CN104911225A - 一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法，即首先利用固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸，然后含1-氰基环己基乙酸的酶催化转化液直接加氢生成加巴喷丁内酰胺，最后加巴喷丁内酰胺经水解、碱化生成加巴喷丁，并在该过程中实现废水及其他试剂的循环使用，最终得到一条绿色、经济、高效的加巴喷丁合成工艺；使用该工艺，从1-氰基环己基乙腈经酶法水解、化学加氢、化学水解、碱化生成加巴喷丁，其E Factor值仅为：2.51，与已报道的化学工艺相比，降低了近25倍。加巴喷丁总体收率达77.3％，比已报道工艺提高了25％。

Description

一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种加巴喷丁的制备方法，特别涉及一种绿色、高效的化学-酶法合成加巴喷丁的方法。

(二)背景技术

加巴喷丁(Gabapentin)是一种一线的抗癫痫药物，其化学名为1-氨甲基环己基乙酸，分子式为C₁₉H₁₇NO₂。加巴喷丁是哺乳动物体中的一种重要神经递质—γ-氨基丁酸(GABA)的结构类似物，主要通过改变GABA的代谢来发挥药理作用，尤其对重症癫痫的治疗效果明显。在高剂量下耐受性良好，不与血浆蛋白结合，毒性较低，半衰期较长，副作用小。

由加巴喷丁的结构信息可知，加巴喷丁分子中包含有一个环己烷基、一个氨甲基和一个乙酸基。因此，其合成多以环己烷基化合物为起始原料。目前，诸多研究者以环己酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷、苯甲腈等为原料开发出了数十条合成路径。这些合成路径所使用的皆为单纯的化学方法，他们各有优劣，但总体上依然普遍存在或多或少的缺陷，如：反应步骤冗长、反应条件苛刻、需要使用有毒或者易燃易爆的危险性试剂、工艺过程不经济等。因此，多数并不适用于工业化生产。Rex Allen等(EP0414262A2)于1991年报道的从1-氰基环己基乙腈经选择性水解、加氢合成加巴喷丁的方法。其过程如图1，图1中试剂和条件：(1)①Py/TiCl₄，②NaCN/EtOH/H₂O；(2)EtOH/PhCH₃/HCl_g/H₂O/3M NaOH/MetOH；(3)10％Rh-C/H₂(50psi)/MeOH/i-PrOHor Raney Ni(50％in H₂O)/MeOH/50％NaOH/H₂(180psi)/i-PrOH/THF。

这条合成路径通过1-氢基环己基乙腈分子上两个氰基的选择性反应，分别引入氨甲基和乙酸基，反应步骤较少，原料廉价易得，因而是一条可选路径。然而该路径之所以未得到广泛应用，其原因在于：一方面，该路径需要使用大量的酸、碱及有机试剂。如反应(2)，每生产1t 1-氰基环己基乙酸即需消耗HCl气体：0.94t，3M NaOH水溶液：2.82m³，乙醇：0.71t，甲苯：3.93m³，甲醇：0.47m³，水：7.06t；另一方面，该路径的总体收率较低，反应(2)中1-氰基环己基乙酸的收率为78％，反应(3)中加巴喷丁的收率最高仅为79％，最终从1-氢基环己基乙腈到加巴喷丁，其总体收率最高仅为61.62％。因此该路径的经济性及环境友好性皆较低，从而限制了其工业化应用。鉴于此，我们尝试对该路径进行大量的改进，尤其是对第二步及第三步反应的改进，从而构建出一条新的合成工艺。

化学法水解1-氰基环己基乙腈生成1-氰基环己基乙酸，反应条件苛刻，环境污染严重，且选择性差，得率低，原子经济性低。而腈水解酶的高催化选择性、高催化活力、温和的催化条件为解决这一问题提供了方向。

腈水解酶的工业化应用，其关键在于高效的酶生产技术，而高密度培养则使实现这一目标成为可能。我们的另一项专利(CN 104212785 A)中详细描述了含可高效催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸的腈水解酶，及其基因工程菌的高密度培养技术。利用该技术，实现了工业化大规模生产此腈水解酶，这为后续加巴喷丁合成的研究奠定了基础。

一般而言生物催化主要包括：添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶法、固定化细胞法等，这些方法各有特点。而就工业化应用而言，静息细胞法和固定化细胞法由于避免了酶的纯化步骤，从而大大降低了生产成本。

利用纯酶催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸在本实验室的一篇论文里即有报道(Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014),2141-2148)。然而纯酶催化的弊端在于：(1)酶蛋白直接暴露于催化反应体系内，稳定性大大降低，反应一段时间后酶活衰减明显；(2)酶的纯化过程复杂而繁琐，会大大增加生产成本；(3)酶蛋白回收困难，且会对后续的反应产生影响，不利于分离。正是这些缺陷，致使其不适合应用于工业化生产。

与之相比，静息细胞催化则表现出了一定的优势。一方面，酶蛋白存在于相对温和、适宜的细胞内环境，稳定性大大提高；另一方面，细胞收集操作简单、方便，避免了繁琐的酶纯化过程；最后，静息细胞也更利于催化剂回收。利用含腈水解酶的静息细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸在我们的另一项专利(CN 104212785A)中即有论述。同时，我们的另一篇论文里也有详细报道(Xue etal/Catalysis Communications 66(2015)121-125)。结果表明，催化水平较纯酶有大幅度提高。在此基础上，我们初步建立了一条化学—酶法合成加巴喷丁的工艺。并报道于一篇论文里(Ya-Ping Xue et al/Catalysis Communications 66(2015)121-125)。

该工艺中，首先用含腈水解酶的静息细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸。由于静息细胞在催化过程中细胞破碎，导致大量的蛋白及有机大分子物质被释放至反应体系，这些有机大分子物质会让后续的加氢催化剂中毒。因此，不得不对酶催化转化液进行预处理。

