CN111471668A - 一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用 - Google Patents

一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在制备1‑氰基环己基乙酸中的应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位，第205位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。本发明经过半理性设计，对蛋白质进行分子改造，腈水解酶双突变体AcN‑G180D/A205C的比酶活最高提高了1.6倍，转化率>99％，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(50℃)水解1‑氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的四分之一。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。

Description

一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M 209044腈水解酶的突变体及其在制备抗癫痫药物加巴喷丁中的应用。
(二)背景技术
加巴喷丁是美国Warner-Lamber公司首先开发的抗癫痫药，于1993年首次在英国上市。加巴喷丁能防止由部分化学品(如印防己毒素、荷包牡丹碱、士的宁)和非化学品刺激(如音源、电击休克)诱发的惊厥，对部分性癫痫发作和继发全身性强直阵挛性癫痫发作有效果。与目前使用的同类产品相比，具有口服吸收快，耐受性好，毒副作用小，治疗效果好，在体内不代谢，不与血浆蛋白结合，不诱导肝酶，能够穿过人体大脑的血脑屏障，与其他抗癫痫病药物相互作用的可能性很低，作为难治性癫痫病的叠加用药作用尤为突出。
1-氰基环己基乙酸(1-Cyanocyclohexaneacetic acid)是合成新一代抗癫痫药物加巴喷丁的关键中间体，市场前景非常广阔。目前，用于合成加巴喷丁及其关键中间体1-氰基环己基乙酸采用化学合成技术，生产过程中存在环境污染严重，对设备腐蚀严重，危险性大等问题。
腈水解酶(Nitrilace EC 3.5.5.1)作为一种重要的工业酶，能够直接将腈化物转化为相应的羧酸和氨。腈水解酶催化腈的水解反应，避免了化学合成过程中所需要的高温或强酸强碱等条件，极大减少了副产物和废物的产生，体现出高选择性、高效率以及环境经济性，符合绿色化学的要求。目前腈水解酶应用于合成医药中间体的例子很多，瑞士Lonza公司最早采用腈水解酶催化生产烟酸，还利用腈水解酶和烟酰胺脱氢酶共同作用，将底物2-氰基吡啶与2-氰基吡嗪分别降解为药物中间体5-羟基吡啶-2- 甲酸与5-羟基吡嗪-2-甲酸，反应选择性强，转化率接近100％，相比传统化学法有极大的优势。上海市农药研究所与浙江钱江生物化学股份有限公司合作构建了一株腈水解酶高活性基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNY Nitd能够催化羟基乙腈转化为乙醇酸，野生菌株转化72h乙醇酸浓度达到11.6％,而采用基因工程菌进行转化,20h乙醇酸浓度即可达到36％,催化效率显著提升。Banerjee等将恶臭假单胞菌(P.putida) MTCC 5110腈水解酶基因在大肠杆菌中进行了重组表达,并对产酶条件进行了系统优化,重组酶对扁桃腈表现出较高的腈水解酶活力,最终转化结果表明(R)-扁桃酸的收率及ee值分别达到87％和99.99％。Chauhan等扩增获得一株敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W的腈水解酶编码基因,并在大肠杆菌中进行了过量表达,重组酶对脂肪族二腈具有较强的立体选择性,能将2-甲基戊二腈转化为4-氰基戊酸,底物转化率达到 100％,产物中无酰胺化合物生成,2-甲基戊二酸是唯一的副产物且含量低于2％。此外，许多腈水解酶已经被开发并用于多种药物中间体和精细化学品的合成。
通过分子改造，可以提高腈水解酶对底物的催化活性，目前关于通过分子改造来提高腈水解酶活性的研究很多。龚劲松等人利用定点饱和突变的方法对来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida CGMCC3830)的腈水解酶进行突变，筛选出N4OG、 F50W、Q207E三种对3-氰基砒啶催化活性提高的突变体，在此基础上还构建了双突变体F50W/Q207E和三突变体N40G/F50W/Q207E，催化活性是野生型的两倍。柳志强等人利用定点饱和突变的方法对来源于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis nitrilase)的腈水解酶进行突变，筛选出最佳突变体F168V/T201N/S192F/M191T/F192S，与野生型腈水解酶相比，最佳突变体F168V/T201N/S192F/M191T/F192S对底物亚氨基二乙腈的催化活性提高了136％。
从敏捷食酸菌(A.facilis CCTCC NO:M 029044)中克隆的腈水解酶已经在大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))中过量表达，其能够催化1-氰基环己基乙腈生成加巴喷丁合成中间体1-氰基环己基乙酸(Catalysis Communications,2015,66,121-125)。现有的生物催化剂在工业应用过程中主要以固定化细胞和固定化酶的形式存在，固定化细胞和固定化酶对出发的腈水解酶细胞和腈水解酶蛋白的活性要求较高，以弥补固定化产生的酶活损失。现有的腈水解酶还需要进一步的改造，提高催化效率，使其具有更高的工业应用价值。
(三)发明内容
本发明基于来源于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M 029044腈水解酶具有亚基自组装的现象，并且该现象与酶活有关，本发明提供了一种酶活提高的腈水解酶突变体蛋白，包括该突变体蛋白的编码基因，含有该基因的重组载体，以及重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在催化合成加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位，第205位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。
进一步，优选所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为天冬氨酸(G180D)，编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为苯丙氨酸(G180F)，编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第205位丙氨酸突变为半胱氨酸(A205C)，编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，氨基酸序列为SEQ ID No.8所示；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为天冬氨酸，同时将第205位丙氨酸突变为半胱氨酸(G180D/A205C)，编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，氨基酸序列为SEQ ID No.10所示。
