CN102911975A

CN102911975A - 重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法

Info

Publication number: CN102911975A
Application number: CN2012103353862A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 金利群; 柳志强; 薛亚平; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明公开了一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法：以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值7.0~9.0缓冲液的反应体系中，在25~40℃、150~200rpm水浴摇床反应0.5~2h，反应结束后将反应液后处理获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；本发明将基因工程菌用于生物催化生产蛋氨酸实验，该菌可有效生物催化生产蛋氨酸，2h内2-氨基-4-甲硫基丁腈转化率达到80~100%，因此该菌在生物催化生产蛋氨酸的领域中具有广泛的应用前景。

Description

重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法

（一）技术领域

本发明涉及2-氨基-4-甲硫基丁酸的酶法生产工艺，特别涉及一种在酶促合成基础上发展起来的用重组工程菌的酶催化技术来生产2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法。

（二）背景技术

2-氨基-4-甲硫基丁酸（蛋氨酸）被广泛用于医药、食品、饲料和化妆品等领域，其中饲料添加剂的用量最大。作为禽类第一限制性必需氨基酸，蛋氨酸是动物饲料里一种必不可少的添加剂，加有蛋氨酸的动物饲料可以在短时间内帮助动物快速成长，增加瘦肉量和缩短饲养周期，节省大约40%的饲料。在医药工业中，蛋氨酸是氨基酸输液和复合氨基酸的主要成份之一。蛋氨酸除了参与动物体内甲基的转移及磷的代谢和肾上腺素、胆碱和肌酸的合成外，还是合成蛋白质和胱氨酸的原料；另外，蛋氨酸是一种很好的抗氧化剂，因为蛋氨酸分子中所含的硫原子能清除自由基，身体细胞内的核酸胶原蛋白质的合成都需要蛋氨酸，对服用避孕药的妇女，服用蛋氨酸也有好处；此外蛋氨酸在食品工业、生物和化学研究、照相技术、美容和化妆品等领域中也有广泛的应用。

蛋氨酸的生产方法分为化学法和生物法两大类；化学法按原料分为丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法、酪朊水解法、固液相转移催化法等，目前世界上主要的蛋氨酸生产公司均以丙烯醛法为基础发展出自己蛋氨酸生产工艺，其余的化学方法在工艺路线、产品收率等方面与丙烯醛法有很大差距，现基本废弃不用。近几年来生物法在医药品和精细化工生产中发展迅速，主要有发酵法和生物催化法。发酵法生产蛋氨酸全部为L型，主要借助微生物具有合成各种氨基酸的能力，通过对菌株的诱变处理，选育出各种营养缺陷型及抗性变异株，以解除代谢调节中的反馈及阻遏，达到过量合成氨基酸的目的。蛋氨酸在蛋白质合成中是信息核糖核酸“翻译”成蛋白质过程中的第一步，所以没有蛋氨酸的存在就无法开始合成蛋白质，就不能像其它氨基酸那样利用相应的遗传缺陷型菌株经发酵法生产。发酵法生产蛋氨酸收率很低，没有工业化应用价值。最近吉林大成集团在发酵法生产蛋氨酸方面有了突破性进展，该公司宣称在未来的3年内，大成生化集团的发酵法合成蛋氨酸生产工艺有望研发成功并实现工业化生产。

另外一种具有工业化应用潜力的的方法为生物催化法，许多企业也对生物催化法生产蛋氨酸进行了大力的研究如德固赛公司报道了腈水合酶法蛋氨酸合成工艺：从β-甲硫基丙醛出发，通过Strecker反应合成2-氨基-4-甲硫基丁腈后，利用氰基耐受型腈水合酶催化水合得到2-氨基-4-甲硫基丁酰胺，最后在金属催化剂催化下得到蛋氨酸，反应方程式如式（Ⅰ）所示：

