CN109207530A - 一种用日本葡萄糖酸杆菌菌株hd1025生产二羟基丙酮的方法 - Google Patents

一种用日本葡萄糖酸杆菌菌株hd1025生产二羟基丙酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用日本葡萄糖酸杆菌菌株HD1025的游离细胞高效转化甘油生成DHA的方法，在初始甘油浓度为50～200g/L的条件下，甘油转化率最高达到100％，DHA产率可达90％以上。因而，在好氧条件下，以甘油为底物，采用HD1025的游离细胞转化法能显著地积累二羟基丙酮，最高可达到180g/L，可适用于DHA的工业化生产中。

Description

一种用日本葡萄糖酸杆菌菌株HD1025生产二羟基丙酮的方法
技术领域
本发明属于生物制造领域，具体涉及到用一种好氧微生物生物(Gluconobacterjaponicas)转化甘油生产二羟基丙酮的菌种和方法。
背景技术
二羟基丙酮，又称1,3-二羟基丙酮，英文名为1,3-dihydroxyacetone或dihydroxyacetone,简写为DHA，分子式为C3H6O3，分子量为90.08，是最简单的三碳酮糖，外观是白色或类白色粉末状结晶，具有甜、凉的味道，易吸湿并分解。二羟基丙酮是一种天然存在、水溶性的最简单的酮糖，具有生物可降解性，其衍生物是有机化学合成中非常重要的一类中间体。因此作为一种重要的化工原料、医药中间体和功能添加剂在国外已经得到了广泛的实际应用。
二羟基丙酮的生产方法有化学法和生物法两种。相比生物法，化学方法具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点，而利用微生物法生产二羟基丙酮，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此越来越受到关注。二羟基丙酮的工业化生产主要是利用含有甘油脱氢酶微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的能产甘油脱氢酶的微生物为葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属(Acetobacter)，能产生二羟基丙酮的主要微生物资源如下：Bacillus xylinum、Acinetobacter sp.strainJC1DSM 3803、Acetobacter xylinum A-9、Gluconobacter melanogenus IFO 3293、Gluconobacter melanogenus IFO 3294、Hansenula polymorpha CBS 4732、Candidaboidinii 2201、Klebsiella aerogenes、Escherichia coli(strain ECFS)、Gluconobacter oxydan、Gluconobacter frateurii、Pichia membranifaciens、Bacilluslicheniformis B-05571、Acetomonas sp等。其中葡萄糖酸杆菌属的菌种研究的比较多，是工业发酵生产DHA的重要菌种。
葡萄糖酸杆菌属是专性好氧的微生物，在其微生物利用甘油合成DHA，主要是依赖微生物代谢过程中形成甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)，将甘油分子结构中仲位C上的羟基脱氢形成羰基，转化成DHA。微生物法生产二羟基丙酮的生产方法包括直接发酵法和游离细胞转化法两种。
郑裕国等(CN 100370032)利用已筛选到能产DHA的微生物菌株，包括葡萄牙棒孢酵母、地衣芽孢杆菌和膜醭毕赤酵母，并在摇瓶和发酵罐上进行了DHA的直接发酵法生产，甘油转化率达到50％～90％，病对发酵液进行分离提取，得到了比较好的发酵效果。刘宇鹏等(CN 2011103885198)利用弗托氏葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter frateurii)，采用直接发酵法，转化甘油生产DHA，DHA最高产量达到170g/L。冯屏等(食品与发酵工业，2005,31:22-26)利用醋酸杆菌游离细胞转化甘油生产DHA，甘油起始浓度60g/L，平均转化率91％。徐虹等(CN 101948878)利用Gluconobacter oxydan NG-10游离细胞转化甘油生产DHA，产率达97％，DHA最高浓度可达166.2g/L。郑裕国(CN 10591681A)利用外循环气升式反应器转化甘油生产DHA，采用刘佳甘油至总浓度300g/L的DHA，平均转化率为67％。
本课题组在2016年7月13日申请了专利“一种微生物发酵生产甘油酸的菌株HD1025和方法”(申请号CN201610549195.4)，并公开了一株Gluconobacter japonicusHD1025，该菌株在特定的条件下，能够转化甘油生成甘油酸。此菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，CGMCC No.12425，保藏日期是2016年5月9日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。申请人偶然发现上述菌株游离细胞转化时，能够转化甘油生成DHA，优化其转化条件后，DHA可耐受高浓度甘油，且能高效转化成DHA，从而完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的生产二羟基丙酮的方法，该方法以廉价的甘油为原料，甘油转化率较高。