本发明又提供了一种一种所述腈水解酶突变体的编码基因、由所述编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。所述的载体包括但不限于原核表达载体pET28b、真核表达载体(pPIC9K、pPICZα、pYD1和 pYES2/GS)、克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。所述的宿主细胞包括但不限于本领域的各种常规宿主细胞，本发明优选大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)。
本发明又提供了一种所述腈水解酶突变体在催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸中的应用，具体所述的应用以含腈水解酶突变体的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体，湿菌体固定化细胞或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以1- 氰基环己基乙腈为底物，以pH为4.0-10.5、200M磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-60℃、600rpm恒温水浴条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。所述底物加入终浓度以反应体系体积计为5-1000mM，优选 200mM，所述纯酶加入量以反应体系体积计为0.1-3mg/mL，比酶活为160～170U/g(细胞湿重)；所述催化剂为湿菌体或固定化细胞时，用量以湿菌体重量计为10-100g/L 缓冲液，优选50g/L。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中，37℃培养10-12小时，按体积浓度1％的接种量接种至含终浓度 50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃培养至培养液OD600为0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导培养10小时，离心，收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体。
进一步，所述纯酶按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因工程菌湿菌体用含pH 7.0、100mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬，超声波破碎(400W，20min， 1s破碎1s暂停)，破碎产物离心(8000rpm，15min)后取上清液作为粗酶液；将粗酶液以1mL/min的流速通过经结合缓冲液冲洗的Ni-NTA柱，用平衡缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min；再用洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，流速为2mL/min；最后将收集的目的蛋白以浓度为20mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为透析液进行透析(透析袋截留分子量为30KDa)，取截留液即为纯酶液；所述结合缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液，所述平衡缓冲液为含终浓度 300mM NaCl和50mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液，所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和500mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液。
本发明所述催化剂可以是含有所述腈水解酶突变体基因的重组表达转化体(即湿菌体，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3))，也可以是未纯化的粗酶液，或是经过纯化后的纯酶，如果需要可以对其进行固定化后进行使用。
本发明所述LB液体培养基终浓度组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值自然。LB固体培养基终浓度组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L氯化钠，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明经过半理性设计，对蛋白质进行分子改造，腈水解酶双突变体AcN-G180D/A205C的比酶活最高提高了1.6 倍，转化率>99％，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(50℃)水解1-氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的四分之一。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。
(四)附图说明
图1为不同突变体酶活柱形图。
图2腈水解酶E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN及其突变转化子E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180F，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-A205C以及双突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C的SDS-PAGE图，泳道1为AcN粗酶液，泳道2为G180D/A205C粗酶液，泳道3为AcN纯酶液，泳道4为G180D/A205C纯酶液，泳道5为G180D粗酶液，泳道6为G180F粗酶液，泳道7为A205C粗酶液，泳道8为G180D纯酶液，泳道9为G180F纯酶液，泳道10为A205C纯酶液。
图3腈水解酶及其突变体的酶活比较曲线图。
图4腈水解酶双突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C的最适温度曲线图。
图5腈水解酶双突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C的最适pH曲线图。
图6腈水解酶AcN-F168V及其双突变体的反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：定点突变及筛选
1、突变位点选择
本发明利用定点突变技术对来源于敏捷食酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 029044的腈水解酶编码基因(GenBank Accession no.:AHW42593.1)进行168位点的定点突变，突变成E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-F168V(参见Zhang X H,et al.Activityimprovement of a regioselective nitrilase from Acidovorax facilis and itsapplication in the production of 1-(cyanocyclohexyl)acetic acid[J].ProcessBiochemistry,2014.)，以此为基础，主要针对的是“A surface”上的氨基酸位点为突变位点，利用全质粒PCR定点突变成功后，将目的基因所在的表达载体转入大肠杆菌宿主，诱导表达后通过酶活检测方法筛选出正突变子，进行酶活的重复检测，确定酶活提高的突变体，从而获得有自组装倾向并能够高效催化双腈化合物区域选择性水解合成单氰基羧酸化合物的突变体蛋白。