曹达公司和罗纳-普朗克公司都对腈水解酶催化工艺进行了研究，采用具有腈水解酶活性的生物催化剂（菌体或固定化细胞）水解外消旋的2-氨基-4-甲硫基丁腈制备外消旋的2-氨基-4-甲硫基丁酸，反应流程如式（Ⅱ）所示。具有腈水解酶活性菌种多为Alcaligenes faecalis、Rhodococcussp.、Gordona terrae、Rhodococcus rhodochrous。罗纳-普朗克利用重组腈水解酶菌株催化制备羟基蛋氨酸工艺每千克干菌体每小时催化得到0.6kg2-羟基-4-甲硫基丁酸，而曹达公司利用节杆菌腈水解酶催化制备蛋氨酸的工艺每千克干菌体每小时催化得到0.9kg蛋氨酸，生产水平都相对较低。

蛋氨酸是高附加值的精细化工产品，长期以来全球市场对蛋氨酸的需求都保持着快速增长态势，近几年全球蛋氨酸需求量以4%～5%的幅度增长，急需一种更先进的方法来生产蛋氨酸，满足广大的市场需求。已报道的利用含腈水解酶野生菌催化制备蛋氨酸酶活力比较低，转化不完全，对后续蛋氨酸的结晶分离带来困难。本发明的目的是克服现有技术的缺陷，本发明的工艺流程如式（Ⅲ）所示：

（三）发明内容

本发明目的是提供一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法，即在酶促合成基础上发展起来的用重组工程菌酶催化技术来生产2-氨基-4-甲硫基丁酸，将腈水解酶通过质粒构建方法，在大肠杆菌的菌种内表达出来，之后通过离心收集菌体来作为催化剂催化蛋氨酸的合成，最后通过纯化可以得到所需的纯品，这种方法可以大大简化生产工艺，提高腈水解酶的活力，从而提高生产水平，降低生产成本。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法，所述方法为：以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养（通常以IPTG为诱导剂）获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值7.0~9.0缓冲液的反应体系中，在25~40℃、150~200rpm条件下转化反应0.5~2h，反应结束后将反应液后处理，获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述酶源获得方法为：构建含SEQ ID NO：1所示腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腈水解酶的湿菌体。

进一步，所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6.0~36g/L反应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2.5~6.25g/L反应体系（更优选5g/L反应体系）。

进一步，所述反应液后处理方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液用无水乙醇搅拌萃取，再于4℃下静置结晶，抽滤，取滤饼（即晶体）在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸（蛋氨酸）。

更进一步，所述酶源的获得方法为：

（1）重组基因工程菌：将来源于敏捷嗜酸菌（Acidovorax facilis）CCTCC NO.M209044（专利CN 200910100875.8中已报道该菌）。菌株中的基因组DNA为模板，经过PCR扩增得到SEQ ID NO：1所示腈水解酶基因，然后构建含腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌；所述的敏捷嗜酸菌（Acidovorax facilis）CCTCC NO.M209044保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。保藏日期2009年3月18日，该菌株已作为新菌株在先申请的专利“微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法（专利号200910100875.8）中予以保护。

（2）酶源：将步骤（1）重组工程菌接种至含50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积比3%的接种量接种到新鲜的含50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6~0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，37℃诱导培养8h，获得诱导培养液，然后将诱导培养液在4℃、10000rpm离心10min，弃去上清收集湿菌体，获得所述酶源，或者将湿菌体进行超声破碎，取破碎混合液作为酶源。

所述重组基因工程菌推荐按如下步骤制备：在SEQ ID NO：1所示腈水解酶基因序列中引入BamHI和SalI限制性内切酶酶切位点，在限制性内切酶BamHI和SalI的作用下，获得腈水解酶基因片段，胶回收；然后利用T4DNA连接酶将胶回收产物与相同限制性内切酶消化的表达载体pET-28b进行连接，得到重组表达质粒pET-28b-NIT，并将其电转化至大肠杆菌BL21(DE3)，即可得到所述含腈水解酶的重组基因工程菌（E.coliBL21(DE3)/pET-28b-NIT）。

本发明所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，优选为：以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值8.0Tris-HCl缓冲液的反应体系中，在30℃、150rpm条件下转化0.5h，反应结束后，将反应液离心，弃沉淀，取上清液加入无水乙醇搅拌萃取，再于4℃下静置结晶，抽滤，取滤饼（即晶体）在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6.0g/L反应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2.5g/L反应体系。

