CN102634562A - 检测维生素c生产菌株传代培养过程中营养环境变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：(1)混菌传代培养；(2)营养环境中物质的测定；(3)主成分分析；(4)过程分析。利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌体系产生的影响，找到影响传代培养营养环境中的重要物质，这些物质含量的变化规律为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量提供理论基础。

Description

检测维生素C生产菌株传代培养过程中营养环境变化的方法

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。

背景技术

目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。其中，第二步发酵中前者为伴生菌，后者为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力得到提高，但其作用机理尚不明确。

随着高通量的现代仪器分析技术和化学计量学方法的发展，过程分析技术(PAT)可以有效地应用于生物发酵过程中营养环境变化的研究。在两菌长期的混合培养中，它们之间的交流使得培养液的营养环境不断的发生变化，进而传递到胞内，产生一系列不同的生长及发酵行为。

如果采用PAT技术研究两菌传代培养，特别是在不断强化相互作用的过程中，检测出培养基中营养环境的变化情况，将为揭示传代培养强化两菌相互作用促进产酸的作用机制提供有利信息，并为进一步优化生产工艺等提供支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样，取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1-2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；

②样品制备：

取步骤(2)①获得的滤液10-50μL置于离心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

③GC-TOFMS检测：

将1μL步骤(2)②获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃-280℃，载气为高纯氦气，流速0.6-0.8ml/min，分流比3∶1-20∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃，保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化。

利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌体系产生的影响，找到影响传代培养营养环境中的重要物质，这些物质含量的变化规律为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量提供理论基础。

附图说明

图1为不同传代时间的氧化葡糖杆菌营养环境的主成分分析得分图(图1-1)和载荷图(图1-2)；

图2为不同传代时间的氧化葡糖杆菌传代培养过程中营养环境标志物的变化图；

图3为不同传代时间的巨大芽孢杆菌营养环境物质的主成分分析得分图(图3-1)和载荷图(图3-2)；

图4为不同传代时间的巨大芽孢杆菌传代培养过程中营养环境标志物的变化图；

图5为不同传代时间的混菌营养环境物质的主成分分析得分图(图5-1)和载荷图(图5-2)；

图6为不同传代时间的混菌传代培养过程中营养环境中差异物质的变化图；

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的500μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和500μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28℃，培养24h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28℃，200r/min摇床振荡培养24h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200r/min摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为1％为传代比接入新的种子培养基中，传代150天得到混菌细胞，在传代0-150天中选定4个取样时间分别为0天、50天、100天、150天取4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28℃培养24h；再分别转入新的种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养24h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200r/min摇床振荡培养10h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④⑤获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1mL，以5000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤；

②样品制备：

取步骤(2)①获得的滤液10μL置于离心管中，加入50μL的0.04mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃水浴中肟化反应60min；再加入50μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃水浴进行硅烷化反应30min；

③GC-TOFMS检测：

将1μL步骤(2)③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃，载气为高纯氦气，流速0.6ml/min，分流比3∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃，保持2min，以4℃/min的速度升到260℃，保持3min，使用EI电离源，源温230℃，检测器电压2300V，电离电压60eV，电流30μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；

得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较不同代数巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌和混菌体系传代培养过程中营养环境的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各营养成分，距离中心点距离越远的物质，其在传代培养的过程中的差异就越大，便可作为传代培养营养环境变化的标志物；见图1、图3和图5。

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表图2、图4和图6，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的营养环境成分，从而为揭示混菌传代培养过程中两菌的相互作用机制和培养条件优化提供了方向。

表1氧化葡糖杆菌传代培养过程中营养环境物质鉴定表

如表1所示，通过本发明的方法检测维生素C生产菌株(氧化葡糖杆菌)传代过程营养环境物质共74种，其中糖11种，氨基酸20种，糖的衍生物9种，有机酸21种，脂肪酸2种，胺类及含氮化合物等其他物质11种。

表2巨大芽孢杆菌传代培养过程中营养环境物质鉴定表

如表2所示，通过本发明的方法检测维生素C生产菌株(巨大芽孢杆菌)传代过程营养环境物质共74种，其中糖11种，氨基酸20种，糖的衍生物8种，有机酸22种，脂肪酸2种，胺类及含氮化合物等其他物质11种。

表3混菌传代培养过程中营养环境物质鉴定表

如表3所示，通过本发明的方法检测维生素C生产菌株混菌传代过程营养环境物质共77种，其中糖11种，氨基酸20种，糖的衍生物9种，有机酸24种，脂肪酸2种，胺类及含氮化合物等其他物质11种。

以0、50、100和150代的氧化葡糖杆菌传代培养的营养环境物质的相对含量为样本矩阵，进行主成分分析(图1)，得分图显示明显可以分为四类，载荷图显示随着传代的进行，培养液环境中某些氨基酸的含量显著增加。图2为区分不同传代时间的分子标志物相对含量变化图，其中缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、5-酮脯氨酸、酪氨酸和色氨酸随着传代的时间的延长呈上升趋势，且高于空白培养基，它们是氧化葡糖杆菌降解蛋白质的结果，这些物质的积累为大菌的生长提供了足够的营养。

