CN104212784A - 重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用 - Google Patents

重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种源自于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122的重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌，以及在制备1-氰基环己基乙酸中的应用；本发明提供一种水解1-氰基环己基乙腈的腈水解酶及其突变体，该酶及其突变体在催化上述反应时具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好；解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。

Description

重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用，以及表达腈水解酶的重组大肠杆菌生物催化1-氰基环己基乙腈制备加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸的方法。
(二)背景技术
加巴喷丁化学名为1-氨甲基-1-环己烷乙酸。由美国Warner-Lambert公司开发，于1993年5月首先在英国上市，1994年获得FDA批准在美国上市，后来陆续在全世界众多国家被用于癫痫病治疗，1996年，Warner-Lambert公司开始扩大加巴喷丁适应症的研究，2002年，FDA批准将其用于治疗神经病理性疼痛药。加巴喷丁除可单独用于治疗一般癫痛病外，还被作为难治性癫痫病的叠加治疗药，它具有耐受性良好，副作用轻微的优点，是人们期待的推动世界癫痫药物市场发展的药物之一。目前，加巴喷丁的专利已经到期，世界各国纷纷开展对于该产品的研究，原料药需求巨大，市场前景广阔。
目前，加巴喷丁主要通过化学法合成，合成路线较多，主要列举以下3种：
(1)以环己酮为原料，经过环合、水解制得1,1-环己基-二乙酸，然后通过缩合、氨解得到1,1-环己基-二乙酸单酰胺，经过Hofmann降解反应，产物通过萃取、离子交换层析、重结晶得到加巴喷丁纯品(WO2003002504A，2003；WO2003002517A，2003；US2004063997Al，2004)。
(2)以环已酮为原料，与乙腈经过Knoevenagel反应得烯腈，与硝基甲烷经Michael加成反应得到1-硝甲基-环己基乙腈。随后经过Pd-C催化氢化还原、水解、RaneyNi催化氢化还原得到2-氮杂-螺[4,5]-3-癸酮，其水解得到加巴喷丁盐酸盐，精制得加巴喷丁纯品(US2003009055A，2003)。
(3)由环己酮合成的1-氰基环己基乙腈为原料，在甲苯、醇溶液中，通入干燥HCl加压反应，并去除过量的HCl和溶剂，调pH，水洗，蒸除溶剂得到1-氰基环己基乙酸乙酯。1-氰基环己基乙酸乙酯在碱性条件下加热反应，以RaneyNi为催化剂进行催化加氢，冰乙酸调pH至中性，析出加巴喷丁粗品，经甲醇、水、异丙醇重结晶得加巴喷丁精品。(EP4l4262A，1991)，此方法虽然可以跳过加巴喷丁盐酸盐，省去了复杂的加巴喷丁提纯工艺，但是化学法腈水解(醇解)，反应中需要使用大量(例如：10倍量的苄醇/乙醇)的相对较贵的原料，反应条件苛刻，产生的废气须大量碱液吸收，步骤较多，收率较低。
腈水解酶能够实现有机腈化合物的一步水解合成对应的有机羧酸。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且具有比较高的区域选择性和立体选择性。近年来，利用腈水解酶进行氰基水解合成有机羧酸已经成为研究的热点，大量文献、专利报道了腈水解酶在有机羧酸合成中的应用。更重要的是，许多对于双腈具有区域选择性催化活力的腈水解酶的发现，对于阿托伐他汀侧链关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸(Junhua Tao,Org.Process.Res.Dev.2006,10,661-665)、普瑞巴林手性中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸(Zhiyi Xie,J.Mol.Catal.B-Enzym.2006,41,75-80)、加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸(US2005009157 A1)、L-甲基多巴等关键药物中间体酶法合成工艺的建立具有巨大的指导作用。因此，获得对1-氰基环己基乙腈具有高水解活性和区域选择性的腈水解酶，有利于实现加巴喷丁的大规模工业化生产。
1-氰基环己基乙酸是非常重要的医药中间体，是新一代抗癫痫来药物加巴喷丁的合成前体。区域选择性腈水解酶催化生产1-氰基环己基乙酸不仅相比传统的化学法缩短了步骤，而且绿色、高效。筛选新型生物催化剂，开发高效加巴喷丁关键中间体酶法合成工艺，建立绿色经济的加巴喷丁合成新工艺具有重要意义。Zhu等人(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)报道了来自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的腈水解酶bll6402，发现此腈水解酶可以催化各种双腈，对部分双腈具有较高的区域选择性，然而，由于较低的催化活性和底物耐受性抑制了1-氰基环己基乙酸的工业化生产。