本发明所述SEQ ID NO：1所示的腈水解酶基因的获得方法为：

利用PCR技术，在引物P1（5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’）、P2（5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’）的作用下，以来源于敏捷嗜酸菌（Acidovorax facilis）CCTCC NO.M209044中的基因组DNA为模板，克隆腈水解酶基因片段，PCR反应进程：94℃5min；94℃45s，55℃45s，35个循环；72℃2min；72℃10min。将该片段与pMD18-T载体连接，得到克隆载体pMD18-T-NIT和转化了pMD18-T-NIT的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，得到长度为1121bp腈水解酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示：

1-50AGGCCATGGT ATCTTACAAC TCCAAATTTC TGGCTGCTAC CGTACAGGCT

51-100GAACCGGTTT GGCTGGACGC GGACGCAACT ATCGATAAAT CTATTGGTAT

101-150CATCGAGGAG GCGGCCCAGA AAGGTGCGTC TCTGATTGCC TTCCCGGAAG

151-200TTTTCATCCC TGGTTACCCG TATTGGGCCT GGCTGGGTGA CGTAAAGTAC

201-250TCCCTGTCCT TCACCTCCCG TTACCACGAA AACTCCCTGG AACTGGGTGA

251-300CGACCGTATG CGCCGTCTGC AACTGGCTGC GCGTCGTAAC AAAATCGCGC

301-350TGGTTATGGG TTACAGCGAG CGTGAGGCAG GCAGCCGCTA CCTGTCCCAG

351-400GTCTTTATCG ACGAACGTGG TGAAATCGTT GCTAACCGTC GTAAACTGAA

401-450ACCAACTCAC GTTGAACGTA CGATTTATGG TGAAGGCAAC GGTACCGACT

451-500TTCTGACGCA TGACTTCGCA TTTGGTCGTG TTGGTGGTCT GAACTGCTGG

501-550GAGCACTTTC AGCCGCTGTC CAAATTCATG ATGTACTCCC TGGGTGAACA

551-600GGTACACGTC GCTTCTTGGC CGGCTATGTC CCCGCTGCAA CCGGACGTGT

601-650TTCAAACCTC CATCGAGGCT AATGCGACCG TAACCCGCTC CTATGCTATT

651-700GAAGGCCAAA CCTTCGTTCT GTGCTCTACG CAGGTTATCG GTCCGTCTGC

701-750AATTGAAACC TTCTGTCTGA ACGATGAGCA ACGTGCACTG CTGCCGCAGG

751-800GTTGCGGTTG GGCGCGTATC TACGGCCCGG ACGGCAGCGA ACTGGCCAAG

801-850CCGCTGGCTG AAGACGCAGA GGGTATTCTG TACGCAGAAA TCGATCTGGA

851-900ACAGATTCTG CTGGCCAAGG CTGGCGCTGA TCCGGTTGGT CACTACAGCC

901-950GCCCTGATGT CCTGTCCGTG CAGTTCGACC CGCGTAACCA CACCCCGGTA

951-1000CACCGCATTG GTATCGATGG CCGTCTGGAT GTTAACACGC GTTCCCGTGT

1001-1050AGAAAACTTTCGCCTGCGTCAGGCAGCAGA ACAGGAACGT CAGGCCAGCA

1051-1100AACGTCTGGGCACGAAACTG TTTGAACAGT CTCTGCTGGC GGAGGAGCCG

1101-1121GTACCAGCCA AACTCGAGAT T

本发明所述腈水解酶基因编码的腈水解酶氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示：

1-20MVSYNSKFLA ATVQAEPVWL

21-40DADATIDKSI GIIEEAAQKG

41-60ASLIAFPEVF IPGYPYWAWL

61-80GDVKYSLSFT SRYHENSLEL

81-100GDDRMRRLQL AARRNKIALV

101-120MGY SEREAGS RYLSQVFIDE

121-140RGEIVANRRK LKPTHVERTI

141-160YGEGNGTDFL THDFAFGRVG

161-180GLNCWEHFQP LSKFMMYSLG

181-200EQVHVASWPA MSPLQPDVFQ

201-220TSIEANATVT RSYAIEGQTF

221-240VLCSTQVIGP SAIETFCLND

241-260EQRALLPQGC GWARIYGPDG

261-280SELAKPLAED AEGILYAEID

281-300LEQILLAKAG ADPVGHYSRP

301-320DVLSVQFDPR NHTPVHRIGI

321-340DGRLDVNTRS RVENFRLRQA

341-360AEQERQASKR LGTKLFEQSL

361-372LAEEPVPAKL EI

本发明所述湿菌体的干重测量方法为：量取25~50ml诱导培养液，8000~10000rpm离心8~12min，菌体（即沉淀）用生理盐水清洗后再次离心，离心后菌体（即沉淀）置于90~100℃烘箱中烘干至恒重，使用分析天平称重并计算湿菌体含水量，进而计算湿菌体的菌体干重。

