CN101629192A - 微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用产腈水解酶的菌株，经产酶培养得到腈水解酶，以腈水解酶做为生物催化剂生物催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。本发明还涉及产腈水解酶的微生物的筛选方法和利用该方法筛选获得了具有腈水解酶活性的菌株。该发明为采用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础，具有重要应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种产腈水解酶的微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，以及这种微生物的筛选方法和利用该方法筛选获得的具有腈水解酶活性的菌株。
(二)背景技术
亚氨基二乙酸(IDA)是一种比较重要的化工原料，具有很强的络合能力能和多种金属离子络合而形成螯合物，和铜离子可以形成蓝色的鳌合物，常用作络合剂和表面活性剂，常用于有机合成，也是草甘膦(Glyphosate)生产的重要中间体。由于其分子中含有亚氨基和羧基，化学性质很活泼，广泛应用于电镀、染料、医药、电子等领域。是一种重要的化工中间体。
目前制备亚氨基二乙酸一般采用化学方法，根据原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氢氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。传统的化学方法存在产生成本高、污染严重、对设备要求高，或者使用剧毒的氢氰酸等弱点。利用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸与化学水解法相比，其优势在于：(1)反应条件温和。化学水解法需要在100℃左右进行，必须配备加热和温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高。而生物催化法一般都是在常温下进行，反应条件温和，设备成本相对较低。(2)原料消耗大幅度减少，基本不产生可溶性盐。利用腈水解酶一步水解生成亚氨基二乙酸，省去了碱解和酸化工艺，避免了NaOH和浓盐酸的大量使用。生物法中利用NH4OH调节转化体系的pH值，在产物回收中采用再生技术，可以有效减少可溶性盐的排放。(3)废水排放少。按照目前的化学水解工艺，生产每吨亚氨基二乙酸将至少产生废水8吨。采用生物法后，以腈水解酶酶活力10万单位计算(回用5次)，生产每吨亚氨基二乙酸的废水量可控制在2吨以下，且废水中不存在盐类等难处理杂质，可生化性强。
利用腈转化酶生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸，可以克服化学法生产亚氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今为止人类所知道的最高效、最具选择性的催化体系，可以提供许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。而且，生物转化反应条件温和、反应产物纯度高、容易分离和纯化，在农药中间体的生产中，显示出巨大的发展潜力。
(三)发明内容
本发明目的是微生物产酶培养得到腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的制备方法。本发明所另一目的是提供一种产腈水解酶的微生物的筛选方法，以及提供筛选得到的产腈水解酶的微生物。
本发明采用的技术方案是：
一种微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用产腈水解酶的菌株，经产酶培养得到腈水解酶，以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的过程如下：
本发明所述的制备亚氨基二乙酸的方法为：(A)将所述产腈水解酶的菌株接种至产酶培养基，加入诱导剂a于100～200r/min、20～35℃条件下进行发酵培养2～5d；所述诱导剂a为正丁腈、异丁腈或己内酰胺，诱导剂a添加量为1～20g/L产酶培养基；所述产酶培养基每1L按如下组成配制：甘油8g，酵母膏6g，NaCl 1g，K2HPO4 5g，MgSO4 0.2g，溶剂为水，pH值6.0～8.0；所述的诱导剂浓度为5g/L；(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0.5％～6％的水溶液，调初始pH为7.0～7.5，作为酶催化反应底物溶液，通常加入氨水、NaOH、或HCl水溶液来调pH；以步骤(A)发酵获得的湿菌体、细胞破碎获得的粗酶液或经固定化得到的固定化细胞作为酶源，酶源加入量以湿菌体计为0.1～10g湿菌体/10mL底物溶液；控制反应温度为20～55℃、反应pH为6.0～9.0，进行转化反应2～24h，反应结束后，反应液按常规方法进行分离纯化得到亚氨基二乙酸。
上述步骤(A)所述的发酵培养优选在30℃条件下进行发酵培养3d；步骤(B)所述的控制反应温度优选为30℃，进行转化反应10h。
本发明所述的产腈水解酶的微生物即产腈水解酶菌株的筛选方法，所述方法包括初筛和复筛：
(1)初筛：将待筛选菌株接种至初筛培养基，25～37℃培养1～4d，挑取菌落中产生黄色变色圈的菌株，接种到LB斜面培养基，25～30℃培养2～5d后取菌株进行复筛；所述初筛培养基终浓度组成如下：亚胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 1g/L，溴钾酚紫1g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH7.0；即所述初筛培养基每1L按如下组成配制：亚胺基二乙腈5g，酵母膏6g，NaCl 1g，K2HPO4 1g，MgSO4 1g，溴钾酚紫0.1g，琼脂粉20g，溶剂为水，pH7.0；
优选步骤(1)初筛所述的培养温度28～30℃，培养3～4d。
(2)复筛：将初筛获得的菌株接种至复筛培养基，100～200r/min、25～35℃下培养2～7d，收集菌体测定亚氨基二乙酸的生成量，收集生成亚氨基二乙酸含量大于10％的微生物；所述复筛培养基终浓度组成如下：甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCl 1g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4 0.2g/L，正丁腈5g，溶剂为水，pH7.0，即所述复筛培养基每1L按如下组成配制：甘油8g、酵母膏6g、NaCl 1g、K2HPO4 5g、MgSO4 0.2g，诱导剂b 5g，溶剂为水，pH7.0。
优选步骤(2)复筛所述的培养温度为30～32℃。
本发明所述的诱导剂a与诱导剂b所表示的都是微生物培养过程中的诱导剂，这里a和b只是用以区分诱导剂出现在不同步骤。
本发明还涉及根据所述方法筛选获得的可高效生产亚氨基二乙酸的产腈水解酶的菌株，所述菌株为下列之一：