(三)发明内容
本发明目的是解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。
为解决上述技术问题，本发明筛选、提供一种水解1-氰基环己基乙腈的腈水解酶及其突变体，该酶及其突变体在催化上述反应时具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。
本发明采用的技术方案是：
本发明涉及一种重组腈水解酶(简称为AcN1)，所述重组腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还提供一种编码所述重组腈水解酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还提供一种由所述重组腈水解酶编码基因构建的重组载体。
本发明提供一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明所述重组腈水解酶编码基因在构建能够催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的重组腈水解酶中的应用，所述的应用为：构建含有重组腈水解酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含重组腈水解酶的菌体细胞。
本发明涉及一种所述重组腈水解酶在制备1-氰基环己基乙酸中的应用，所述的应用为：将含有重组腈水解酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体或湿菌体破碎分离纯化后的酶作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0(优选7.0～8.0)的100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，在25～70℃(优选35～45℃)转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。
所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，优选0.05～1mol/L，最优选1mol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L，优选50～100g/L，最优选100g/L，所述酶的质量终浓度为20～40mg/L，优选20～30mg/L，最优选20mg/L。
本发明所述重组腈水解酶催化剂的制备方法为：(1)斜面培养：将含有重组腈水解酶编码基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，在28～37℃培养12～24小时，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至含终浓度50mg/L卡钠霉素(Kan)的Lysogeny-Broth(LB)液体培养基中，37℃培养10-12小时，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7.0；
(3)发酵培养：以体积浓度2％的接种量将种子液接种至含有终浓度50mg/L的Kan的LB液体培养基进行发酵培养，37℃培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃诱导培养10小时，4℃、5000rpm离心10min，收集湿菌体。
(4)分离纯化：将收集的湿菌体进行超声波破碎(400W，15min)，取破碎后的上清液上nickel-NTA柱，上柱之前先用缓冲液(终浓度300mM NaCl，溶剂为20mMNaH2PO4(pH8.0))进行平衡；接着用洗脱缓冲液(终浓度300mM NaCl、终浓度50mM imidazole，溶剂为20mM NaH2PO4(pH8.0))洗脱不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脱液(终浓度300mM NaCl和终浓度500mM imidazole，溶剂为20mMNaH2PO4(pH8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脱液洗脱产生的流出液，获得重组腈水解酶，即获得重组腈水解酶AcN1。
此外，本发明还提供一种所述重组腈水解酶的突变体，所述突变体是将重组腈水解酶编码基因168位的F(Phe)突变为V(Val)，并且在蛋白质C端加入组氨酸标签，获得重组腈水解酶的突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)。
本发明提供一种由所述突变体构建的重组载体。
本发明提供一种由所述含突变体重组载体转化的重组基因工程菌。