腈水解酶的酶活定义为：在40℃下，每分钟催化生成1μmol蛋氨酸所需要的酶量（菌体量）记为一个活力单位U，每毫克酶（干菌体）所含有的酶活数定义为U/mg（U/g DCW）。

利用本发明的重组腈水解酶催化制备蛋氨酸的工艺，每千克干菌体每小时催化可以得到19.2kg蛋氨酸，远远大于现有技术的生产水平。罗纳-普朗克利用重组腈水解酶菌株催化制备羟基蛋氨酸工艺每千克干菌体每小时催化得到0.6kg 2-羟基-4-甲硫基丁酸（参见专利申请：CN1181204C），而曹达公司利用节杆菌腈水解酶催化制备蛋氨酸的工艺每千克干菌体每小时催化得到0.9kg蛋氨酸（参见专利申请：CN1671855A），生产水平都相对较低。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明提供一种由腈水解酶基因编码的腈水解酶，其在适合条件下，能有效生产蛋氨酸；（2）本发明将基因工程菌用于生物催化生产蛋氨酸实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产蛋氨酸，2h内2-氨基-4-甲硫基丁腈转化率达到80~100%，因此该菌在生物催化生产蛋氨酸的领域中具有广泛的应用前景。

（四）附图说明

图1为腈水解酶基因组PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图：M为DL2000DNA Marker；平行样在泳道1、2、3、4，在1.1kb处均有明亮的特异性条带。

图2为腈水解酶的SDS-PAGE图，M：蛋白分子量Marker；泳道1：IPTG诱导的E.coli BL21(DE)/pET-28b-NIT；泳道2：破碎后的酶液；泳道3：未经诱导的E.coli BL21(DE)/pET-28b-NIT，泳道4：Nickel-NTA亲和层析纯化后的酶液。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10~15g/L，酵母粉5~10g/L，NaCl 5~8g/L。

实施例1：腈水解酶基因原核表达质粒的构建

利用PCR技术，以敏捷嗜酸菌（Acidovorax facilis）CCTCC NO.M209044中的基因组DNA（美国MP公司基因组提取试剂盒）为模板，利用设计的正反引物进行PCR扩增，扩增体系见表1所示，引物如下：

P1:5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’

P2:5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’.

PCR反应体系为：

表1PCR扩增反应体系

PCR反应进程：94℃5min；94℃45s，55℃45s，35个循环；72℃2min；72℃10min。

扩增产物为长度1121bp腈水解酶基因序列（SEQ ID NO.1）。

取5μL PCR反应液用0.9%琼脂糖凝胶电泳检测，首先将配制好的0.9%的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；待凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold View（EB替代品），混合均匀后倒入电泳凝胶板槽中，除去气泡后插入点样梳；待凝胶凝固后，小心取出点样梳，将凝胶板放入电泳槽中，同时加入TAE电泳缓冲液；取5μLPCR反应液加入6×Loading Buffer 1.5μL和ddH₂O 4μL混合后用移液枪点样，泳道1、2、3、4为平行样；开始电泳，电压最高不超过5v/cm；当样品（蓝色边际线）跑过胶板的2/3时，终止电泳；将凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照，结果见图1所示，从图1中可以看出，泳道1、2、3、4在1.1kb处均有明亮的特异性条带。

实施例2含腈水解酶基因的重组基因工程菌的构建

根据实施例1获得的SEQ ID NO.1序列，并引入BamHI和SalI限制性内切酶酶切位点，利用限制性内切酶BamHI和SalI处理SEQ IDNO.1序列；然后与相同限制性内切酶消化的表达载体pET-28b进行连接，得到重组表达质粒pET-28b-NIT，并将其电转化至大肠杆菌BL21（DE3），即得到重组基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-28b-NIT。