如图3所示，以0、50、100和150代的巨大芽孢杆菌传代培养的营养环境物质的相对含量为样本矩阵，进行主成分分析，得分图显示可以有效分为四类，载荷图中5种分子标志物在第一主成分方向上顺序分布，表明这些标志物随着代数增加而逐渐变化的趋势。图4为区分不同传代时间巨大芽孢杆菌培养环境中分子标志物相对含量的随时间变化趋势。除赤藓糖和4-羟基脯氨酸外，其余标志物分子的含量均低于空白培养基，我们可以认为他们能被大菌利于用于生长和自身物质的合成。随着传代时间的延长，脯氨酸和甘氨酸含量逐渐降低，尤其是150代大菌培养环境中含量最低，明显低于出发菌株。大菌体内积累更多的脯氨酸，有助于抵抗环境胁迫；甘氨酸对细胞膜具有重要作用，高浓度的甘氨酸有助于增加细胞膜的通透性，随着传代的增加，大菌对甘氨酸的利用能力增强，有助于混菌培养时大菌胞内代谢物的释放，从而促进2-KLG的合成。培养环境中赤藓糖和4-羟基脯氨酸浓度高于空白培养基，可见它们是大菌在胞外积累的结果，且这两种标志物分子随着传代时间的延长，浓度逐渐提高，在150代大菌传代环境中达到最大。其中赤藓糖是芳香族氨基酸和维生素B₆的合成前体，能够辅助氧化葡糖杆菌合成氨基酸并改善碳中心代谢能力。

图5中，混菌细胞在传代时间为0、50、100和150天时以混菌营养环境中的物质的相对含量为样本矩阵进行主成分分析，得分图显示50代和100代的混菌较为接近，0代混菌明显与进化的混菌区分很大。在载荷图中可以看到区分样本的关键性差异分子标志物，即草酸、脯氨酸、丙二酸、5-酮脯氨酸、果糖、酪氨酸、半乳糖酸、十六烷酸、1，5-戊二胺、十八烷酸和色氨酸。这些标志物随着传代时间的延长，在培养环境中含量成降低趋势，尤其是脯氨酸和5-酮脯氨酸在150代混菌中浓度达到最低(图6)，这两种物质是影响混菌发酵2-KLG产量的关键物质。以上变化表明，随着两菌传代时间的增加，相互作用时间延长，两菌的营养环境发生变化，这些营养物质的减少，提示进化后的混菌的配合关系更好。

实施例2

一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养36h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，250r/min摇床振荡培养36h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁹CFU/mL，在30℃，250r/min摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为5％为传代比接入新的种子培养基中，传代100天得到混菌细胞，在传代0-100天选定3个取样时间取3个样，分别为0天、50天、100天；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，30℃培养36h；再分别转入新的种子培养基，在30℃，250rpm摇床振荡培养36h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁹CFU/mL，在30℃，250r/min摇床振荡培养12h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1.5mL，以8000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；

②样品制备：

取步骤(2)①所获得的滤液20μL置于离心管中，并加入100μL的0.10mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入80μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于37℃水浴中肟化反应90min；再加入80μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于37℃水浴进行硅烷化反应40min；

③GC-TOFMS检测：

将1μL步骤(2)②获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度270℃，载气为高纯氦气，流速0.8ml/min，分流比20∶1，柱温箱升温程序为：初始60℃，保持3min，以6℃/min的速度升到280℃，保持5min，使用EI电离源，源温250℃，检测器电压2500V，电离电压70eV，电流40μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较不同代数巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌和混菌体系传代培养过程中营养环境的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各营养成分，距离中心点距离越远的物质，其在传代培养的过程中的差异就越大，便可作为传代培养营养环境变化的标志物。

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的营养环境成分，从而为揭示混菌传代培养过程中两菌的相互作用机制和培养条件优化提供了方向。

实施例3

一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的200μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和200μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，35℃，培养48h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在35℃，280r/min摇床振荡培养48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280r/min摇床振荡培养，以48h为传代周期，以体积比为10％为传代比接入新的种子培养基中，在传代0-150天中选定4个取样时间取4个样，分别为0天、50天、100天、150天；

③分纯：

将步骤(1)②获得的4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，35℃培养48h；再分别转入新的种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及两种菌混合在一起的混合菌分别接种到种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280r/min摇床振荡培养15h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液2mL，以10000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤；

②样品制备：

取步骤(2)①所获得的滤液50μL置于离心管中，并加入200μL的0.14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于40℃水浴中肟化反应120min；再加入100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于40℃水浴进行硅烷化反应60min；

③GC-MSTOF检测：

将1μL步骤(2)②获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，流速0.7ml/min，分流比5∶1，柱温箱升温程序为：初始80℃，保持5min，以8℃/min的速度升到300℃，保持8min，使用EI电离源，源温260℃，检测器电压2700V，电离电压80eV，电流50μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较不同代数巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌和混菌体系传代培养过程中营养环境的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各营养成分，距离中心点距离越远的物质，其在传代培养的过程中的差异就越大，便可作为传代培养营养环境变化的标志物。

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的营养环境成分，从而为揭示混菌传代培养过程中两菌的相互作用机制和培养条件优化提供了方向。

实验证明，实施例2和实施例3与实施例1的结果类似。

本发明所采用的固体培养基、种子培养基的组成选自中国专利申请号为201110314740.9公开的培养基，例如：

固体培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCO₃1g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。

种子培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCO₃1g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。

本发明所采用的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.1483和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌的其它菌株也可以用于本发明。

Claims (1)

1.一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样，取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1-2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；

②样品制备：

取步骤(2)①获得的滤液10-50μL置于离心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

③GC-TOFMS检测：

将1μL步骤(2)②获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃-280℃，载气为高纯氦气，流速0.6-0.8ml/min，分流比3∶1-20∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃，保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化。

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