本发明还提供一种所述重组腈水解酶突变体在制备1-氰基环己基乙酸中的应用，所述的应用为：将含有重组腈水解酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体或湿菌体破碎分离纯化后的酶作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，在25～70℃(优选35～45℃)转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，优选1mol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L，优选100g/L，所述酶的质量终浓度为20～40mg/L，优选20mg/L。
本发明所述重组腈水解酶突变体催化剂的制备同重组腈水解酶催化剂。
生物催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸的过程如下：
本发明所述1-氰基环己基乙酸分离纯化的方法通常为：转化结束后，转化液内加入7～8mL 10.5M的NaOH溶液(使产物较好溶解，提高回收率)，调pH至8.5-9.0，离心(9000rpm，10min)，取上清液。往上清液中按体积比1:1比例加入乙醇水溶液(含水量5％体积浓度)(去除菌体破碎产生的核酸，蛋白质等)，抽滤。取滤液，减压蒸馏(温度控制在50℃以下)。馏出酒精后的剩余液体内加入5‰的HC-767针剂用活性炭吸附杂质，抽滤。滤液内加盐酸调pH至2.5左右，静置，抽滤，将漏斗内含有单酸的滤液回收烘干(35℃以下)，即获得产物1-氰基环己基乙酸。
本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列和SEQID NO.2、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
能够提供本发明所述重组腈水解酶及其编码基因的菌株为敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209044，已在先前申请的专利CN101629192B中披露。
本发明对野生菌株Acidovorax facilis ZJB09122的目的基因进行克隆表达，同时对目的基因进行定点突变，对突变前后的腈水解酶进行性质表征；以1-氰基环己基乙腈为底物，应用突变后的菌株为催化剂生产1-氰基环己基乙酸，同时对产物进行分离纯化，进行四大图谱鉴定，最终，将此菌株应用于工业化生产。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种水解1-氰基环己基乙腈的腈水解酶及其突变体，该酶及其突变体在催化上述反应时具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好；解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。
(四)附图说明
图1pET28b-AcN1重组质粒物理图谱；
图2为核酸凝胶电泳图，A为AcN1腈水解酶基因克隆扩增片段；Maker(bp)：2000,1000,750,500,250,100；条带1：AcN1；B为以AcN1为原始菌株的定点突变PCR产物核酸电泳图，Maker(bp)：10000、6000、4000、2000、1000、500；条带1:AcN1；条带2:AcN2；
图3阳性重组质粒pET28b-AcN1的菌落形态照片；
图4腈水解酶SDS-PAGE图，Maker(kDa):97.4、66.2、43.0、31.0、20.0、14.4；条带1和2:E.coil BL21(DE3)和未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1；条带3:诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1；条带4和5:纯化后的AcN1和AcN2；
图5产物1-氰基环己基乙酸的质谱分析图谱，A为标准品，B为样品；
图6产物1-氰基环己基乙酸的红外分析图谱，A为标准品，B为样品；
图7产物1-氰基环己基乙酸的13C谱图谱，A为标准品，B为样品；
图8产物1-氰基环己基乙酸的1H谱图谱，A为标准品，B为样品；
图9 AcN1和AcN2腈水解酶的最适温度分析；
图10 AcN1(实心)和AcN2(空心)腈水解酶的最适pH分析；
图11AcN1(A)和AcN2(B)腈水解酶的动力学分析；
图12 AcN2细胞催化的反应进程曲线；
图13纯化产物1-氰基环己基乙酸的晶体图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122菌种细胞在液氮之中保存，用基因组提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit soil)来提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在上游引物1AcN1(F)5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，下游引物2AcN1(R)5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’的作用下进行PCR扩增。
