乙酸乙酯，搅拌后分液得到水相和有机相，水相再分别用800mL乙酸乙酯萃取两次，有机相分别先用1L饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，再分别用1.5L饱和食盐水洗涤两次，有机相浓缩得到4.41kg黄色液体即环己基氧代乙酸乙酯。

2)向20L反应瓶中加入4.12kg环己基氧代乙酸乙酯、1.79kg甲醇，并搅拌使其全部溶解；继续想反应瓶中加入5.454kg水，体系温度略有升高；滴加配制好的2.56kg质量浓度为50％氢氧化钠溶液，温度升高，约40min后滴毕，然后于50～60℃保温反应3h。跟踪原料反应完全后，体系降温至42℃，抽滤出不溶的固体得滤饼和滤液，该滤饼用700mL水洗后收集水洗液；滤液分别用7L、6L甲基叔丁基醚两次萃取杂质，甲基叔丁基醚相弃，水相用1.6L浓盐酸将体系pH值调节至1～2；然后分别用5L、2L二氯甲烷两次萃取至水相无产品，得到的二氯甲烷相合并，用0.5kg无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，滤饼再用1L二氯甲烷泡洗，滤饼弃，滤液浓缩。将浓缩后的液体用甲醇溶，滴加甲醇钠的甲醇溶液，冰水浴下搅拌30min后抽滤，得到白色固体1.69kg(即2-环己基-2-氧乙酸钠盐)。1HNMR(500MHz,D2O)：δ2.88(m，1H)，1.88(m，2H)，1.74～1.04(m，8H)。

3)室温下，向20L四口瓶中加入996gHCOONH₄及2.58kg纯化水，搅拌溶解后，向体系中加入7.556kg具有酶比活为60U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为40U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、701g2-环己基-2-氧乙酸钠盐、24.8gβ-NAD+。全溶后，向体系中加入浓氨水47g，调体系pH值在8.0～8.5，升温至30～40℃反应过夜，反应完全后，向体系中滴加1.05L浓盐酸终止反应，然后使体系过1～2cm的硅藻土垫得到滤饼和滤液，滤饼分别以0.7L纯化水洗两次得水洗液，然后将水洗液和滤液转至20L四口瓶中形成混合溶液，以1.1L质量浓度为50％氢氧化钠溶液将混合溶液的pH值调节至5～6，抽滤该混合溶液得滤饼和滤液，滤饼分别以2L纯化水洗两次后，再用5倍体积纯水搅拌洗涤3次，抽滤后的滤饼烘干后得产品512.8g，收率82.9％，核磁内标>98％，手性纯度>99％。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ3.54(d，1H)，1.61(m，1H)，1.38～1.25(m，5H)，0.91～0.69(m，5H)。

实施例5

L-环庚基甘氨酸的合成

1)向1L四口瓶中加入12.9g镁屑、180ml四氢呋喃、1颗碘粒以及36ml具有9g环庚基溴的四氢呋喃溶液形成反应体系，加热该反应体系使之变澄清并引发，引发后反应体系剧烈放热，将反应体系降温至50℃并控制该反应体系的温度≤50℃，滴加324ml具有81g环庚基溴的四氢呋喃溶液，约1h滴毕，然后将体系升温至45～55℃保温约5h后降温至室温得到格氏试剂。

2)向1L四口瓶中加入74.6g草酸二乙酯和160mlTHF溶液形成混合体系，用液氮乙醇使该混合体系降温至≤-50℃。控制混合体系温度≤-30℃，将制备好的0.51mol格氏试剂压入降好温的体系中，约0.5h加完。约2.5h后TLC检测直至反应完全。向体系中加入40ml2mol/L的盐酸终止反应，再加入40ml水分液，分液得到的水相用250ml乙酸乙酯萃取得到有机相，将分液得到的有机相和萃取得到的有机相合后再依次用50ml水洗3次、50ml饱和食盐水洗，有机相浓缩得98.0g环庚基氧代乙酸乙酯粗品。