实施例3：腈水解酶基因的表达

（1）含有腈水解酶基因的细胞：将实施例2方法构建的含有重组质粒pET-28b-NIT的重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-NIT接种至LB液体培养基中（含有50μg/ml的卡那霉素），37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积比3%的接种量接种到新鲜的含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度（即OD₆₀₀）约为0.6~0.8左右，再向上述LB液体培养基中加入诱导剂IPTG（终浓度为0.2mM），37℃诱导培养8h，获得诱导培养液，然后将诱导培养液在4℃、10000rpm离心10min，收集湿菌体，获得含腈水解酶的湿菌体（即重组大肠杆菌全细胞），作为酶源用于蛋氨酸的制备。

（2）纯化腈水解酶：将上述湿菌体在300w下超声破碎20min(1s,1s)后，获得含腈水解酶的破碎混合液，然后将破碎混合液在4℃，10,000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，经Nickel-NTA亲和层析纯化后，收集洗脱液，获得所述纯化的腈水解酶酶液，并进行酶活和SDS-PAGE凝胶电泳分析。

腈水解酶分离纯化步骤：预装好的Nickel-NTA亲和层析柱（Bio-Rad,USA），用Binding buffer(20mM NaH₂PO₄，pH 8.0；300mM NaCl)进行平衡，平衡时间一般为1ml/min 3-5个柱床体积所需的时间。然后进行上样（即破碎混合液离心后的上清液），接着用Washing buffer (20mMNaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；50mM imidazole)洗脱，将未吸附或弱吸附的蛋白除去后，用Elution buffer (20mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mMNaCl；500mM imidazole)将目标蛋白从层析柱上洗脱下来，收集洗脱液。整个过程中始终保持流速为1ml/min。将洗脱液利用截留分子量为30KDa的透析膜进行透析，以去除高浓度的NaCl，防止影响酶活，取截留液即获得纯化的腈水解酶酶液。

SDS-PAGE凝胶电泳条件为：80v、150min，然后考马斯亮蓝染色液染色30min，加脱色液脱色过夜，待出现明显蛋白条带为止。

（3）同时以同样条件下不加入诱导剂IPTG获得的湿菌体（即未经IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-NIT）作为对照，分别将IPTG诱导后获得的湿菌体（E.coli BL21(DE)/pET-28b-NIT）、未经IPTG诱导获得的湿菌体、IPTG诱导后获得的湿菌体经超声破碎后的破碎混合液、IPTG诱导后获得的湿菌体经超声破碎后的细胞破碎液经亲和层析纯化获得的纯化腈水解酶的酶液进行电泳分析，结果如图2所示，M：蛋白分子量Marker；泳道1：0.2mM IPTG诱导的重组大肠杆菌全细胞E.coliBL21(DE)/pET-28b-NIT；泳道2：IPTG诱导后获得的湿菌体经超声破碎后的破碎混合液；泳道3：未经IPTG诱导的重组大肠杆菌全细胞E.coliBL21(DE)/pET-28b-NIT，泳道4：Nickel-NTA亲和层析纯化后的纯化腈水解酶。

实施例4重组腈水解酶制备蛋氨酸（2-氨基-4-甲硫基丁酸）

将实施例3方法制备的腈水解酶酶液为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物来测定重组大肠杆菌腈水解酶活性。考察对象以实施例3经IPTG诱导的湿菌体（即重组大肠杆菌全细胞E.coli BL21(DE3)/ET28b(+)-NIT）以及诱导后分离纯化得到的腈水解酶酶液分别作为催化剂，同时以同样条件下培养的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)湿菌体和未经IPTG诱导的湿菌体（即重组大肠杆菌全细胞E.coli BL21(DE3)/ET28b(+)-NIT）为对照，湿菌体的质量用量以菌体干重计为2.5g/L反应体系，腈水解酶酶液的质量用量为0.37mg/g底物。

分别将酶源与底物和缓冲液（Tris-HCl pH8.0）构成转化体系20ml，底物2-氨基-4-甲硫基丁腈初始终浓度为18g/L，在30℃，150rpm条件下转化反应10min，然后分别加入10μl（质量浓度36-38%）的浓盐酸终止反应，离心取上清液利用HPLC检测产物含量，结果见表2所示。