2、单突变
以含有克隆于敏捷食酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 029044腈水解酶基因 AcN-F168V(核苷酸序列SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2)的 pET-28b(+)-AcN-F168V质粒为模板，通过全质粒扩增进行定点突变，PCR体系(50μL) 为：模板0.5-20ng，引物G180-f及A205-f(序列见表1)各10-15pmol，5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)，0.2mM dNTP，1.25UPrimeSTAR HS DNAPolymerase。PCR条件:(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火5s；(4)72℃延伸6.5min；步骤(2)-(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，利用DpnⅠ消化后导入E.coli BL21(DE3)，涂布至含有50μg/mL 卡那霉素的LB平板，得到单克隆。经过定点突变，得到两个位点各12种定点突变转化子，对获得的共23种单突变体进行酶活的检测，活力测定方法同实施例4，测定的酶活结果见图1，最终筛选获得酶活提高的突变体转化子E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180F(记为G180F)，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D(记为G180D)，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-A205C(记为A205C)。
表1突变位点的引物设计
Figure RE-GDA0002538831800000061
3、组合突变
以突变体转化子G180D(核苷酸序列SEQ ID No.3)的pET-28b(+)-AcN-G180D质粒为模板，通过全质粒扩增进行定点突变，PCR体系同单突变。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，利用DpnⅠ消化后导入E.coli BL21(DE3)，涂布至含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，得到双突变转化子。即获得组合突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C(记为G180D/A205C)。
实施例2：腈水解酶突变体的表达
构建含敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M 029044腈水解酶 AcN-F168V(即SEQ ID No.1)的质粒pET-28b(+)-AcN-F168V。将构建获得的 pET-28b(+)-AcN-F168V表达质粒导入大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)中实现过表达。采用定点饱和突变方法进行定点突变，并重组至表达载体pET-28b(+)，再将重组质粒转入表达宿主E.Coli BL21(DE3)中，构建突变体。得到实施例1的突变体转化子E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180F，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-A205C和组合突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C，以及原始菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-F168V(参见Zhang X H,et al.Activityimprovement of a regioselective nitrilase from Acidovorax facilis and itsapplication in the production of 1-(cyanocyclohexyl)acetic acid[J].ProcessBiochemistry,2014.)接种到LB培养基中， 37℃培养10-12小时，按体积接种量1％接种至含有卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB 培养基，37℃、150rpm扩大培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃诱导培养10小时，培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到相应的湿菌体，湿菌体进行固定化获得固定化细胞(固定化方法见专利CN107177576A)，湿菌体经过超声破碎后纯化提取为纯酶(纯化过程见实施例3)。
实施例3：腈水解酶及其突变体蛋白的纯化
(1)向实施例2中收集到的湿菌体中加入结合缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0)，重悬菌体后超声波破碎(400W，20min，1s破碎1s暂停)。破碎产物离心(8000rpm，15min)后，取上清液作为粗酶液，准备分离纯化。
(2)预装好10mLNi-NTA亲和层析柱后，使用结合缓冲液(50mM NaH2PO4， 300mMNaCl，pH 8.0)进行冲洗，流速为2mL/min。
(3)清洗8-10个柱体积后将所得到的粗酶液以1mL/min的流速通过Ni-NTA柱，目的蛋白则挂载在层析柱上。上样后大量未吸附的杂蛋白不与树脂结合，将直接被除去。
(4)使用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，50mM咪唑，pH 8.0)洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min。
(5)使用蛋白洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0) 洗脱并收集目的蛋白，流速为2mL/min。
(6)收集的目的蛋白以浓度为20mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为透析液进行透析(截留蛋白分子量为30KDa)，取截留液即为纯化后的蛋白。
(7)通过SDS-PAGE分析纯化后的蛋白，蛋白电泳结果如图2所示。
实施例4腈水解酶活性的测定
对实施例3中纯化后的蛋白进行酶活的测定。腈水解酶活性检测反应体系(10mL):100mM、pH＝7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，200mM 1-氰基环己基乙腈，30mg 纯酶。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应10min。取样500μL上清，加入500μL 2M的HCl终止反应后，利用液相色谱(Agilent)外标法测定转化液1-氰基环己基乙酸转化率。色谱柱为J&KScientific C18-H柱(4.6×250mm,5μm,