(1)边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)ZJB09121，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209043，保藏日期2009年3月20日；
(2)敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209044，保藏日期2009年3月20日；
(3)产酸克雷伯氏菌(Kelbsiella ocytoca)ZJB09123，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209045，保藏日期2009年3月20日；
(4)弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209046，保藏日期2009年3月20日；
(5)紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209047，保藏日期2009年3月20日；
(6)嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209048，保藏日期2009年3月20日；
(7)赤红球菌(Rhodococcus rubber)ZJB09127，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209049，保藏日期2009年3月20日；
(8)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09129，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209050，保藏日期2009年3月20日；
(9)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09135，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209055，保藏日期2009年3月20日；
(10)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209051，保藏日期2009年3月20日；
(11)耐盐短杆菌(Brevibacterium halotoerans)ZJB09132，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209052，保藏日期2009年3月20日；
(12)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09134，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209054，保藏日期2009年3月20日；
(13)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJB09137，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209056，保藏日期2009年3月20日；
(14)粪产碱杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209057，保藏日期2009年3月20日；
(15)节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208252，保藏日期2008年12月21日。
上述菌株均由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种利用产腈水解酶的菌株经产酶培养，得到腈水解酶，以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的方法，可高效生产亚氨基二乙酸，本发明还提供了可产腈水解酶的微生物的筛选方法，并获得了多种产腈水解酶的菌株，为采用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸提供了基础，具有重要应用前景。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：产腈水解酶菌种的初筛
初筛培养基每1L按如下组成配制：酵母膏6g，NaCl 1g，K2HPO4 1g，MgSO4 1g，琼脂粉20g，pH7.0水补足至1000mL，灭菌后冷却到50℃加入5g亚氨基二乙腈和1g溴甲酚紫，混匀到平板。
收集细菌进行筛选，涂布于平板上，在温度28～30℃，培养3～4d，挑取菌落中产生黄色变色圈的菌株，接种到LB斜面培养(25～28℃)；
黄色变色圈的微生物菌株有：边缘假单胞菌ZJB09121(Pseudomonasmarginalis ZJB09121)、恶臭假单胞菌ZJB09134(Pseudomonas putiaZJB09134)、恶臭假单胞菌ZJB09129(Pseudomonas putia ZJB09129)、恶臭假单胞菌ZJB09135(Pseudomonas putia ZJB09135)、荧光假单胞菌ZJB09137(Pseudomonas fluorescens ZJB09137)、产酸克雷伯氏菌ZJB09123(Kelbsiella ocytoca ZJB09123)、弗氏红球菌ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、嗜吡啶红球菌ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)、紫红红球菌ZJB09125(Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、赤红球菌ZJB09127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、藤黄微球菌ZJB09131(Micrococcusluteus ZJB09131)、耐盐短杆菌ZJB09132(Brevibacterium halotoeransZJB09132)、敏捷食酸菌ZJB09122(Acidovorax facilis ZJB09122)、粪产碱杆菌ZJB09138(Alcaligenes faecalis ZJB09138)、节杆菌(Arthrobacternitroguajacolicus)ZJUTB06-99，上述菌株均已保藏至中国典型培养物保藏中心，具体保藏信息见发明内容部分。
实施例2：产腈水解酶菌种的复筛
将实施例1中有筛选到的可产生变色反应且黄色变色圈大的菌株，接种到复筛培养基中，30～32℃，100～200r/min，500mL三角瓶装液量150mL，发酵培养3d，发酵液离心得到粗酶液或湿菌体。各取1g湿菌体，置于500ml三角瓶中，加入50ml 2％(w/w)的反应底物亚氨基二乙腈水溶液，30℃摇床150r/min条件下反应60min，离心去除菌体，测定亚氨基二乙酸的生成量，计算转化率，结果见表1。