酶活定义为：40℃、每分钟催化生成1μmol蛋氨酸所需要的酶量（菌体量）记为一个活力单位U，每毫克酶（干菌体）所含有的酶活数定义为U/mg（U/g DCW）。

从表2中可以看出，重组E.coli BL21(DE3)/ET28b(+)-NIT已成功构建，并能够表达具有高活力的腈水解酶，经分离纯化后得到的电泳纯腈水解酶酶活达到980U/mg。

表2酶活比较

由上述的实验结果可知，本发明将腈水解酶基因转化到大肠杆菌得到的重组大肠杆菌具有很好的腈水解酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或转化反应，该腈水解酶可以以2-氨基-4-甲硫基丁腈作为底物进行转化反应制备蛋氨酸。

实施例5：pH值对重组腈水解酶酶活的影响

缓冲体系：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(100mM，pH3.0-6.0)缓冲液，磷酸盐缓冲液(100mM，pH6.0-8.0)，Tris-HCl缓冲液(100mM，pH7.0-9.0)。

分别称取0.2g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g），再分别加入初始终浓度6g/L的2-氨基-4-甲硫基丁腈于不同pH缓冲液（pH分别为3、4、5、6、7、8、9）的转化体系20ml中，在35℃，150rpm水浴摇床上转化反应10min，分别取0.5ml转化反应液加入质量浓度36~38%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液分别进行HPLC产物分析。HPLC分析条件为：日本岛津液相色谱仪；大连伊力特色谱柱：不锈钢填充柱，填料为C₁₈（250mm×4.6mm）；流动相：甲醇：水=25:75（V：V）；流速1ml/min，柱温40℃，进样量10μL，紫外检测，检测波长210nm。

结果表明重组腈水解酶耐受的pH范围较广，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的酸性缓冲体系中，pH6.0以下酶活损失较大；在磷酸盐缓冲体系中，当pH值大于7.0时，酶活有下降的趋势，而在相同pH的Tris-HCl缓冲体系中却无此现象，在pH8.0的Tris-HCl缓冲体系中酶活达到最高，最大酶活为1050U/g DCW，比对照纯水体系酶活提高了25%。在Tris-HCl缓冲体系中pH大于8.0时酶活又有下降的趋势。总体来说在偏酸性的条件下，酶活随pH值的升高而增加，当偏碱性的条件下，酶活随pH值的增加而有所下降，但是下降幅度不大。

实施例6：温度对重组腈水解酶酶活的影响

分别取0.2g实施例3步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g），再分别加入初始质量终浓度6.0g/L 2-氨基-4-甲硫基丁腈，与pH8.0的Tris-HCl缓冲液的反应体系20ml中，于不同温度的水浴摇床上进行转化反应，催化温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，为防止底物完全反应，转化反应进行10min后，分别取转化反应液0.5ml加入10μl质量浓度36%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液分别进行HPLC分析产物（分析条件同实施例5）。

结果表明温度从25℃增加到40℃过程中，酶活随着温度的增加而提高；高于40℃，酶活急剧下降，这可能是由于温度过高，酶发生变性而失活的缘故。其中在40℃酶活达到最大，最大酶活为1160U/g DCW，所以，此腈水解酶的温度耐受性范围较广，在60℃时腈水解酶还具有活性，酶活只有最大酶活的16.5%。

实施例7：金属离子对重组腈水解酶活性的影响

以不添加任何金属离子的转化体系中的酶活为标准，分别计算转化体系中添加终浓度5mmol/L的CoCl₂、MgCl₂、CuSO₄、ZnSO₄、CaCl₂、Al₂(SO₄)₃、FeCl₃、FeCl₂、NiCl₂、AgNO₃、HgCl₂水解酶的相对酶活（RelativeActivity）。

分别取0.2g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g），再分别加入初始质量终浓度6.0g/L的2-氨基-4-甲硫基丁腈，于pH8.0Tris-HCl缓冲液的转化体系20ml中，在40℃、150rpm条件下反应10min，分别取0.5ml转化液，加入10μl质量浓度36%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液分别进行HPLC分析产物（分析条件同实施例5）。