3)向1L四口瓶中加入98.0g环庚基氧代乙酸乙酯粗品、196ml甲醇、368ml浓度为2mol/L氢氧化钠溶液形成反应体系，反应体系反应放热至50℃，并保温于40～50℃，约5h后TLC检测反应完全。将体系浓缩至基本无馏分，加入320ml水，然后分别用100ml石油醚萃取两次，得到的水相用6mol/L的盐酸调PH值在2左右，再分别用120ml甲基叔丁基醚萃取两次、120ml乙酸乙酯萃取四次得到有机相，合并有机相并分别用120ml水将合并后的有机相洗涤三次、50ml饱和食盐水洗一次，浓缩有机相得固体，固体用氮气进行吹干得29g酮酸。1HNMR(400MHz,CD₃Cl)：δ8.95(s，1H)，3.36(m，1H)，1.93(m，2H)，1.74(m，2H)，1.63～1.51(m，8H)。

4)将20.9g粗品酮酸溶于60mL甲醇中，冰水浴下滴加27.43g质量浓度为29％的甲醇钠甲醇溶液。滴毕后冰水浴下搅拌10min，抽滤，滤饼用50LEA淋洗，得到的白色固体烘干后称量为18.68g酮酸钠盐。取18g的酮酸钠盐，加90mL纯水，过滤掉不溶物，滤液转至500mL四口瓶中。向四口瓶中加入11.8g甲酸铵、180mL具有酶比活为100U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为50U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液、0.62gβ-NAD⁺形成反应体系，然后用浓氨水将该反应体系的pH值调节至8.0～8.5之间，然后将反应体系升温至30～40℃反应过夜，向四口烧瓶中缓慢滴加40mL浓盐酸终止反应，体系过硅藻土，得到的滤液冰水浴下用固体氢氧化钠调节pH值在5～6之间，搅拌30min后抽滤，得到白色固体；固体再用10mL水洗，烘干得到3.9gL-环庚基甘氨酸。内标>97％，手性纯度>99％。1HNMR(400MHz,D₂O)：δ3.08(d，1H)，1.77(m，1H)，1.63～1.26(m，12H)。

实施例6

L-环己基丙氨酸的合成

1)向500mL四口瓶中加入11g镁屑、30mLTHF、4g溴代环己烷形成混合体系，将该混合体系升温至30～40℃后向其中加入2粒碘，体系引发，然后滴加剩余61g溴代环己烷和230mLTHF混合物。滴加过程中微回流，1h滴毕，体系于60～70℃保温2h，然后降至室温备用，得格氏试剂。

2)向干燥洁净的20L反应瓶中压入制备好的格氏试剂，降温至-20℃后控制格氏试剂的温度在-10±5℃之间，然后向反应瓶中滴加1.506kg二甲基甲酰胺，约2h滴毕，体系于0℃以下保温2h。向反应瓶中滴加7L浓度为4mol/L的HCl终止反应的反应产物。将反应产物抽滤，滤液静置分液，水相分别用2.8LEA萃取两次，合并萃取后的有机相，合并后的有机相用3L饱和食盐水洗，浓缩得到1.608kg油状液体，纯度96％，收率83.5％。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ9.49(s，1H)，2.13(m，1H)，1.74(m,2H)，1.66～1.51(m，4H),1.22～1.10(m，4H)。

3)向5L四口瓶中加入272g油状液体、1632mL甲醇，然后降温至0℃以下，分批加入92g硼氢化钠固体，控制温度<30℃。约2h加毕，体系于20～30℃保温反应。向体系中滴加4mol/LHCl，使体系pH值在6～7之间，然后将体系进行初步浓缩后向初步浓缩的体系中加入甲苯进行进一步浓缩，得到325.9g粗品，减压蒸馏得到214.7g无色液体，p＝99％，收率82％。1HNMR(400MHz,CDCl₃)：δ3.36(d，2H)，2.48(s，1H)，1.69～1.60(m,4H)，1.4(m，1H)，1.24～1.07(m，4H),0.88(m，2H)。

4)向20L四口瓶中加入1.4kg无色液体、甲苯8.4L、吡啶969.8g，将体系降温至0～-10℃，然后滴加1.66kg三溴化磷和7L甲苯的混合物，控温5℃以下。约1h滴毕，升温至室温并反应10h。然后降温至20℃以下，滴加5％碳酸氢钠溶液约2.5L，然后加入1.85kg碳酸氢钠固体形成混合物。将混合物分液，得到的水相分别用4L甲苯萃取两次，合并萃取后的有机相，并用饱和食盐水洗合并后的有机相，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩得到1.73kg粗品，减压精馏得到722.8g产品，纯度97.5％，收率33.3％。1HNMR(400MHz,CDCl₃)：δ3.82(m，1H)，1.79～1.53(m,6H)，1.13～0.90(m，6H)。