经过预处理后的含1-氰基环己基乙酸的水溶液可直接加氢生成加巴喷丁内酰胺，然后加巴喷丁内酰胺经过一个简单的化学过程生成加巴喷丁纯品，其过程如图2所示。

然而该工艺依然存在较为突出的缺陷，无法在工业化生产中得到应用：

(1)该工艺使用静息细胞作为催化剂，但静息细胞使用一次后酶活迅速衰减至20％，这意味着静息细胞几乎只能使用一次，无法实现批次重复使用。然而就该生产加巴喷丁的工艺而言，生物催化剂的生产成本恰是总成本的主要部分，因此，降低总成本，即必须从提高生物催化剂利用率着手。

(2)静息细胞在催化过程中，随着细胞的破碎，大量的蛋白及有机大分子物质被释放出来，这些物质会使后续的加氢催化剂中毒，为了解决这一问题，不得不对静息细胞催化转化液进行预处理。使用三氯化铝絮凝，虽然能达到加氢要求，但是一方面，三氯化铝对设备有一定的腐蚀作用；同时转化液中还存在少量的蛋白质。对加氢催化剂的重复使用存在一定的影响，另一方面，预处理工序也会增加生产成本；

(3)该工艺并未实现水的循环利用，而废水处理恰恰也是总生产成本的一个重要部分。

为了解决这些问题，不得不对该工艺做进一步改进。首先，固定化细胞为解决使用静息细胞催化所带来的问题提供了可能。将游离细胞固定化，可大大增强其机械强度，很好的保证其细胞的完整性，避免了蛋白及大分子物质的泄漏问题，增强了酶的稳定性，从而使得酶的批次重复使用成为可能。因此，研究开发一种性能优异、制备工艺简单经济的固定化细胞技术具有极大的现实意义。此外，需要设计更加优化的水及有机试剂循环利用的工艺，从而进一步降低生产成本。本发明正是基于这一思路展开的探索与研究。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种绿色、高效的化学-酶法合成加巴喷丁的方法，即首先利用固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸，然后含1-氰基环己基乙酸的酶催化转化液直接加氢生成加巴喷丁内酰胺，最后加巴喷丁内酰胺经水解、碱化生成加巴喷丁，并在该过程中实现废水及其他试剂的循环使用，最终得到一条绿色、经济、高效的加巴喷丁合成工艺。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法，所述的方法为：(1)酶催化：以含腈水解酶的固定化细胞为酶源，以1-氰基环己基乙腈为底物，以水或磷酸盐缓冲液为反应介质，在20-50℃、100-350rpm条件下进行转化反应(优选20-50℃、100-350rpm条件下反应1-5h，更优选35℃、200rpm条件下反应2.5h)，反应结束后，将转化反应液过滤，获得滤饼和滤液，滤饼回收酶源，滤液即为含1-氰基环己基乙酸的转化液；所述含腈水解酶的固定化细胞按如下方法制备：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液(优选pH＝7.0、100mM磷酸盐缓冲液)或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝0.5～2h，然后加入戊二醛进行交联，10～25℃搅拌交联0.5～2h后，弃去上清液，真空抽滤后，获得固定化细胞；所述腈水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1(优选0.04～0.09:1)；所述缓冲液或蒸馏水体积用量以湿菌体湿重计为5ml/g～15ml/g；所述戊二醛以体积浓度25％(v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25％(v/v)戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.05～0.5ml/g(优选0.1ml/g)；所述聚乙烯亚胺以体积浓度5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.01～1.0ml/g(优选0.3ml/g)，本发明所述聚乙烯亚胺分子量70000，聚合度1600；

(2)加氢反应：取步骤(1)含1-氰基环己基乙酸的转化液于加氢反应釜中，加入加氢催化剂，通入氢气，于0-300℃、400-1200rpm条件下搅拌反应(优选0-300℃、400-1200rpm条件下搅拌反应4-20h，更优选110℃、1000rpm条件下搅拌反应9h)，反应完全后将反应液冷却至30-80℃(优选60℃)，放空氢气，将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收催化剂，滤液冷却至室温后加入等体积的二氯甲烷萃取(优选萃取3次)，静置分层(优选于分液漏斗中静置1-8h，更优选5h)，获得有机相和水相，有机相经旋蒸(优选35-60℃，更优选40℃)得加巴喷丁内酰胺晶体，加巴喷丁内酰胺晶体进行水解反应生成加巴喷丁盐酸盐，然后加巴喷丁盐酸盐进行碱化反应，获得加巴喷丁，二氯甲烷回收再利用；水相通过蒸氨法(即于25-150℃，优选55℃下旋蒸，收集氨气，直至母液pH达7.0左右)回收氨气和废水，而废水则回收作为反应介质用于步骤(1)中的酶催化反应；所述加氢催化剂为雷尼镍。

进一步，步骤(2)所述水解反应为：取加巴喷丁内酰胺晶体与0.1-12mol/L的HCl水溶液混合(优选6mol/L)，加热回流1-10h(优选4h)，回流反应液冷却至室温，加入二氯甲烷萃取，有机相回收未反应的加巴喷丁内酰胺，水相于0-4℃冷却结晶，过滤得白色固体，滤液回收补充HCl后用于加巴喷丁内酰胺水解反应；所得白色固体于丙酮中研磨，过滤，滤饼于40℃下干燥得加巴喷丁盐酸盐，其中二氯甲烷及丙酮通过旋蒸回收再利用，而回收所得的加巴喷丁内酰胺则继续水解；所述加巴喷丁内酰胺晶体用量以HCl水溶液体积计为15.3-612.8g/L，更优选153.2g/L。