结果表明，金属离子对腈水解酶的活力都有一定的影响，特别是Ag⁺和Hg²⁺等对腈水解酶的活力有抑制作用。当反应体系中有硫基螯合剂Ag⁺和Hg²⁺存在时，腈水解酶的活力只有对照组的10%左右，这表明硫基基团在催化作用中具有重要作用。另外，Mg²⁺、Ni²⁺提升腈水解酶活力10%左右；Mn²⁺也有很小幅度的促进作用；EDTA对腈水解酶有很小幅度的抑制作用，该结果也表明该腈水解酶在行使催化功能时不需要2价金属离子的参与。

实施例8：底物浓度对酶活性的影响

分别取0.2g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g）加入不同终浓度底物2-氨基-4-甲硫基丁腈（6g/L、12g/L、18g/L、24g/L、30g/L、36g/L），于pH8.0Tris-HCl缓冲液的转化体系20ml中，在40℃、150rpm条件下转化反应10min，分别取0.5ml转化反应液加入10μl质量浓度36%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析产物（分析条件同实施例5）。

结果表明底物在低浓度的范围内，酶活随着底物浓度增加而增加；当底物浓度在19.5~32.5g/L（即150~250mM）时，酶活达到最大并保持稳定，最大酶活为2800U/g DCW；此时再随着底物浓度的增加酶活在逐渐的降低，即高浓度的底物对酶活性具有抑制作用，且随着底物浓度的增大抑制作用增强。

实施例9

分别取0.2g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g）加入不同终浓度的2-氨基-4-甲硫基丁腈（6g/L、30g/L、36g/L），于pH8.0Tris-HCl缓冲液的转化体系20ml中，在180rpm、40℃条件下反应，分别在反应5min、10min、15min、30min、45min、60min和120min时取0.5ml转化反应液加入10μl质量浓度36%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析（分析条件同实施例5）。

结果表明当底物浓度为18g/L时，20分钟时转化率90%，25分钟后已经检测不到底物的残余，底物转化率100%。当底物浓度为30g/L时，底物全部转化为产物需要60min。当底物浓度为36g/L时，2h底物完全转化。

实施例10：蛋氨酸的制备

取0.2g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.05g）加入终浓度36g/L的2-氨基-4-甲硫基丁腈，于pH8.0Tris-HCl缓冲液的转化体系20ml中，在180rpm、40℃条件下转化反应2h，反应结束后，将反应液离心，取上清液10ml，向其中加入10ml的无水乙醇，搅拌萃取，4℃冰箱中低温结晶2h，抽滤，取滤饼（即晶体），将所获晶体置于真空干燥箱中进行真空干燥2h，获得2-氨基-4-甲硫基丁酸，进行HPLC分析（分析条件同实施例5）。

结果表明萃取分离到的晶体即为2-氨基-4-甲硫基丁酸，经反复晶析后纯度达到了99%以上，转化液萃取后获得0.3g晶体，收率达到99%。

实施例11：重组菌的催化活力

取1.5g实施例3方法步骤（1）获得的湿菌体（干重为0.375g）加入终浓度250mM的2-氨基-4-甲硫基丁腈，于pH8.0Tris-HCl缓冲液的转化体系150ml中，在180rpm、40℃条件下反应，反应60min时取0.5ml转化反应液加入10μl质量浓度36%的浓盐酸终止反应，10000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析（分析条件同实施例5）。结果表明，本发明每克重组腈水解酶干菌体每小时催化得到19.2g蛋氨酸；

而曹达公司专利报道（专利申请：CN1671855A）将节杆菌NSSC204株的培养液进行分离，用离子交换水洗涤后，将其悬浊于含5.5g2-氨基-4-甲硫基丁腈的溶液中，菌体添加量按干燥菌体浓度计为2%（W/W），在35℃下一边振荡一边进行水解反应，1h后离心分离，除去菌体，进行HPLC分析，得到每克节杆菌干菌体每小时催化得到0.9g蛋氨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1121