Figure RE-GDA0002538831800000081
)，流动相为缓冲液(0.58g/L磷酸氢二铵，1.8375g/L高氯酸钠，高氯酸调节pH为1.8，溶剂为去离子水)：乙腈＝76:24(v:v)，流速为1mL/min，紫外检测波长215nm，柱温40℃。各个突变体的相对酶活结果见图3。
酶活定义(U):在45℃，pH 7.0、100mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液条件下，每分钟催化生成1μmol 1-氰基环己基乙酸所需要的酶量定义为1U。
实施例5：腈水解酶及其突变体的动力学参数测定
对实施例3中纯化后的蛋白进行动力学参数测定，以1-氰基环己基乙腈为底物，分别以AcN-F168V、G180D、A205C、G180F、G180D/A205C的纯酶液为催化剂。
反应体系为10mL：纯酶液(165U/g)用pH 7.0、20mM磷酸盐缓冲液稀释10倍后加入反应容器，使其加入终浓度为0.2mg/mL，分别加入终浓度6.75-40.49mM(6.75、 13.50、20.24、26.99、33.74、40.49mM)底物，用200mM的pH＝7的磷酸缓冲液做为反应介质补足到10mL，45℃、600rpm反应5min，取样500μL，并用500μL 2M的盐酸终止反应，用HPLC(检测分析条件同实施例4)对反应液中1-氰基环己基乙酸的浓度进行检测。
通过Origin对所获得的数据进行非线性拟合得出的腈水解酶E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-F168V和腈水解酶组合突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180F、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-A205C、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-AcN-G180D/A205C 的Km和Kcat的值见表2所示，可以发现双突变体的Kcat与AcN相比有明显的提高，这说明改造后的腈水解酶活性确实提高了，而它们的Km反映出改造后的酶对底物的亲和力有微弱的下降。
表2腈水解酶突变体的动力学参数
Enzyme K<sub>m</sub>[mM] V<sub>max</sub>[mmolmg<sup>-1</sup>min<sup>-1</sup>] K<sub>cat</sub>[s<sup>-1</sup>] K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>[mM<sup>-1</sup>h<sup>-1</sup>]
AcN-F168V 16.25±5.37 1.53±0.19 5573s<sup>-1</sup> 342.95
G180D 3.21±1.41 1.98±0.13 6624s<sup>-1</sup> 2063.55
G180F 5.88±1.58 2.35±0.14 7612s<sup>-1</sup> 1294.56
A205C 3.40±0.78 1.63±0.059 8317s<sup>-1</sup> 2446.18
G180D/A205C 19.65±7.40 4.78±0.73 24139s<sup>-1</sup> 1228.45
实施例6：腈水解酶及其突变体最适温度的测定
对实施例3中纯化后的蛋白进行最适温度的测定，以1-氰基环己基乙腈为底物，以腈水解酶AcN-F168V(比酶活为104U/g细胞湿重)或腈水解酶组合突变体 G180D/A205C的纯酶液(比酶活为165U/g细胞湿重)为催化剂。
反应体系为10mL：收集的纯酶液(165U/g)用pH 7.0、20mM磷酸盐缓冲液稀释10倍后加入反应容器，使其加入终浓度为0.2mg/mL，再加入终浓度200mM底物，用100mM的pH＝7的磷酸缓冲液做为反应介质补足到10mL，温度为20-60℃(20、 25、30、35、40、45、50、55、60℃)、600rpm反应10min，取样500μL，并用500μL 2M的盐酸终止反应，用HPLC对反应液中1-氰基环己基乙酸的浓度进行检测，双突变体的最适温度为50℃，结果见图4所示。同样条件下检测腈水解酶AcN-F168V最适温度为45℃。
实施例7：腈水解酶及其突变体最适pH的测定
对实施例3中纯化后的蛋白进行最适温度的测定，以1-氰基环己基乙腈为底物，以腈水解酶AcN-F168V(比酶活为104U/g细胞湿重)或腈水解酶组合突变体 G180D/A205C(比酶活为165U/g细胞湿重)的纯酶液为催化剂。
反应体系为10mL：收集G180D/A205C的纯酶液(165U/g)用pH 7.0、20mM磷酸盐缓冲液稀释10倍加入反应容器中，使其加入终浓度为0.2mg/mL，加入终浓度 200mM底物，分别用100mM的pH＝(4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、 9.5、10、10.5)的磷酸缓冲液做为反应介质补足到10mL，45℃、600rpm反应10min，取样500μL，并用500μL 2M的盐酸终止反应，用HPLC对反应液中1-氰基环己基乙酸的浓度进行检测，双突变体的最适pH为8.5，结果见图5所示。同样条件下检测 AcN-F168V最适pH为7。
实施例8：腈水解酶及其突变体转化200mM氰基环己基乙腈
对实施例3中纯化后的腈水解酶及其突变体蛋白进行反应进程的测定，以1-氰基环己基乙腈为底物，以腈水解酶AcN-F168V(比酶活为104U/g细胞湿重)或腈水解酶组合突变体G180D/A205C的纯酶液(比酶活为165U/g细胞湿重)为催化剂。
反应体系为10mL：收集的纯酶液用pH 7.0、20mM磷酸盐缓冲液稀释10倍后加入反应容器，使其加入终浓度为0.2mg/mL，再加入终浓度200mM底物，用100mM 的pH＝7的磷酸缓冲液做为反应介质补足到10mL，600rpm、45℃恒温水浴反应，于不同时间取样500μL，并用500μL 2M的盐酸终止反应，12000rpm离心，弃去沉淀。用HPLC对反应液中1-氰基环己基乙酸的浓度进行检测，腈水解酶AcN-F168V及其双突变体的反应进程结果见图6所示,转化率大于99％。经测定，如图6所述，双突变体G180D/A205C可在60min内将底物反应完全，反应时间较腈水解酶AcN-F168V 相比有所缩短。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
<400> 1
atggtatctt acaactccaa atttctggct gctaccgtac aggctgaacc ggtttggctg 60
gacgcggacg caactatcga taaatctatt ggtatcatcg aggaggcggc ccagaaaggt 120
gcgtctctga ttgccttccc ggaagttttc atccctggtt acccgtattg ggcctggctg 180
ggtgacgtaa agtactccct gtccttcacc tcccgttacc acgaaaactc cctggaactg 240
ggtgacgacc gtatgcgccg tctgcaactg gctgcgcgtc gtaacaaaat cgcgctggtt 300
atgggttaca gcgagcgtga ggcaggcagc cgctacctgt cccaggtctt tatcgacgaa 360
cgtggtgaaa tcgttgctaa ccgtcgtaaa ctgaaaccaa ctcacgttga acgtacgatt 420