复筛培养基每1L按如下组成配制：甘油8g，酵母膏6g，NaCl 1g，K2HPO4 5g，MgSO4 0.2g，正丁腈5g，pH值7.0，水补足至1000mL；诱导剂正丁腈也可以异丁腈或己内酰胺代替。
表1：产腈水解酶菌种的复筛结果
| 序号 | 菌株名称 | 转化率(％) |
| 1 | 边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)ZJB09121 | 26.5 |
| 2 | 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122 | 21.9 |
| 3 | 产酸克雷伯氏菌(Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 | 22.3 |
| 4 | 弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124 | 23.6 |
| 5 | 紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 | 24.7 |
| 6 | 嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126 | 30.0 |
| 7 | 赤红球菌(Rhodococcus rubber)ZJB09127 | 23.3 |
| 8 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09129 | 24.4 |
| 9 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB0935 | 23,9 |
| 10 | 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131 | 24.7 |
| 11 | 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 | 25.8 |
| 12 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09134 | 13.1 |
| 13 | 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 | 14.3 |
| 14 | 粪产碱杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138 | 54.8 |
| 15 | 节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 | 26.4 |
实施例3：产腈水解酶微生物的培养及生物催化制备亚氨基二乙酸
产酶培养基每1L按如下组成配制：甘油8g、酵母膏6g、NaCl 1g、K2HPO4 5g、MgSO4 0.2g，水补足至1000mL；另加入诱导剂正丁腈5g。
产酶培养基分装于500mL三角瓶中，装液量100mL/瓶，用灭菌锅热灭菌20min，温度为121℃。
将实施例1中获得的菌株，分别接种1环经斜面活化培养的菌种到添加了诱导剂的产酶培养基中，在摇瓶转速为200r/min，温度为30℃下、培养3d，收集湿菌体作为腈水解酶粗酶。在100mL 3％(w/w)的亚氨基二乙腈水溶液中加入5g湿菌体进行水解反应，控制温度30℃、搅拌转速200r/min，氨水自动流加调节pH7.0，水解10h后测定产物亚氨基二乙酸的产率并计算转化率，结果见表2。
表2：产腈水解酶菌种亚氨基二乙酸的产率及转化率
| 序号 | 菌株名称 | 转化率(％) |
| 1 | 边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)ZJB09121 | 23.7 |
| 2 | 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122 | 25.1 |
| 3 | 产酸克雷伯氏菌(Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 | 20.8 |
| 4 | 弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124 | 24.5 |
| 5 | 紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 | 26.2 |
| 6 | 嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)ZJB09126 | 30.7 |
| 7 | 赤红球菌(Rhodococcus rubber)ZJB09127 | 23.9 |
| 8 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09129 | 23.1 |
| 9 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09135 | 24.2 |
| 10 | 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131 | 24.8 |
| 11 | 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 | 25.7 |
| 12 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09134 | 13.0 |
| 13 | 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 | 14.7 |
| 14 | 粪产碱杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138 | 54.9 |
| 15 | 节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 | 26.5 |
实施例4：游离细胞生物催化生产亚氨基二乙酸
为了考察实施例1中获得的细菌菌株所产腈水解酶的稳定性，按实施例3的方法，对实施例1中获得的细菌菌株进行游离细胞反复分批酶水解试验，水解10h后测定亚氨基二乙酸的含量，并离心收集菌体，离心收集的菌体再用于水解反应，反复3次。试验结果如表3。
表3：产腈水解酶菌种的游离细胞反复分批酶水解试验结果
实施例5：固定化细胞生物催化生产亚氨基二乙酸
为了进一步考察实施例1中获得的细菌菌株所产腈水解酶的稳定性，对部分菌株进行细胞固定化，并进行反复分批酶水解试验。