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

aggccatggt atcttacaac tccaaatttc tggctgctac cgtacaggct gaaccggttt 60

ggctggacgc ggacgcaact atcgataaat ctattggtat catcgaggag gcggcccaga 120

aaggtgcgtc tctgattgcc ttcccggaag ttttcatccc tggttacccg tattgggcct 180

ggctgggtga cgtaaagtac tccctgtcct tcacctcccg ttaccacgaa aactccctgg 240

aactgggtga cgaccgtatg cgccgtctgc aactggctgc gcgtcgtaac aaaatcgcgc 300

tggttatggg ttacagcgag cgtgaggcag gcagccgcta cctgtcccag gtctttatcg 360

acgaacgtgg tgaaatcgtt gctaaccgtc gtaaactgaa accaactcac gttgaacgta 420

cgatttatgg tgaaggcaac ggtaccgact ttctgacgca tgacttcgca tttggtcgtg 480

ttggtggtct gaactgctgg gagcactttc agccgctgtc caaattcatg atgtactccc 540

tgggtgaaca ggtacacgtc gcttcttggc cggctatgtc cccgctgcaa ccggacgtgt 600

ttcaaacctc catcgaggct aatgcgaccg taacccgctc ctatgctatt gaaggccaaa 660

ccttcgttct gtgctctacg caggttatcg gtccgtctgc aattgaaacc ttctgtctga 720

acgatgagca acgtgcactg ctgccgcagg gttgcggttg ggcgcgtatc tacggcccgg 780

acggcagcga actggccaag ccgctggctg aagacgcaga gggtattctg tacgcagaaa 840

tcgatctgga acagattctg ctggccaagg ctggcgctga tccggttggt cactacagcc 900

gccctgatgt cctgtccgtg cagttcgacc cgcgtaacca caccccggta caccgcattg 960

gtatcgatgg ccgtctggat gttaacacgc gttcccgtgt agaaaacttt cgcctgcgtc 1020

aggcagcaga acaggaacgt caggccagca aacgtctggg cacgaaactg tttgaacagt 1080

ctctgctggc ggaggagccg gtaccagcca aactcgagat t 1121

<210> 2

<211> 372

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu

35 40 45

Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys

85 90 95

Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr

100 105 110

Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly

145 150 155 160

Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met

165 170 175

Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser

180 185 190

Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Thr Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr

195 200 205

Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser

210 215 220

Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr

245 250 255

Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu

260 265 270

Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys

275 280 285

Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser

290 295 300

Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile

305 310 315 320

Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg

325 330 335

Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly

340 345 350

Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala

355 360 365

Lys Leu Glu Ile

370

Claims

1.一种重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法，其特征在于所述方法为：以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值7.0~9.0缓冲液的反应体系中，在25~40℃、150~200rpm条件下转化反应0.5~2h，反应结束后将反应液后处理，获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述酶源获得方法为：构建含SEQ ID NO：1所示腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腈水解酶的湿菌体。

2.如权利要求1所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6.0~36g/L反应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2.5~6.25g/L反应体系。

3.如权利要求1所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述反应液后处理方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液用无水乙醇搅拌萃取，置于4℃下静置结晶，抽滤，取滤饼在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸。

4.如权利要求1所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述酶源的获得方法为：

（1）重组基因工程菌：将来源于敏捷嗜酸菌（Acidovorax facilis）CCTCCNO.M209044菌株中的基因组DNA为模板，经过PCR扩增得到SEQ ID NO：1所示腈水解酶基因，然后构建含腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌；

（2）酶源：将步骤（1）重组工程菌接种至含50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积比3%的接种量接种到新鲜的含50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6~0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，37℃诱导培养8h，获得诱导培养液，然后将诱导培养液在4℃、10000rpm离心10min，弃去上清收集湿菌体，获得所述酶源。

5.如权利要求4所述的重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述方法为：以含腈水解酶的重组工程菌诱导培养获得的湿菌体为酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物，于pH值8.0Tris-HCl缓冲液的反应体系中，在30℃、150rpm条件下转化反应0.5h，反应结束后，将反应液离心，弃沉淀，取上清液加入无水乙醇搅拌萃取，于4℃下静置结晶，抽滤，取滤饼在真空干燥箱中干燥，即获得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始质量终浓度为6.0g/L应体系，所述湿菌体的加入量以菌体干重计为2.5g/L反应体系。