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ggtctgaact gctgggagca cgttcagccg ctgtccaaat tcatgatgta ctccctgggt 540
gaacaggtac acgtcgcttc ttggccggct atgtccccgc tgcaaccgga cgtgtttcaa 600
acctccatcg aggctaatgc gaccgtaacc cgctcctatg ctattgaagg ccaaaccttc 660
gttctgtgct ctacgcaggt tatcggtccg tctgcaattg aaaccttctg tctgaacgat 720
gagcaacgtg cactgctgcc gcagggttgc ggttgggcgc gtatctacgg cccggacggc 780
agcgaactgg ccaagccgct ggctgaagac gcagagggta ttctgtacgc agaaatcgat 840
ctggaacaga ttctgctggc caaggctggc gctgatccgg ttggtcacta cagccgccct 900
gatgtcctgt ccgtgcagtt cgacccgcgt aaccacaccc cggtacaccg cattggtatc 960
gatggccgtc tggatgttaa cacgcgttcc cgtgtagaaa actttcgcct gcgtcaggca 1020
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<210> 2
<211> 372
<212> PRT
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
<400> 2
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1 5 10 15
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
35 40 45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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<211> 1116
<212> DNA
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
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<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
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<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
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Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Val Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
165 170 175
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
180 185 190
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Thr Ser Ile Glu Cys Asn Ala Thr
195 200 205
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
210 215 220
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
245 250 255
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
260 265 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
275 280 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
290 295 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305 310 315 320
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
325 330 335
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
340 345 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
355 360 365
Lys Leu Glu Ile
370
<210> 9
<211> 1116
<212> DNA
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
<400> 9
atggtatctt acaactccaa atttctggct gctaccgtac aggctgaacc ggtttggctg 60
gacgcggacg caactatcga taaatctatt ggtatcatcg aggaggcggc ccagaaaggt 120
gcgtctctga ttgccttccc ggaagttttc atccctggat acccgtattg ggcctggctg 180
ggtgacgtaa agtactccct gtccttcacc tcccgttacc acgaaaactc cctggaactg 240
ggtgacgacc gtatgcgccg tctgcaactg gctgcgcgtc gtaacaaaat cgcgctggtt 300
atgggttaca gcgagcgtga ggcaggcagc cgctacctgt cccaggtctt tatcgacgaa 360
cgtggtgaaa tcgttgctaa ccgtcgtaaa ctgaaaccaa ctcacgttga acgtacgatt 420
tatggtgaag gcaacggtac cgactttctg acgcatgact tcgcatttgg tcgtgttggt 480
ggtctgaact gctgggagca cgttcagccg ctgtccaaat tcatgatgta ctccctggtt 540
gaacaggtac acgtcgcttc ttggccggct atgtccccgc tgcaaccgga cgtgtttcaa 600
acctccatcg agtgtaatgc gaccgtaacc cgctcctatg ctattgaagg ccaaaccttc 660
gttctgtgct ctacgcaggt tatcggtccg tctgcaattg aaaccttctg tctgaacgat 720
gagcaacgtg cactgctgcc gcagggttgc ggttgggcgc gtatctacgg cccggacggc 780
agcgaactgg ccaagccgct ggctgaagac gcagagggta ttctgtacgc agaaatcgat 840
ctggaacaga ttctgctggc caaggctggc gctgatccgg ttggtcacta cagccgccct 900