进一步，步骤(2)所述碱化反应为：取加巴喷丁盐酸盐加入水中，20-60℃(优选40℃)下搅拌溶解，调pH值至7.0-7.5，加入甲苯，搅拌10-120min(优选30min)，于0-4℃下冷却结晶，过滤得白色晶体，滤液回收与加巴喷丁盐酸盐混合后，继续下一次碱化反应，白色晶体于甲醇或异丙醇中重结晶，得加巴喷丁；所述加巴喷丁盐酸盐用量以水体积计为20.8-1038.4g/L，更优选726.9g/L；所述调pH值至7.0-7.5所用试剂为0.1-12mol/L的NaOH水溶液，也可以用其他碱，更优选10mol/L的NaOH水溶液；所述甲苯与水体积比为0.05-0.8:1，更优选0.25:1。

进一步，步骤(1)所述酶源用量为1.0～3.5g/L反应介质(更优选2.2g/L)，所述底物终浓度为0.2-1.5mol/L(更优选0.5mol/L)。

进一步，步骤(2)所述加氢催化剂与1-氰基环己基乙腈的质量比为0.02-0.3:1，更优选0.1:1。

进一步，步骤(2)所述通入氢气前先通入氮气置换空气，(优选置换3次)，氢气通入量为0.5-5MPa，更优选2MPa。

本发明所述含腈水解酶基因的重组基因工程菌是将Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突变体基因F168V(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对F168V/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-F168V导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V作为生产菌种(Xin-Hong Zhanget al/Process Biochemistry 49(2014)2141-2148)。

本发明所述湿菌体的制备方法为：

(1)斜面菌种制备：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌接种至含50mg/L的卡那霉素的固体LB斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；

(2)种子液制备：挑取步骤(1)所得斜面菌体，接种一环于装有100mL含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基的500mL摇瓶中，于37℃，150rpm下过夜培养，得种子液。

(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以3％(v/v)的接种量，接种于装有3L含终浓度50mg/L卡那霉素发酵培养基的5L发酵罐中，于37℃，500rpm，通气比1.3vvm条件下发酵培养，发酵过程流加体积浓度8％的氨水和体积浓度10％的磷酸水溶液调节pH维持在6.5。每隔2h取样测OD₆₀₀及甘油和乙酸的含量。发酵培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为水，pH值为6.5。

(3)DO-STAT补料培养：分批发酵7-8h后，待溶氧值突然迅速上升至15％±5％时，开始采用DO-STAT方式添加补料培养基维持发酵液溶氧值在15％±5％，调整搅拌转速为700rpm。补料培养基组成为：蛋白胨75g/L，酵母提取50g/L，甘油500g/L，柠檬酸3g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄3g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄5g/L，溶剂为水，pH值为6.5。待发酵至OD₆₀₀达到90，后调整转速至750rpm。待发酵至OD₆₀₀达到125，后调整转速至800rpm；继续发酵至OD₆₀₀达到170，后调整转速至1000rpm。维持发酵转速为1000rpm、温度30℃条件下，继续发酵。发酵过程中流加8％(v/v)氨水和10％(v/v)磷酸水溶液调pH维持在6.5。每隔2h取样测OD₆₀₀及甘油和乙酸的含量。

(4)乳糖诱导：采用分批加入的方式，即：OD₆₀₀达30时，先加入20g/L乳糖诱导，调节温度至30℃。待对数生长后期，OD₆₀₀达120时，再次加入14g/L乳糖，二次诱导。每隔2h取样测定酶活、OD₆₀₀、乙酸含量以及甘油含量。

(5)停罐收集菌体：诱导后，继续发酵至OD₆₀₀值以及比酶活在3h内不在上升或开始下降时，停止发酵，放罐，获得发酵液。于4℃，9000rpm下离心8min，弃上清液，收集湿菌体。

本发明所述硅藻土分子式为SiO₂，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，优选购自阿拉丁公司。

本发明所述珍珠岩，化学组成SiO₂：70～75％，Al₂O₃：12～16％，Na₂O：1.0％～4.0％，K₂O：1.0％～4.0％，外观白色颗粒，比重0.09，熔点：1280～1350℃，优选购自杭州锦大绿产业技术有限公司。

本发明所述活性炭，分子式为C，分子量为12.01，比重1.8，对有机色素和含氮碱有高容量的吸附能力，优选购自阿拉丁公司。

本发明所述加氢催化剂优选为Raney Ni RTH-4110，购自大连通用化工有限公司，但其他类似型号的Raney Ni也在本专利所保护的范围内。

本发明所述固定化方法是在初始高密度培养基中发酵生产腈水解酶；然后将发酵液离心获得菌体与缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液，添加载体(如硅藻土)，搅拌混匀，再与聚乙烯亚胺混合，搅拌使菌体絮凝；最后向溶液中加入戊二醛进行交联，真空抽滤后得固定化细胞。

本发明所述含腈水解酶细胞的固定化方法中，在缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液中，载体、聚乙烯亚胺、戊二醛的添加顺序是：首先添加载体、然后添加聚乙烯亚胺、最后添加戊二醛；添加顺序调将显著降低固定化细胞酶活回收率和操作稳定性。众所周知，没有一种固定化方法适合所有的酶或细胞，即使是同样的细胞由于含有不同的酶，同样固定化细胞的方法或相同方法不同操作步骤产生的效果也会有巨大的差异。