称取按实施例3培养的边缘假单胞菌ZJB09121(Pseudomonasmarginalis ZJB09121)、恶臭假单胞菌ZJB09134(Pseudomonas putiaZJB09134)、恶臭假单胞菌ZJB09129(Pseudomonas putia ZJB09129)、恶臭假单胞菌ZJB09135(Pseudomonas putia ZJB09135)、荧光假单胞菌ZJB09137(Pseudomonas fluorescens ZJB09137)、产酸克雷伯氏菌ZJB09123(Kelbsiella ocytoca ZJB09123)、弗氏红球菌ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、弗氏红球菌ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)、紫红红球菌ZJB09125(Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、赤红球菌ZJB09127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、藤黄微球菌ZJB09131(Micrococcusluteus ZJB09131)、耐盐短杆菌ZJB09132(Brevibacterium halotoeransZJB09132)、敏捷食酸菌ZJB09122(Acidovorax facilis ZJB09122、粪产碱杆菌ZJB09138(Alcaligenes faecalis ZJB09138)、节杆菌(Arthrobacternitroguajacolicus)ZJUTB06-99的菌体细胞，用去离子水配制成菌悬液，将浓度为2％(w/w)海藻酸钠加热溶解，冷却后将以湿菌体计的菌体细胞与海藻酸钠溶液配成6％(g湿菌体/ml海藻酸钠溶液)的均匀混合液，并将混合液滴入2％(w/w)的CaCl2溶液中，固定化12h；滤出颗粒，用生理盐水洗净，上述固定化的细胞再用0.2％(w/v)的戊二醛-HCl溶液(含30mM CaCl2)室温下搅拌处理24h，之后用蒸馏水洗3次，得到交联固定化细胞。将上述不同菌株的交联固定化细胞，用于反复分批水解拆分，反复3次，结果如表4。
表4：产腈水解酶菌种的游离细胞反复分批酶水解试验结果
实施例6：游离酶生物催化生产亚氨基二乙酸
将实施例1中经发酵获得的细菌菌体，利用0.9％生理盐水洗涤3次，收集菌体重悬于Tris-HCl pH7.0缓冲液中，调节菌体浓度以湿菌体计为10％(g/ml)，利用超声波、高压破碎仪、高压均质机对细胞进行破碎，得到含有游离腈水解酶的粗酶液，利用游离酶进行生物催化反应。在9ml3％(w/w)的亚氨基二乙腈水溶液中加入1ml粗酶液进行水解反应，控制温度30℃、搅拌转速200r/min，氨水自动流加调节pH7.0，水解10h后，10000rpm离心20min后，测定上清液中产物亚氨基二乙酸的产率并计算转化率，结果见表5。
表5：游离腈水解酶生物催化生产亚氨基二乙酸结果
| 序号 | 菌株名称 | 转化率(％) |
| 1 | 边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)ZJB09121 | 22.9 |
| 2 | 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122 | 26.7 |
| 3 | 产酸克雷伯氏菌(Kelbsiella ocytoca)ZJB09123 | 22.3 |
| 4 | 弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124 | 24.1 |
| 5 | 紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125 | 27.2 |
| 6 | 嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)ZJB09126 | 29.1 |
| 7 | 赤红球菌(Rhodococcus rubber)ZJB09127 | 24.7 |
| 8 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09129 | 26.5 |
| 9 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09135 | 28.3 |
| 10 | 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131 | 31.2 |
| 11 | 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotoerans)ZJB09132 | 25.6 |
| 12 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09134 | 20.1 |
| 13 | 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJB09137 | 15.3 |
| 14 | 粪产碱杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138 | 55.9 |
| 15 | 节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99 | 28.7 |
通过以上实施例得出结论：本发明所筛选获得的假单胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Kelbsiella)、红球菌(Rhodococcus)、微球菌(Micrococcus)、杆菌(Alcaligenes)、短杆菌(Brevibacterium)、节杆菌(Arthrobacter)、食酸菌(Acidovorax)等属的菌株及其突变株，对生产亚氨基二乙酸均有效，无论游离细胞、细胞破碎后的游离酶、固定化细胞都有很好的转化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的效果。这些菌株的游离细胞和固定化细胞所产的腈水解酶的稳定性较好，因此这些菌株可用于生物催化水解亚氨基二乙腈，进而生产亚氨基二乙酸。
Claims (9)
1.微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，其特征在于所述的方法是利用产腈水解酶的菌株经产酶培养得到腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为：(A)将所述产腈水解酶的菌株接种至产酶培养基，加入诱导剂a于100～200r/min、20～35℃条件下进行发酵培养2～5d；所述诱导剂a为正丁腈、异丁腈或己内酰胺，诱导剂a的添加量为1～20g/L产酶培养基；所述产酶培养基终浓度组成为：甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl 1g/L，K2HPO45g/L，MgSO40.2g/L，溶剂为水，pH值6.0～8.0；所述诱导剂的终浓度为5g/L，(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0.5％～6％的水溶液，调初始pH为7.0～7.5，作为酶催化反应底物溶液；以步骤(A)发酵获得的湿菌体、细胞破碎获得的粗酶液或经固定化得到的固定化细胞作为酶源，酶源加入量以湿菌体计为0.1～10g湿菌体/10mL底物溶液；控制反应温度为20～55℃、反应pH为6.0～9.0，进行转化反应8～16h，反应结束后，反应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0.5％～6％的水溶液，以氨水、NaOH或HCl水溶液调pH为7.0～7.5。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(A)所述的发酵培养在30℃条件下进行发酵培养3d。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(B)所述的控制反应温度为30℃，进行转化反应10h。