5)向5L四口瓶中加入85.4g镁屑、500mLTHF、30g步骤4)的产品，加热至引发，然后滴加570g步骤4)的产品和3.4LTHF的混合液，滴毕后于60±5℃保温4h，降至室温备用得到格氏试剂。向另一10L反应瓶中加入594.2g草酸二乙酯，1.2LTHF，搅拌降温至-40～-50℃，然后滴加制备好的格氏试剂，约2h滴毕，于-10～-20℃保温反应1.5h得产物，然后滴加600mL6mol/L的HCl终止反应并调节产物pH值在2～3之间，再加入500mL水，水相分别用1.2LMTBE萃取三次得到有机相，有机相合并后用饱和食盐水洗，浓缩后得到935g棕色液体，直接投下一步反应。

6)向3L四口瓶中加入步骤5)得到的935g棕色液体、839mL纯水，然后向四口瓶中滴加203.1gNaOH和203.1g水的混合溶液，控制温度小于40℃。约2h滴毕，反应约5h后将四口瓶中的体系抽滤，得到的滤液用HCl将pH值调节至1～2之间，然后分别用1LEA萃取三次，萃取后得到的有机相浓缩后，滴加到甲醇钠甲醇溶液中，制成钠盐备用，共得到钠盐198g，收率30％。1HNMR(400MHz,CDCl₃)：δ2.63(d，2H)，1.8(m,1H)，1.63～1.56(m，5H)，1.24～1.06(m,3H)，0.91(m，2H)。

7)室温下，向5L四口瓶中加入74g上步骤得到的钠盐及740mL纯化水，20℃超声5min后过滤，向滤液中加入48.5g甲酸铵、740mL具有酶比活为50U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为30U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液及2.55gβ-NAD+形成反应体系，检测反应体系的pH值为6～7，以20mL质量浓度为5％氨水调节反应体系的pH值在8.0～8.5，将反应体系升温至30～40℃反三天，然后将体系降至室温，向瓶中缓慢滴加220mL浓盐酸使体系的pH值调节为1～2，将体系过1～2cm的硅藻土垫，得到的滤液用101.5g氢氧化钠将pH值调节为5～6，置于冰箱上层析晶，抽滤得粗品。粗品使用5倍体积纯化水洗三次，2倍体积无水乙醇洗三次，烘干得到内标>98％，手性纯度>99％的产品23.7g。1HNMR(400MHz，D₂O)：δ3.15(m，1H)，1.61～1.53(m，5H)，1.36(m，1H)，1.23(m，2H)，1.08～1.00(m，3H),0.79(m，2H)。

实施例7

L-4’-吡喃基甘氨酸

1)向250mL四口瓶中加入6.2g4-羧基吡喃，30mLTHF，搅拌至溶解。冰盐浴降到-10～0℃，控温下滴加81.04g12.8％的IPMgCl/THF溶液，约1.5h滴毕，然后一次性迅速加入5.31g二异丙胺，然后升温回流2h；将体系降温至-30～-20℃,，控制T<-5℃滴加7.66g草酸二乙酯，约15min滴毕，然后自然回至室温反应45min；将体系降至0～5℃，滴加2.45gEtOH，滴毕后搅拌30min后滴加13mL浓盐酸，并于50℃保温50min，降至室温后加入20mL水和30mLMTBE，搅拌10min后分液，得到的水相分别用30mLMTBE萃取两次，萃取后得到的有机相合并，依次用20mL1MHCl盐酸、20mL饱和食盐水洗，水洗后的有机相用MgSO₄干燥后浓缩，得到7.34g液体。1HNMR(400MHz,CD₃Cl)：δ4.30(m，2H)，3.97(t，2H)，3.44(t，2H)，3.28(m，1H)，1.80(t，2H)，1.72(m，2H)，1.36(t，3H)。