本发明所述水是指自来水。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种绿色、高效的化学-酶法合成加巴喷丁的方法(工艺流程图见图3)，该方法首先用腈水解酶替代化学法催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸，成功的避免了大量无机酸碱及有机试剂的使用，提高了1-氰基环己基乙酸的收率。为了进一步提高生物催化剂的利用率，本发明提供了一种操作简单、重复使用性能优越、成本低廉的固定化方法，用该方法固定化产腈水解酶的重组大肠杆菌全细胞，并应用于催化1-氰基环己基乙腈水解生产1-氰基环己基乙酸，连续转化30批次后，转化率仍达82.3％以上。使得酶法催化生产1-氰基环己基乙酸的成本大大降低，达到了工业化应用的标准。此外，本发明成功的实现了，含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液直接加氢生产加巴喷丁内酰胺，避免了非水相加氢反应所带来的诸多弊端。最后，本发明提供了一条成熟的生产工艺，成功的实现了加巴喷丁合成过程中的废水、有机试剂的循环利用，从而大大减少了废物的生成。使用该工艺，从1-氰基环己基乙腈经酶法水解、化学加氢、化学水解、碱化生成加巴喷丁，其E Factor值仅为：2.51，与已报道的工艺相比，降低了近25倍。加巴喷丁总体收率达77.3％，比已报道工艺的61.6％，提高了25％。最终得到了一种更加经济、更加符合绿色化学理念的加巴喷丁合成方法。

(四)附图说明

图1为从1-氰基环己基乙腈经选择性水解、加氢合成加巴喷丁的路径图。

图2为加巴喷丁内酰胺制备加巴喷丁的工艺流程图。

图3为化学-酶法生产加巴喷丁的工艺流程图。

图4固定化细胞催化转化液直接加氢的反应进程曲线图。

图5固定化细胞催化转化液直接加氢对加氢催化剂循环使用的影响柱形图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH自然。

LB固体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂1.5-2.0％，溶剂为水，pH自然。

发酵培养基组成：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为水，pH值为6.5。

酶活定义为：一定条件下，每分钟催化底物反应生成1μmol产物(1-氰基环己基乙酸)所需的酶量，定义为一个酶活力单位，记为1U。

比酶活(U/g DCW)：

HPLC检测条件：色谱柱：C-18column(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈：缓冲液＝24:76；缓冲液：1.83g/L高氯酸钠和0.58g/L磷酸二氢铵溶于1L水中，并用高氯酸调节pH至1.8；柱温：40℃；波长：215nm。

本发明实施例所用硅藻土分子式为SiO₂，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，购自阿拉丁公司。

实施例1：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的构建

构建方法为：将Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突变体基因F168V(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，已在Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014)2141-2148中公开)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对F168V/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-F168V导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V。

PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系，在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL，T₄连接酶1μL，腈水解酶目的基因3μL，PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜。

双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入腈水解酶目的基因40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH₂O 6μL，振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系，在PCR管中依次加入pET28b 40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH₂O 6μL，振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200rpm条件下酶切4-5h。

实施例2：利用DO-STAT补料偶联分步诱导，并逐步提高转速的高密度发酵技术制备含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V湿菌体

1、实验过程：

(1)种子液制备：取实施例1中构建的含腈水解酶基因的E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-F186V斜面菌种，接种一环于装有100mL含终浓度5g/L卡那霉素的LB液体培养基的500mL摇瓶中，于37℃，150rpm下过夜培养，得种子液。

(2)发酵罐分批培养：将步骤(1)获得的种子液以3％(v/v)的接种量，接种于装有3L含终浓度50g/L卡那霉素发酵培养基的5L发酵罐中，于37℃，500rpm，通气比1.3vvm条件下发酵培养，发酵过程流加体积浓度8％的氨水和体积浓度10％的磷酸水溶液调节pH维持在6.5。每隔2h取样测OD₆₀₀及甘油和乙酸的含量。发酵培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为水，pH值为6.5。

(3)DO-STAT补料培养：分批发酵7-8h后，待溶氧值突然迅速上升至15％±5％时，开始采用DO-STAT方式添加补料培养基维持发酵液溶氧值在15％±5％，调整搅拌转速为700rpm。补料培养基组成为：蛋白胨75g/L，酵母提取50g/L，甘油500g/L，柠檬酸3g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄3g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄5g/L，溶剂为水，pH值为6.5。待发酵至OD₆₀₀达到90，后调整转速至750rpm。待发酵至OD₆₀₀达到125，后调整转速至800rpm；继续发酵至OD₆₀₀达到170，后调整转速至1000rpm。维持发酵转速为1000rpm、温度30℃条件下，继续发酵。发酵过程中流加8％(v/v)氨水和10％(v/v)磷酸水溶液调pH维持在6.5。每隔2h取样测OD₆₀₀及甘油和乙酸的含量。

(4)乳糖诱导：采用分批加入的方式，即：OD₆₀₀达30时，先加入20g/L乳糖诱导，调节温度至30℃。待对数生长后期，OD₆₀₀达120时，再次加入14g/L乳糖，二次诱导。每隔2h取样测定酶活、OD₆₀₀、乙酸含量以及甘油含量。

(5)停罐收集菌体：诱导后，继续发酵至OD₆₀₀值以及比酶活在3h内不再上升或开始下降时，停止发酵，放罐，获得发酵液。于4℃，9000rpm下离心8min，弃上清液，收集湿菌体。

2、实验结果：

实验结果显示采用该高密度发酵技术制备含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-F168V湿菌体，生物量达70g DCW/L，体积酶活达103530U/L，达到了工业化应用的标准。

实施例3：含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的固定化细胞的制备(一)

1、实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)取8.3g湿菌体于100ml磷酸盐缓冲液(pH 7.0,100mM)中，制成菌悬液，即湿菌体添加量为：0.083g/mL。

(3)向步骤(2)所得100mL菌悬液中添加0.4g硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，混合磁力搅拌器充分搅拌0.5h。

(4)向步骤(3)所得混合液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃下交联0.5h，过滤，弃滤液，得到固定化细胞。