6.如权利要求1所述的方法，所述的产腈水解酶的菌株按如下方法筛选得到：
(1)初筛：将待筛选菌株接种至初筛培养基，25～37℃培养1～4d，挑取菌落中产生黄色变色圈的菌株，接种到LB斜面培养基，25～30℃培养2～5d后取菌株进行二次筛选获得初筛菌株；所述初筛培养基终浓度组成如下：亚胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L，NaCl1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 1g/L，溴钾酚紫1g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 7.0；
(2)复筛：将步骤(1)获得的初筛菌株接种至复筛培养基，100～200r/min、25～35℃下培养2～7d，收集菌体测定其腈水解酶活力；筛选出产亚氨基二乙酸含量高于10％的微生物，所述复筛培养基终浓度组成如下：甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCl 1g/L、K2HPO45g/L、MgSO40.2g/L，诱导剂b 5g/L，溶剂为水，pH 7.0；所述的诱导剂为b为正丁腈、异丁腈或己内酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)初筛所述的培养温度28～30℃，培养3～4d。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)复筛所述的培养温度为30～32℃。
9.如权利要求1～8之一所述方法，所述产腈水解酶的菌株为下列之一：
(1)边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)ZJB09121，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209043，保藏日期2009年3月18日；
(2)敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209044，保藏日期2009年3月18日；
(3)产酸克雷伯氏菌(Kelbsiella ocytoca)ZJB09123，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209045，保藏日期2009年3月18日；
(4)弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)ZJB09124，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209046，保藏日期2009年3月18日；
(5)紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ZJB09125，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209047，保藏日期2009年3月18日；
(6)嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)ZJB09126，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209048，保藏日期2009年3月18日；
(7)赤红球菌(Rhodococcus rubber)ZJB09127，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209049，保藏日期2009年3月18日；
(8)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09129，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209050，保藏日期2009年3月18日；
(9)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09135，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209055，保藏日期2009年3月18日；
(10)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M 209051，保藏日期2009年3月18日；
(11)耐盐短杆菌(Brevibacterium halotoerans)ZJB09132，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209052，保藏日期2009年3月18日；
(12)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putia)ZJB09134，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209054，保藏日期2009年3月18日；
(13)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJB09137，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209056，保藏日期2009年3月18日；
(14)粪产碱杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB09138，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209057，保藏日期2009年3月18日；
(15)节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208252，保藏日期2008年12月11日。
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Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373246A (zh) * | 2010-08-24 | 2012-03-14 | 陈依军 | 一种制备l-高苯丙氨酸的方法 |
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