PCR反应体系各组分加入量(50μL)：10*Pfu DNA Polymerase Buffer(Takara)10μL，2.5mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为25μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA1μL，5U/μL Pfu DNA Polymerase(Takara)1μL，无核酸水40μL。
采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性95℃5min，然后进入温度循环94℃ 50s，55℃ 1.5min，72℃ 2min，共35个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
取5μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用TaqDNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4 DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-AcN1。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，利用软件分析测序结果，结果发现：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为1116bp(该核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框(氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，简称为AcN1)。
实施例2
根据实施例1分析结果设计表达引物(上游引物3AcN1(F)5’-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，下游引物4 AcN1(R)5’-AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3’)，并分别在引物3和引物4中引入了Nco I和Xho I限制性酶切位点。在引物3和引物4的引发下，利用高保真PyrrobestDNA聚合酶进行扩增，获得长为1116bp的腈水解酶基因片段(该核苷酸序列如SEQID NO：2所示)，测序后利用Nco I和Xho I限制性酶对扩增片段进行双酶切处理，并利用T4连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pET28b进行连接，构建表达载体pET28b(+)-AcN1。将构建的表达载体pET28b(+)-AcN1转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含终浓度50mg/L的卡钠霉素(Kan)LB固体培养基平板，阳性克隆见图3所示。所述LB固体培养基平板组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0，37℃下培养过夜(见图1和图2A)。经过核酸电泳、SDS-PAGE以及上海生工生物工程有限公司测序分析，获得含有SEQ ID NO：2所示基因的重组工程菌。
酶切体系组成：表达载体酶切体系组成(Total 40μL)：表达载体20μL，10*TangoBuffer 8μL，Nco I 1.5μL，Xho I 1.5μL，ddH2O 9μL；克隆载体酶切体系组成(Total 50μL)：目的基因20μL，10*TangoBuffer 10μL，Nco I 2μL，Xho I 2μL，ddH2O16μL。酶切结束后65℃灭活15min，然后表达载体用AxygenDNA凝胶回收试剂盒进行回收，而目的基因用AxygenPCR清洁试剂盒作进一步的纯化。
连接体系组成(Total 20μL)：表达载体pET28b 5μL，目的基因12μL，10*LigationBuffer 2μL，T4DNA Ligase 1μL。
实施例3
将实施例2验证后的含有表达载体pET28b(+)-AcN1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-AcN1进行定点突变F168V(将168位的F突变为V，并且通过常规的基因工程操作在蛋白质C端加入组氨酸标签，得到的该腈水解酶的突变体)，从而获得了经过定点突变后的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，该突变基因编码的腈水解酶简称为AcN2，氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示)。