2)向50mL三口瓶中加入10mL水，1.26gKOH，1.16gK2HPO₄，控温T<20℃滴加2.5g上步得到的酮酸酯液体和5mLMeOH的混合液，滴毕后控制T<20℃保温1h。向体系中加入10mLMTBE，搅拌10min后分液，分液得到的水相再用10mLMTBE萃取，萃取后的水相用1.4mL6NHCl调节pH值至3～4，然后分别用20mLEA萃取两次；萃取后的有机相合并浓缩，得到0.72g黄色油状物，即酮酸粗品。1HNMR(400MHz,CD₃Cl)：δ4.08(t，2H)，3.54(t，2H)，3.50(m，1H)，1.87(m，2H)，1.72(m，2H)。

3)将上述0.4g酮酸粗品加入到5mLIPA中，滴加0.58g28％的甲醇钠甲醇溶液，冰浴下搅拌5min后抽滤，得到0.5g类白色固体；将此白色固体加入到50mL锥形瓶中，加入2.5mL纯水、0.26g甲酸铵，用浓氨水调pH至8.0～8.5，然后加入4mL具有酶比活为60U/ml的亮氨酸脱氢酶和酶比活为20U/ml甲酸脱氢酶的粗酶混合液，18.4mgβ-NAD+，于30℃恒温反应过夜。将体系用1mL浓盐酸调节至pH<1，过硅藻土抽滤后冰浴下用固体NaOH调节至pH在5～6，过强酸性阳离子交换树脂纯化产品。得到类白色固体，ee＞99％。1HNMR(400MHz，D₂O)：δ3.99(t，2H)，3.44(t，2H)，3.00(d，1H)，1.75(m，1H)，1.57(m，2H)，1.33(m，2H)。

对比例1

采用专利WO2005/14526A1,公开的使用L-苯丙氨酸还原苯环得到产品的过程。

将L-苯丙氨酸加入到200mL水中，加入200mL异丙醇、12.2mL37％盐酸和2g50％Pt/Rh(4:1)碳，体系中通入氢气，维持8～10bar，50-60℃反应6～8h。然后将体系过滤，用50mL水洗，滤液浓缩后用50％氢氧化钠调pH5～6。然后降温至0～10℃，抽滤得到的固体，用20mL水洗，然后再50～70℃真空干燥。

对比例2

采用美国专利US6191306公开的方法合成环丙基甘氨酸

1)将环丙基甲醛175g溶于1.75L甲醇中，然后加入322mLS-α-甲基苄胺。回流1.5h后降温至30℃，然后加入162.8g氰化钾，反应升温至32℃搅拌过夜，然后加入580mL水。用40mL浓盐酸将体系调至pH10，然后加入1.8L水，分出水相，水相用EA萃取3次，0.7L/次。有机相合并后用无水硫酸镁干燥，然后过滤，滤液浓缩得到黄色油状物，收率98％。产物(S,S)：(R,R)＝3.2:1。

2)将10g步骤1)的产物溶于65mL浓盐酸中，加热至94℃保温17h，然后降至室温一下滴加175mL4N氢氧化钾溶液，直至体系pH8～9。然后体系冰水中搅拌45min，过滤固体，并用50mL冰水洗然后用100mL冰甲醇洗10min。然后过滤，得到的白色固体再分别用50mL甲醇洗涤两次，然后过滤，真空干燥，得到产品，收率55％，手性纯度>98％。

3)将16.8g上步得到的(S)-苯乙基-(S)-环丙基甘氨酸和200mLTHF，100mL水，4.76g10％Pd/C混合，然后加入17mL甲酸，然后搅拌过夜。反应完后，过滤掉催化剂，将滤液浓缩，然后加入甲醇后再浓缩，反复操作几次，真空干燥得到4.75g固体产物，。

利用NMR内标得到实施例1至7以及对比例1至2的L-环状烷基氨基酸的手性纯度，并记录在表1中。

表1

由表1中的数据可以看出，实施例1至实施例7采用本发明的制备方法得到的L-环状烷基氨基酸的手性纯度均大于99％。此外，通过本发明的以酮酸为底物通过两步合成方法即可得到L-环状烷基氨基酸，比对比文件2的合成路线更短。而且对比例1至2在合成过程中均采用了重金属催化剂，合成成本较高；对比例2的合成方法，会使其中部分原料浪费，合成成本也较高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种L-环状烷基氨基酸的合成方法，其特征在于，包括：

步骤A，制备具有结构式(Ⅰ)或结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐；

步骤B，将所述环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐与甲酸铵、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，进行还原氨基化反应，生成L-环状烷基氨基酸，其中，