(5)固定化细胞活力回收率测定：取步骤(4)所得固定化细胞0.625g，于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0,100mM)中，加入1-氰基环己基乙腈使其终浓度为200mM，40℃，200rpm下，反应10min，后取样，迅速于12000rpm下离心5min。取上清液，并用HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸浓度，计算固定化细胞比酶活；同时取等同于固定化细胞量的游离细胞0.25g，于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0,100mM)中，加入200mM1-氰基环己基乙腈，40℃，200rpm下，反应10min，后取样，迅速于12000rpm下离心5min。取上清液，并用HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸浓度，计算游离化细胞比酶活。

(6)固定化细胞热稳定性测定：取步骤(4)所得固定化细胞0.625g，于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0,100mM)中，将12个装有10mL缓冲液，0.625g固定化细胞的50mL转化瓶于45℃下保温36h，每隔3h取样测固定化细胞比酶活，作温度稳定性曲线，拟合固定化酶一级失活动力学方程，计算出固定化酶的半衰期。

(7)固定化细胞批次重复使用能力测定：取步骤(4)所得固定化细胞22g，于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)的三口烧瓶中，加入1-氰基环己基乙腈使其终浓度为500mM，于35℃，200rpm下，反应2.5h，过滤，滤液用HPLC检测产物浓度，计算转化率。固定化细胞经过三次洗涤后，进行下一批转化。

2、实验结果：

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞比酶活：113.3U/gdcw；固定化细胞酶活力回收率：68.1％，45℃下半衰期：228.7h，500mM底物浓度下连续转化25批次，转化率：81.5％。

实施例4：含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的固定化细胞的制备(二)

1实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)取10.0g湿菌体于100ml磷酸盐缓冲液(pH 7.0,100mM)中，制成菌悬液，即湿菌体添加量为：0.100g/mL。

(3)向步骤(2)所得100mL菌悬液中添加0.6硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，混合磁力搅拌器充分搅拌1h。

(4)向步骤(3)所得混合液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃下交联0.5h，过滤，弃滤液，得到固定化细胞。

(5)固定化细胞活力回收率测定：同实施例3。

(6)固定化细胞热稳定性和半衰期的测定：同实施例3。

(7)固定化细胞批次重复使用能力测定：同实施例3。

2实验结果：

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为96.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为57.8％，45℃半衰期为266.5h，500mM底物浓度下连续操作第30批次时产率为82.3％。

实施例5：利用含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸(一)

1实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)含腈水解酶的固定化细胞制备：同实施例4。

(3)固定化细胞批次催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸：取步骤(2)所得固定化细胞22g，于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)的三口烧瓶中，加入1-氰基环己基乙腈使其终浓度为500mM，于35℃，200rpm下，反应2.5h，过滤，滤液用HPLC检测产物浓度，计算转化率。固定化细胞经过三次洗涤后，进行下一批转化，直至酶活力显著下降(转化率<80％)，停止转化。

2实验结果：

以上述方法制备的腈水解酶固定化细胞为催化剂(22g)，催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸，得3.4L 1-氰基环己基乙酸水溶液(平均浓度>425mM)。其每克固定化细胞可生产11g 1-氰基环己基乙酸。

实施例6：利用含腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V的固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸(二)

1实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)含腈水解酶的固定化细胞制备：同实施例4

(3)固定化细胞批次催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸：取步骤(2)所得固定化细胞22g，于250mL装有100mL水的三口烧瓶中，加入1-氰基环己基乙腈使其终浓度为500mM，于35℃，200rpm下，反应2.5h，过滤，滤液(即含1-氰基环己基乙酸的转化液)用HPLC检测产物浓度，计算转化率。固定化细胞经过三次洗涤后，进行下一批转化，直至酶活力显著下降(转化率<80％)，停止转化。

2实验结果：

结果表明，固定化细胞重复批次使用34次，得3.4L 1-氰基环己基乙酸水溶液(平均浓度>425mM)。其每克固定化细胞可生产11g 1-氰基环己基乙酸。与实施例5结果相近，这表明该固定化细胞可以以水为反应介质催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸。

实施例7含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液直接加氢生成加巴喷丁内酰胺

1实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)游离细胞催化1-氰基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸：取50g湿菌体，于装有1L水的2L三口圆底烧瓶中，加入1-氢基环己基乙腈使其终浓度为1M，于35℃，200rpm下，反应8h，后离心(9000rpm,10min)除去菌体，得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液。

(3)含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液直接加氢：取步骤(2)中所得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液150mL，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})(即2.30g)的Raney Ni RTH-4110，通入氮气置换空气3次，通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收加氢催化剂再利用；滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。

(4)加氢催化剂再利用：取步骤(2)中所得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液150mL，于500mL的加氢反应釜中，加入步骤(3)中回收的加氢催化剂。通入氮气置换空气3次，通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收催化剂再利用；滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。

2实验结果：

游离细胞催化反应8h，1-氢基环己基乙腈转化率达92％，表明游离细胞可催化1-氢基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸。但实验表明游离细胞催化转化液直接加氢，反应9h，底物转化率(83.5％)和加巴喷丁收率(79.8％)都较低。催化剂回收后，再次用于加氢，底物转化率和加巴喷丁收率进一步降低(分别为49.8％，加巴喷丁收率44.6％)，再次表明加氢催化剂Raney Ni表现出了中毒现象。由此可见，含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转液不能直接应用于加氢反应。

实施例8含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液加氢生成加巴喷丁内酰胺

1实验过程：

(1)湿菌体制备：同实施例2。

(2)游离细胞催化1-氰基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸：取50g湿菌体，于装有1L水的2L三口圆底烧瓶中，加入1-氢基环己基乙腈使其终浓度为1M，于35℃，200rpm下，反应8h，后离心(9000rpm,10min)除去菌体，用10g/L的三氯化铝吸附除去蛋白，得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液。

(3)含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液直接加氢：取步骤(2)中所得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液150mL，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})(即2.30g)的Raney Ni RTH-4110，通入氮气置换空气3次，通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收加氢催化剂再利用；滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。