根据定点突变，以SEQ ID NO：4为模板，设计上游引物5 F168V(F)5’-GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3’和下游引物6 F168V(R)5’-CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3’，以SEQ ID NO：4为模板进行PCR扩增(PCR反应参数为：94℃ 4min；98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 6min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。)。将扩增后回收的PCR产物(见图2中B)用DpnI酶切3h，应用纯化试剂盒将酶切产物纯化后转化至E.coli JM109受体菌，涂布于含终浓度50mg/L KAN的LB固体平板上，37℃培养过夜后，平板上长出许多白色菌落。随机挑取白色克隆提取质粒进行测序。测序后对定点突变后的阳性菌落进行纯培养，提取质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，获得含有突变基因(该核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示)的大肠杆菌BL21(DE3)。LB固体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0。
实施例4
(1)诱导培养：将实施例2验证后的含有表达载体pET28b(+)-AcN1的大肠杆菌BL21(DE3)，接种至含终浓度50mg/L卡钠霉素(Kan)的Lysogeny-Broth(LB)液体培养基中，37℃培养10-12小时，随即以体积浓度2％的接种量接种至含有终浓度50mg/L Kan的LB液体培养基进行扩大培养，37℃培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃诱导培养10小时，4℃、5000rpm离心10min，收集经过诱导后的湿菌体(即催化剂)，进行SDS-PAGE检测，以空载体E.coil BL21(DE3)和未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1作为对照(图4)。
(2)分离纯化：同时，进行Ni柱分离纯化，纯化步骤如下：将收集的湿菌体1g进行超声波破碎(400W，15min)，取10mL的破碎上清液作为粗酶液上nickel-NTA柱，上柱之前先用缓冲液(终浓度300mM NaCl，溶剂为20mM NaH2PO4(pH8.0))进行平衡；接着用洗脱缓冲液(终浓度300mM NaCl、终浓度50mM imidazole，溶剂为20mM NaH2PO4(pH8.0))洗脱不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脱液(终浓度300mM NaCl和终浓度500mM imidazole，溶剂为20mM NaH2PO4(pH8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脱液洗脱产生的流出液，获得重组腈水解酶AcN1纯酶液，浓度为1.0mg/mL，将纯酶液稀释10倍后，用SDS-PAGE来验证蛋白的表达情况(见图4)。
LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7.0。
(3)同样条件下，将实施例3验证后的含有定点突变后的表达载体pET28b(+)-AcN2重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-AcN2进行诱导培养，分离纯化，获得重组腈水解酶AcN2纯酶液，浓度为1.0mg/mL，用SDS-PAGE来验证蛋白的表达情况(见图4)。
实施例5
为验证E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1和E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN2表达的蛋白是否具有活性，将实施例4经IPTG诱导后所得到的定点突变前后的重组大肠杆菌全细胞进行催化反应，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)和未诱导的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1作为对照组，催化反应体系为：以200mM1-氰基环己基乙腈为底物，分别以实施例4制备的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN2为催化剂，以pH值为7.0的100mM的磷酸盐为反应介质构成转化体系，转化体系中湿菌体的加入量为10g/L，在45℃进行转化反应10min，反应结束后，取500μL样品，用反应用的缓冲液将其稀释两倍，用10μL 6M HCl以终止反应，4℃、5000rpm离心10min取上清进行高效液相色谱分析。酶活定义为：酶活(U)定义为：在45℃，1min催化产生1μmol1-氰基环己基乙酸所需的湿菌体量(酶量)为一个活力单位，比酶活(U/g或U/mg protien)定义为：1g湿菌体或是1mg纯酶含有的酶活单位。
高效液相分析检测方法：应用C18柱，缓冲液(0.58gNH4H2PO4、1.83g过氯酸钠、1000mL水，用高氯酸调至pH1.8)：乙腈＝76:24，UV＝215nm；流速＝1.0mL/min，柱温40℃。
从表1可以看出，重组E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN1和突变菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN2已成功构建，并能够表达具有催化活性的腈水解酶，比酶活分别为24U/g和947.52U/g。