所述结构式(Ⅰ)为 其中，Na元素可以替换为其它碱金属元素；

所述结构式(Ⅱ)为

所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNo.1，编码所述亮氨酸脱氢酶的基因序列为SEQIDNo.2，

所述亮氨酸脱氢酶的表达过程包括：

将包含所述基因序列SEQIDNo.2的DNA片段插入载体，得到基因重组质粒；

将所述基因重组质粒转化入宿主菌，在培养基上进行培养，用诱导剂诱导所述亮氨酸脱氢酶的产生；

对所述宿主菌进行超声波破碎，然后离心分离得到粗酶混合液，所述粗酶混合液中包含所述亮氨酸脱氢酶以及所述甲酸脱氢酶，所述粗酶混合液中，所述亮氨酸脱氢酶的酶比活为50～100U/ml，所述甲酸脱氢酶的酶比活为20～50U/ml，

所述步骤B包括：

将所述环状烷基酮酸或环状烷基酮酸盐和所述甲酸铵在水中混合后调节pH值至8.0～8.5得到混合溶液，向所述混合溶液中加入所述粗酶混合液以及辅酶NAD⁺后于30～40℃下反应，生成所述L-环状烷基氨基酸，

其中，对应于每摩尔所述环状烷基酮酸，所述粗酶混合液的添加量为2～12ml；

对应于每摩尔所述环状烷基酮酸，所述辅酶NAD⁺的添加量为0.005～0.1摩尔，所述甲酸铵的添加量为1.5～5摩尔。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法在所述步骤B之后还包括：

在反应后的体系中加入浓盐酸调节所述体系的pH值≤1，过硅藻土，得到滤出液；

将所述滤出液pH值调节至5.0～7.0后过强酸性阳离子交换树脂，得到粗品；

将所述粗品浓缩，加醇类溶剂洗涤，烘干，得到纯化的所述L-环状烷基氨基酸。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：

制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；

将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；

使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸，

其中，结构式(Ⅲ)为

中，Br元素可以替换为其它卤素元素。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述结构式(Ⅲ)为所述中间产物在生物酶作用下发生水解反应。

5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述结构式(Ⅲ)为所述中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括：

制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；

将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；

使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸；使所述环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到所述环状烷基酮酸盐，

其中，结构式(Ⅲ)为

其中，Br元素可以替换为其它卤素元素，M₁’为一价阳离子。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述中间产物在氢氧化钠或氢氧化钾的作用下发生水解反应。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述环状烷基酮酸盐为环丙基酮酸盐，所述环丙基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：将环丙基甲基酮在碱性条件下进行氧化得到所述环丙基酮酸盐。

9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述氧化过程采用KMnO₄为氧化剂，并且在氧化反应完成之后将所述氧化剂还原至消失。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法包括以下步骤：

使环状烷基甲醛进行还原反应得到环状烷基甲基醇；

使所述环状烷基甲基醇进行卤代反应得到具有结构式(Ⅳ)的第二环状烷基甲基卤代物；

制备所述第二环状烷基卤代物的格氏试剂；

将所述格氏试剂与草酸二乙酯进行取代反应得到中间产物；

使所述中间产物发生水解反应得到所述环状烷基酮酸；

使所述环状烷基酮酸与CH₃OM₁’或M₁’OH进行反应得到所述环状烷基酮酸盐，

其中，结构式(Ⅳ)为

其中，Br元素可以替换为其它卤素元素，M₁’为一价阳离子。

11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述具有结构式(Ⅰ)的环状烷基酮酸盐的制备方法还包括所述环状烷基甲醛的制作过程，所述制作过程包括：

制备具有结构式(Ⅲ)的环状烷基卤代物的格氏试剂；

使所述格氏试剂进行Bouveault醛合成反应得到环状烷基甲醛；

其中，结构式(Ⅲ)为其中，Br元素可以替换为其它卤素元素。

12.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述具有结构式(Ⅱ)的环状烷基酮酸的制备方法包括以下步骤：

具有结构式(Ⅴ)的羧酸进行格氏试剂加成反应，得到中间产物；

将所述中间产物在碱性条件下进行水解反应，得到所述环状烷基酮酸，

其中，所述结构式(Ⅴ)为