(4)加氢催化剂再利用：取步骤(2)中所得含1-氰基环己基乙酸的游离细胞催化转化液150mL，于500mL的加氢反应釜中，加入步骤(3)中回收的加氢催化剂。通入氮气置换空气3次，通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收催化剂再利用；滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。

2实验结果：

游离细胞催化反应8h，1-氢基环己基乙腈转化率达92％，表明游离细胞可催化1-氢基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸。但实验表明游离细胞催化转化液直接加氢，反应9h，底物转化率(83.5％)和加巴喷丁收率(79.8％)都较低。催化剂回收后，再次用于加氢，加氢催化剂Raney Ni使用三次后表现出了中毒现象。

实施例9：含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液直接加氢生成加巴喷丁内酰胺

1实验过程：

取实施例6中所得含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液150mL(即滤液)，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})(即1.25g)的RaneyNi RTH-4110，通入氮气置换空气3次，通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收催化剂再利用；滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。水相通过蒸氨法(即55℃下旋蒸，收集氨气，直至母液pH达7.0左右)回收氨气和废水，而废水则回收作为反应介质用于下次酶催化反应。

2实验结果：

实验结果表明，含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液可直接应用加氢反应，反应9h，底物转化率达99.5％，加巴喷丁内酰胺收率达95.5％，可应用于工业生产，其反应进程见附图4。

实施例10：含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液直接加氢中加氢催化剂循环利用性

1实验过程：

取实施例6中所得含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液150mL(即滤液)，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})(即1.25g)的RaneyNi RTH-4110，通入氮气置换空气3次，后通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收催化剂，滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。回收的催化剂再次加入至150mL固定化细胞催化转化液中，按照上述条件，进行加氢反应。如此催化剂重复使用7次。

2实验结果：

如附图5所示，用含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液不经过任何预处理，直接进行加氢反应，对加氢催化的循环使用无明显影响。催化剂循环使用7次，其底物转化率仍能达88.2％。

实施例11：蒸氨法处理加氢废水，实现水循环利用的可行性

1实验过程：

(1)加氢废水收集：取实施例6中所得含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液150mL(即滤液)，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})(即1.25g)的Raney Ni RTH-4110，通入氮气置换空气3次，后通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，反应液过滤，回收催化剂再利用，滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。收集水相备用。

(2)蒸氨：取步骤(1)所得水相于2L的三口圆底烧瓶中，于55℃下，旋蒸直至废水pH达7.0左右，分别收集氨水及废水。依照此方法，制备1.0L加氢废水。

(3)废水再应用于固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸：取步骤(2)所得废水100mL，加入1-氰基环己基乙腈，使其终浓度为500mM，加入22g按照实施例4所述方法制备的腈水解酶固定化细胞，于35℃，200rpm下，反应2.5h，过滤，滤液用HPLC检测产物浓度，计算转化率。

2实验结果：

实验结果表明，反应2.5h，其转化率达100％。与水中的固定化细胞催化反应相近，说明经过蒸氨法处理的加氢废水，可以再次作为反应介质，应用于固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈区域选择性水解生成1-氰基环己基乙酸。由此表明，可用蒸氨法实现水的循环利用，并可回收氨。该工艺在工业化大规模生产中价值突出，一方面，实现了废水的循环利用，大大减少由废水处理而产生的成本；另一方面，实现了氨的回收，氨作为重要的生化试剂，可以出售，从而增加了产出。

实施例12：蒸氨法处理加氢废水，实现水循环利用的可行性(二)

1实验过程：

(1)加氢废水收集：取实施例6中所得含1-氰基环己基乙酸的固定化细胞催化转化液150mL，于500mL的加氢反应釜中，加入10％(w_催化剂：w_{1-氰基环己基乙酸})的Raney NiRTH-4110(1.25g)，通入氮气置换空气3次，后通入2MPa的氢气，于110℃，1000rpm下反应9h，后停止搅拌，冷却至60℃，放空氢气，转化液过滤，回收催化剂再利用，滤液冷却至室温，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，静置分层后，有机相经40℃旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，二氯甲烷回收再利用。收集水相备用。

(2)蒸氨：取步骤(1)所得水相于2L的三口圆底烧瓶中，于55℃下，旋蒸直至废水pH达7.0左右，分别收集氨水及废水。依照此方法，制备2.0L加氢废水。

(3)废水再应用于固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈水解生成1-氰基环己基乙酸：取步骤(2)所得废水1L，加入1-氰基环己基乙腈，使其终浓度为500mM，加入220g按照实施例4所述方法制备的腈水解酶固定化细胞，于35℃，200rpm下，反应2.5h，后过滤，滤液用HPLC检测产物浓度，计算转化率。

(4)废水连续循环：取步骤(3)所得固定化细胞转化液(即滤液)，按照步骤(1)所述方法加氢，废水经步骤(2)所述方法处理，后按照步骤(3)所述方法再利用，每次再利用的催化体系减小25mL(因为蒸氨及其他操作过程会造成水一定程度上的损失)。如此重复循环，直至1-氰基环己基乙酸收率，或加巴喷丁内酰胺收率有明显下降时停止。

2实验结果：

实验结果表明，利用蒸氨法实现水的循环利用，循环18次，对固定化细胞催化反应，及加氢反应无明显影响。该实验表明，利用该蒸氨法可实现较高次数的水循环，工艺可行。

实施例13：加巴喷丁内酰胺水解生成加巴喷丁盐酸盐

1实验过程：

取按照实施例7所述方法制备的加巴喷丁内酰胺153.2g，于1L的6M HCl中加热回流4h，冷却至室温，加入二氯甲烷萃取，有机相回收未反应的加巴喷丁内酰胺，水相于0-4℃冷却结晶，过滤得白色固体，滤液回收补充酸后用于下一次水解反应。所得白色固体于丙酮中研磨，过滤，并于40℃下干燥得加巴喷丁盐酸盐。其中二氯甲烷及丙酮通过旋蒸回收再利用，而回收所得的加巴喷丁内酰胺则继续水解。