表1 腈水解酶酶活比较
实施例6
将实施例4制备的重组腈水解酶AcN1纯酶和重组腈水解酶AcN2纯酶在不同温度25-70℃范围内(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)进行活力检测。反应体系为：底物1-氰基环己基乙腈的浓度为200mM，缓冲体系为pH7.0的100mM磷酸盐缓冲液，纯酶加入量为0.02g/L，在上述十个温度梯度下，各转化反应10min，反应结束后，取500μL样品，用反应用的缓冲液将其稀释两倍，用10μL6M HCl以终止反应，4℃、5000rpm离心10min取上清进行高效液相色谱分析，检测方法在实施例5。以没有加入纯酶的反应体系作为空白对照。实验结果(见图9)表明：未加入纯酶的反应中，没有检测到有产物1-氰基环己基乙酸的生成，有纯酶的催化反应中，AcN2腈水解酶的相对活力是AcN1的39.52倍，相对活力(％)＝(AcN2的峰面积/AcN1的峰面积)*100，最适温度范围均为40～45℃。
实施例7
将实施例4制备的重组腈水解酶AcN1和重组腈水解酶AcN2在不同pH3.0-10.0范围内进行活力检测，反应体系为：底物1-氰基环己基乙腈的浓度为200mM，以不同pH值的缓冲液为反应介质，纯酶加入量为0.02g/L，在45℃转化反应10min，反应结束后，取500μL样品，用反应用的缓冲液将其稀释两倍，用10μL 6M HCl以终止反应，4℃、5000rpm离心10min取上清进行高效液相色谱分析，检测方法在实施例5。
缓冲体系为：柠檬酸-柠檬酸钠(3.0，4.0，5.0，6.0)，磷酸二氢钾-磷酸氢二钾(6.0，6.5,7.0,7.5，8.0)，Tris-HCl(7.0，7.5，8.0，8.5)和甘氨酸-氢氧化钠(8.5，9.0，9.5，10.0)。以没有加入纯酶的反应体系作为空白对照。实验结果(见图10)表明：未加入纯酶的反应中，没有检测到有产物1-氰基环己基乙酸的生成，有纯酶的催化反应中，AcN2腈水解酶的相对活力是AcN1的39.47倍，最适pH值均为8.0。
实施例8
将实施例4制备的重组腈水解酶AcN1纯酶和重组腈水解酶AcN2纯酶在45℃温浴2min，获得预处理的酶液。反应体系为：底物1-氰基环己基乙腈的浓度为20-400mM(20mM，40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，140mM，160mM，180mM，200mM，250mM，300mM，350mM，400mM)，以pH7.0、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质，纯酶加入量为0.02g/L，在45℃、150rpm水浴转化反应，每2分钟取样500μL，同时向样品中加入500μL 2M HCl水溶液终止反应制成样品混合液，20μL样品混合液进行高效液相色谱分析，检测方法在实施例5。以未加入纯酶的反应体系作为空白对照。
起始速率用米氏方程Vo＝Vmax[S]/([S]+Km)来拟合，其中，Vo表示初速度，Vmax表示最大反应速率，[S]表示底物浓度，Km表示米氏常数，通过Origin 8.0软件进行作图，通过倒数曲线计算出动力学常数Vmax，Km和kcat，其中Vmax＝kcat[E0]，kcat表示催化常数，又称酶的转化数，[E0]表示酶的摩尔浓度。实验结果(见图11)表明：未加入纯酶的反应中，没有检测到有产物1-氰基环己基乙酸的生成，有纯酶的催化反应中，AcN1的kcat，Km和Vmax分别为3.39s-1，37.83mM和4.73μmol/mg/min；AcN2的kcat，Km和Vmax分别为170.64s-1，19.98mM和238.10μmol/mg/min。与原始腈水解酶AcN1相比，AcN2的Vmax提高了50.34倍，Km减少了1.89倍。
实施例9
1-氰基环己基乙腈(200mM)，AcN1与AcN2重组腈水解酶纯酶加入量均为0.02g/L，含有终浓度为5mM金属离子的pH7.0 100mM磷酸盐缓冲液作为反应介质。在45℃条件下，反应10min，反应结束后，取500μL样品，用反应用的缓冲液将其稀释两倍，用10μL 6M HCl以终止反应，4℃、5000rpm离心10min取上清进行高效液相色谱分析，检测方法在实施例5，即AcN1和AcN2腈水解酶纯酶的活力在5mM金属离子和EDTA中检测，在没有金属离子和EDTA条件下的反应作为空白对照，其酶的活力作为100％。实验结果(见表2)表明：腈水解酶对巯基耦合的金属离子极度敏感，比如：Ag+和Hg2+，说明：巯基对腈水解酶的催化是非常必要的。Fe2+和Li+导致腈水解酶活力的下降，这可能是由于金属离子在催化部位中心形成了螯合。Mg2+和Mn2+的加入导致了AcN1和AcN2的轻微的增加，然而，Ni2+和Cu2+显著地影响AcN1和AcN2的催化活力。其他金属离子对酶的活力没有任何消极的影响，然而，EDTA的加入对腈水解酶的活力没有影响，说明此腈水解酶的催化功能不受金属离子的影响。
表2 AcN1和AcN2腈水解酶的金属离子分析
实施例10