gatgtcctgt ccgtgcagtt cgacccgcgt aaccacaccc cggtacaccg cattggtatc 960
gatggccgtc tggatgttaa cacgcgttcc cgtgtagaaa actttcgcct gcgtcaggca 1020
gcagaacagg aacgtcaggc cagcaaacgt ctgggcacga aactgtttga acagtctctg 1080
ctggcggagg agccggtacc agccaaactc gagatt 1116
<210> 10
<211> 372
<212> PRT
<213> 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)
<400> 10
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1 5 10 15
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
35 40 45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
85 90 95
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
100 105 110
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
115 120 125
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Val Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
165 170 175
Tyr Ser Leu Val Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
180 185 190
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Thr Ser Ile Glu Cys Asn Ala Thr
195 200 205
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
210 215 220
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
245 250 255
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
260 265 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
275 280 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
290 295 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305 310 315 320
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
325 330 335
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
340 345 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
355 360 365
Lys Leu Glu Ile
370

Claims (9)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位，第205位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。
2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为天冬氨酸；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为苯丙氨酸；(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第205位丙氨酸突变为半胱氨酸；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为天冬氨酸，同时将第205位丙氨酸突变为半胱氨酸。
3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
4.一种由权利要求3所述腈水解酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体，湿菌体固定化细胞或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH为4.0-10.5、200M磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-60℃、600rpm恒温水浴条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述底物加入终浓度以反应体系体积计为5-1000mM；所述纯酶比酶活为160～170U/g，加入量以反应体系体积计为0.1-3mg/mL；所述催化剂为湿菌体或固定化细胞时，用量以湿菌体重量计为10-100g/L缓冲液。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中，37℃培养10-12小时，按体积浓度1％的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃培养至培养液OD600为0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导培养10小时，离心，收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述纯酶体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因工程菌湿菌体用含pH 7.0、100mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬，超声波破碎，破碎产物离心后取上清液作为粗酶液；所述超声波破碎条件为：400W，20min，1s破碎1s暂停；将粗酶液以1mL/min的流速通过经结合缓冲液冲洗的Ni-NTA柱，用平衡缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min；再用洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，流速为2mL/min；最后将收集的目的蛋白以浓度为20mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为透析液进行透析，取截留液即为纯酶液；所述结合缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液，所述平衡缓冲液为含终浓度300mM NaCl和50mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液，所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和500mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液。
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