2实验结果：

经40℃干燥后，得加巴喷丁盐酸盐167.8g，收率达80.8％。其中母液(过滤除去加巴喷丁盐酸后的酸解液，即水相于0-4℃冷却结晶过滤获得的滤液)循环使用5次后，加巴喷丁盐酸盐的整体收率达95.5％。这是因为，该酸解过程为一个封闭体系，既不会引入其他杂质，也不会生成其他杂志，因此可通过母液回收达到较高的目标产物收率。

实施例14：加巴喷丁盐酸盐碱化生产加巴喷丁

1实验过程：

取实施例13制备的加巴喷丁盐酸盐726.9g于1L水中，40℃下搅拌溶解，缓慢加入10M NaOH调pH至7.0-7.5，加入250mL甲苯，搅拌30min，后于0-4℃下冷却结晶，过滤得白色晶体，滤液回收添加加巴喷丁盐酸盐后，继续下一次碱化反应。白色晶体于甲醇或异丙醇中重结晶，得加巴喷丁纯品。

2实验结果：

经重结晶后，得414.1g加巴喷丁纯品，收率达69.1％。其中母液(过滤除去白色晶体后的滤液)循环使用5次后，加巴喷丁的整体收率达92.4％。这是因为，该碱化过程也为一个封闭体系，因此可通过母液回收达到较高的目标产物收率。

实施例15

(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加1.0g的珍珠岩，磁力搅拌器上混合均匀，与5ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1.5h。

(3)向步骤(2)溶液中加入2ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，10℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同对比例1。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为106.4U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为64.0％，45℃半衰期为208.8h，500mM底物浓度下连续操作24次后，其产率为81.6％。

实施例16

(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)＝1:6.7(m/v)混合得到菌悬液，即取15g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g的活性炭，磁力搅拌器上混合均匀，与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。

(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，10℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作30批次产率测试方法同实施例2。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为56.5U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为44.0％，45℃半衰期为268.8h，500mM底物浓度下连续操作28次后，其产率为71.4％。

对比例1去除载体对固定化细胞的影响

(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，使菌体絮凝。

(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h后，弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，加入200mM底物1-氰基环己基乙腈，40℃反应10min，取样，HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸的浓度，根据酶活定义计算固定化细胞活力；同时取等同于固定化细胞量的游离细胞0.25g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，加入200mM底物1-氰基环己基乙腈，40℃反应10min，取样，HPLC检测产物1-氰基环己基乙酸的浓度，根据酶活定义计算游离细胞活力。固定化细胞活力除以游离细胞活力计算出固定化细胞酶活回收率。

取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 7.0磷酸盐缓冲液中，将12个装有10mL缓冲液，0.625g固定化细胞的50mL转化瓶于45℃下保温36h,每隔3h取样测固定化细胞活力，作温度稳定性曲线，拟合固定化酶一级失活动力学方程，计算出固定化酶的半衰期。

取步骤(3)制备的固定化细胞22g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0,100mM)的三口烧瓶中，加入500mM底物，35℃，200rpm搅拌转速，反应2.5h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测产物浓度，计算产率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。

酶活定义为：40℃，pH＝7.0条件下，每分钟催化生成1mmol的1-氰基环己基乙酸所需的酶量定义为1U。

HPLC检测条件为：产物1-氰基环己基乙酸的浓度通过戴安U3000HPLC分析，色谱柱：C-18column(250mm×4.6mm,5μm)；检测条件：1.83g/L高氯酸钠和0.58g/L磷酸二氢铵溶液混成1L溶液，用高氯酸调节pH至1.8，按照乙腈：盐溶液＝24:76混合均匀得流动相，柱温40℃在215nm紫外波长下检测。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为42.4U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为21.3％，45℃半衰期为123.2h，500mM底物浓度下连续操作10批后产率为65.2％。

结果表明：无载体固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。

对比例2去除聚乙烯亚胺对固定化细胞的影响

(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.3g硅藻土，磁力搅拌器上混匀。

(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h后弃去上清液，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同对比例1。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为62.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为37.8％，45℃半衰期为146.5h，500mM底物浓度下连续操作7批次产率为73.5％。

结果表明：无聚乙烯亚胺固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。

对比例3去除戊二醛对固定化细胞的影响

(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同对比例1。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为66.1U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为32.9％，45℃半衰期为155.3h，500mM底物浓度下连续操作9批次产率为55.1％。

结果表明：无聚戊二醛固定化时，固定化细胞酶活回收率较低，操作稳定性较差。

对比例4聚乙烯酰胺与戊二醛加入顺序对固定化细胞的影响

(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)获得的100ml菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联0.5h。

(3)向步骤(2)溶液中加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同对比例1。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为36.3U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为27.8％，45℃半衰期为138.7h，500mM底物浓度下连续操作10批次产率为75.4％。

结果表明：聚乙烯酰胺与戊二醛加入顺序对固定化细胞活性回收率和操作稳定性有重要影响。

对比例5载体与聚乙烯酰胺、戊二醛加入顺序对固定化细胞的影响

(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h。然后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。

(3)向步骤(2)溶液中加入0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，真空抽滤得到固定化细胞。

(4)酶活力、固定化细胞酶活回收率、半衰期及500mM底物浓度下连续操作批次产率测试方法同对比例1。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：腈水解酶固定化细胞酶活为38.8U/gdcw，固定化细胞酶活回收率为20.7％，45℃半衰期为115.2h，500mM底物浓度下连续操作11批后产率为75.2％。