将实施例4得到的湿菌体进行生物催化，反应体系200mL，包括湿菌体用量100g/L(以没有加入湿菌体的反应体系作为空白对照)，底物终浓度(氰基环己基乙腈)1M，反应介质为pH7.0 100mM磷酸盐缓冲液，反应时间：0-10h(具体取样点为0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h和10h)，反应温度：40℃，反应结束后，取反应液进行高效液相分析检测，实验结果(见图12)表明：未加入湿菌体的反应中，没有检测到有产物1-氰基环己基乙酸的生成，有湿菌体的催化在反应8h后，产物1-氰基环己基乙酸的得率达90％。
高效液相分析检测方法：应用C18柱，缓冲液(0.58g NH4H2PO4、1.83g过氯酸钠、1000mL水，用高氯酸调至pH1.8)：乙腈＝76:24，UV＝215nm；流速＝1.0mL/min，柱温40℃。
实施例11
在实施例10的基础上，转化结束后，转化液内加入7～8mL 10.5M的NaOH溶液(使产物较好溶解，提高回收率)，调pH至8.5-9.0，离心(9000rpm，10min)，取上清液体。往上清液中按体积比1:1比例加入乙醇水溶液(含水量5％体积浓度)(去除菌体破碎产生的核酸，蛋白质等)，抽滤。取滤液，减压蒸馏(温度控制在50℃以下)。馏出酒精后的剩余液体内加入5‰的HC-767针剂用活性炭吸附杂质，抽滤。滤液内加盐酸调pH至2.5左右，静置，抽滤，将漏斗内含有单酸的滤液回收烘干(35℃以下)，即获得产物1-氰基环己基乙酸。
上述过程中离心均采用9000rpm，10min；乙醇水溶液与转化液比例为1:1；加酸调pH时调节至2.5左右；减压蒸馏温度控制在50℃以下(见图13)。
1-氰基环己基乙酸的分子量通过高效液相-飞行时间质谱仪来检测，实验参数如下：电离模式：-ESI；干燥气体温度：300℃；裂解电压：80V；干燥气体流速：3.5L/min；Skimmer：65V；雾化气压力：20psig；OCTIRFV pp：250V；Vcap：3000V。实验结果显示(见图5)：图中166.1m/z的分子峰与1-氰基环己基乙酸的分子量一致。
1-氰基环己基乙酸的红外分析通过傅里叶变换红外光谱分析仪进行检测，在4000-400cm-1区域范围内应用红外微系统KBr压片进行分析。实验结果显示(见图6)：在1702cm-1处的峰表示C＝O的伸缩振动，3937cm-1处的峰表示C≡N的伸缩振动，2860cm-1处的峰表示羧基上的O-H的伸缩峰，这与1-氰基环己基乙酸标准样品的红外图谱相一致。
1-氰基环己基乙酸的13C核磁图谱分析，用二甲基亚砜作为助溶剂，用500MHz来检测碳原子。实验结果显示(见图7)：170ppm和122ppm的信号峰分别表示羧基上的C原子和氰基上的C原子，22ppm和39ppm表示环己烷上的C原子，这与1-氰基环己基乙酸标准样品的13C核磁图谱相一致。
1-氰基环己基乙酸的1H核磁图谱分析，用二甲基亚砜作为助溶剂，用125MHz来检测氢原子。实验结果显示(见图8)：四种不同的H原子化学位移与1-氰基环己基乙酸上的H原子相吻合，化学位移δ＝12.5350ppm指代羧基上的H原子，这与1-氰基环己基乙酸标准样品的1H核磁图谱相一致。
因此，根据综合实验结果可以表明分离的产品就是1-氰基环己基乙酸。

Claims (10)

1.一种重组腈水解酶，其特征在于所述重组腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述重组腈水解酶的基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。
4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述重组腈水解酶在制备1-氰基环己基乙酸中的应用，其特征在于所述的应用为：将含有重组腈水解酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体或湿菌体分离纯化后的酶作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的100mM磷酸盐的缓冲液为反应介质，在25～70℃转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L，所述酶的质量终浓度为20～40mg/L。
7.一种权利要求1所述重组腈水解酶的突变体，其特征在于所述突变体是将重组腈水解酶编码基因168位的F突变为V，并且在蛋白质C端加入组氨酸标签，获得重组腈水解酶的突变体。
8.一种由权利要求7所述突变体构建的重组载体。
9.一种由权利要求8所述重组载体转化的重组基因工程菌。
10.一种权利要求7所述重组腈水解酶突变体在制备1-氰基环己基乙酸中的应用，其特征在于所述的应用为：将含有重组腈水解酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体或湿菌体分离纯化后的酶作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，在25～70℃转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述底物初始浓度为0.02～1mol/L，所述湿菌体的质量终浓度为10～100g/L，所述酶的质量终浓度为20～40mg/L。
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