结果表明：载体与聚乙烯酰胺、戊二醛加入顺序对固定化细胞活性回收率和操作稳定性有重要影响。

对比例6卤醇脱卤酶细胞固定化

(1)按文献(Zou SP,Du EH,Hu,ZC and Zheng YG*,Enhanced biotransformationof 1,3-dichloro-2-propanol to epichlorohydrin via resin-based in situ product removalprocess.Biotechnol.Lett.,35(6):937-942,2013.)报道的方法发酵制备表达卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌湿菌体。按菌体湿重：磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100ml磷酸盐缓冲液中制成100mL菌悬液。

(2)向步骤(1)菌悬液中加入0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后加入3ml浓度为5％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，在磁力搅拌器充分搅拌下混合1h。

(3)向步骤(2)溶液中加入1ml浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，25℃交联0.5h。真空抽滤得到固定化细胞。

(4)取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入150mM底物3-氯-1,2-丙二醇，45℃反应10min，取样，GC检测产物环氧氯丙烷浓度，根据酶活定义计算固定化细胞活力；同时取等同于固定化细胞量的游离细胞0.25g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入150mM底物3-氯-1,2-丙二醇，45℃反应10min，取样，GC检测产物环氧氯丙烷浓度，根据酶活定义计算游离细胞活力。固定化细胞活力除以游离细胞活力计算出固定化细胞酶活回收率。

取步骤(3)制备的固定化细胞0.625g于10ml pH 8.0磷酸盐缓冲液中，将12个装有10mL缓冲液，0.625g固定化细胞的50mL转化瓶于45℃下保温30h,每隔3h取样测固定化细胞活力，作温度稳定性曲线，拟合固定化酶一级失活动力学方程，计算出固定化酶的半衰期。

取步骤(3)制备的固定化细胞20g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝8.0,100mM)的三口烧瓶中，加入150mM底物，45℃，200rpm搅拌转速，反应5h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用GC检测产物浓度，计算产率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。

卤醇酶活定义参照上述文献报道方法。

GC检测条件参照上述文献报道方法。

根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：卤醇脱卤酶固定化细胞酶活回收率为10.7％，45℃半衰期为211.5h，连续催化转化3-氯-1,2-丙二醇操作5批后产率为75.2％。

结果表明：本发明公开的固定化方法在卤醇脱卤酶重组大肠杆菌全细胞的固定化中表现较差。

Claims (10)

1.一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于所述的方法为：(1)酶催化：以含腈水解酶的固定化细胞为酶源，以1-氰基环己基乙腈为底物，以纯水或磷酸盐缓冲液为反应介质，在20-50℃、100-350rpm条件下进行转化反应，反应结束后，将转化反应液过滤，获得滤饼和滤液，滤饼回收酶源，滤液即为含1-氰基环己基乙酸的转化液；所述含腈水解酶的固定化细胞按如下方法制备：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝0.5～2h，然后加入戊二醛进行交联，10～25℃搅拌交联0.5～2h后，弃去上清液，真空抽滤后，获得固定化细胞；所述载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1；

(2)加氢反应：取步骤(1)含1-氰基环己基乙酸的转化液于加氢反应釜中，加入加氢催化剂，通入氢气，于0-300℃、400-1200rpm条件下搅拌反应，反应完全后将反应液冷却至30-80℃，放空氢气，将反应液过滤，获得滤液和滤饼，滤饼回收催化剂，滤液冷却至室温后加入等体积的二氯甲烷萃取，静置分层，获得有机相和水相，有机相经旋蒸得加巴喷丁内酰胺晶体，加巴喷丁内酰胺晶体进行水解反应生成加巴喷丁盐酸盐，然后加巴喷丁盐酸盐进行碱化反应，获得加巴喷丁，二氯甲烷回收再利用；水相通过蒸氨法回收氨气和废水，而废水则回收作为反应介质用于步骤(1)中的酶催化反应；所述加氢催化剂为雷尼镍。

2.如权利要求1所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于步骤(1)所述酶源用量为1.0～3.5g/L反应介质，所述底物终浓度为0.2-1.5mol/L。

3.如权利要求1所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于步骤(2)所述加氢催化剂与1-氰基环己基乙腈的质量比为0.02-0.3:1。

4.如权利要求1所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于步骤(2)所述通入氢气前先通入氮气置换空气，氢气通入量为0.5-5MPa。

5.如权利要求1所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于步骤(2)所述水解反应为：取加巴喷丁内酰胺晶体与0.1-12mol/L的HCl水溶液混合，加热回流1-10h，回流反应液冷却至室温，加入二氯甲烷萃取，有机相回收未反应的加巴喷丁内酰胺，水相于0-4℃冷却结晶，过滤得白色固体，滤液回收补充HCl后用于加巴喷丁内酰胺水解反应；所得白色固体于丙酮中研磨，过滤，并于40℃下干燥得加巴喷丁盐酸盐，其中二氯甲烷及丙酮通过旋蒸回收再利用，而回收所得的加巴喷丁内酰胺则继续水解。

6.如权利要求5所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于所述加巴喷丁内酰胺晶体用量以HCl水溶液体积计为15.3-612.8g/L。

7.如权利要求1所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于步骤(2)所述碱化反应为：取加巴喷丁盐酸盐加入水中，20-60℃下搅拌溶解，调pH值至7.0-7.5，加入甲苯，搅拌10-120min，于0-4℃下冷却结晶，过滤得白色晶体，滤液回收与加巴喷丁盐酸盐混合后，继续下一次碱化反应，白色晶体于甲醇或异丙醇中重结晶，得加巴喷丁。

8.如权利要求7所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于所述加巴喷丁盐酸盐用量以水体积计为20.8-1038.4g/L。

9.如权利要求7所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于所述调pH值至7.0-7.5所用试剂为0.1-12mol/L的NaOH水溶液。

10.如权利要求7所述化学-酶法生产加巴喷丁的方法，其特征在于所述甲苯与水体积比为0.05-0.8:1。