本发明提供了如下的技术方案：
利用所述菌株HD1025转化甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD1025接种于含碳源源、氮源、甘油、无机盐和水的培养基中进行培养产酶，通过离心收集HD1025细胞，利用游离细胞法转化甘油生成二羟基丙酮。
菌株HD1025，其分类属醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)日本葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter japonicus)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCC No.12425，保藏日期是2016年5月9日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株以甘油为底物，通过直接发酵的方法，主要产物为甘油酸，其产量最高达73.04g/L，在产甘油酸的同时会产生发酵副产物为DHA，但是DHA的产量很低，最高仅为0～20g/L，在现有的报道中未有将该日本葡萄糖酸杆菌菌株用于生产DHA的报道。
本发明通过发酵产酶和生物转化两个阶段显著提高了DHA的含量：
发酵产酶阶段：
先将菌株HD1025先按1～10％的接种量接种到种子培养基中，种子培养基的组成为：甘油10～50g/L，酵母粉5～15g/L，KH2PO4 0.1～0.3g/L，余量为水，pH自然。种子培养于28～30℃好氧培养4～24h，在摇瓶中进行，摇床转速150～220r/min。
然后将培养好的种子按5～10％的接种量接入液体发酵培养基。液体发酵培养基组成为：甘油10～150g/L，葡萄糖1～10g/L，氮源5～15g/L，碳酸钙0.1～15g/L，余量为水，培养基pH自然。发酵培养于28～30℃好氧培养4～24h，在摇瓶或发酵罐中进行，发酵罐通风量0.5～1vvm，搅拌转速为200～700r/min。采用离心的方法获得含甘油脱氢酶的细胞，离心条件：4℃，8000r/min，10～20min。离心后用pH7.0的100mM的磷酸钾缓冲液洗涤三次，然后在4℃，8000rpm条件下离心10～20min。
生物转化阶段：
将发酵液离心获得的HD1025菌体细胞用转化培养基(培养基成分：50～250g/L甘油，KH2PO4 1～20g/L，K2HPO4 1～20g/L，余量为水)中悬浮，在摇瓶中进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为1～5％(湿菌体，w/w)，转化初始pH为5～8，温度为28～30℃，摇床转速150～220r/min，中总转化时间为10～72h。
DHA和甘油酸的测定方法：取发酵液1.5mL，8000r/min离心10min，取上清液0.5mL用超纯水稀释到测定线性范围(0～10g/L)，膜过滤，然后进HPLC测定。外标法计算发酵液中DHA和甘油酸的含量。色谱分离条件为:Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，UV检测器检测波长为260nm，流动相：8mmol/L硫酸。柱温为50℃，流速为0.4mL/min，进样量10μL。
甘油检测方法：采用HPLC法测定甘油含量。测定条件和DHA检测一致，检测器为示差检测器。
菌体量测定方法：采用比浊法，发酵液用2％稀盐酸稀释后，在560nm处测定吸光值。
甘油转化率定义方法：(消耗的甘油质量/投入的甘油质量)×100％
DHA产率定义方法：(产生的DHA质量/投入的甘油质量)×100％
本发明的有益效果：
在本发明将日本葡萄糖酸杆菌菌株HD1025的游离细胞也能高效转化甘油生成DHA，初始甘油浓度为50～200g/L的条件下，甘油转化率最高达到100％，DHA产量最高可达180g/L以上，高于此前的同类报道(CN201010271671，CN201110388519.8，CN200810154521.7)。由于HD1025是从自然界中筛菌获得，在不涉及基因的敲除或基因的重组的情况下本发明通过优化发酵条件，显著提高了DHA的产量；此外，转化液中还含有6～10％的甘油酸，可作为本生物转化反应的副产品提取出来，提高了的经济效益，进一步降低了生产DHA的生产成本。因而，该菌在好氧条件下，以甘油为底物，采用游离细胞转化法能显著地积累二羟基丙酮，可适用于DHA的工业化生产中。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
利用所述菌株HD1025甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：
种子培养基组成：甘油10g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4 0.2g/L，余量为水，pH自然，121℃灭菌15min。
液体发酵培养基组成：甘油50g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙1g/L，余量为水，pH自然，115℃灭菌25min。
将菌株HD1025先按5％的接种量接种到种子培养基中，30℃培养24h，摇床转速180r/min。然后，将培养好的种子按10％的接种量接入液体发酵培养基，在摇瓶(500ml摇瓶，装液量100ml)中，30℃好氧培养16h。培养结束后，离心，洗涤，收集菌体细胞。将获得的HD1025菌体细胞，用转化培养基(转化培养基成分：100g/L甘油，KH2PO4 10g/L，K2HPO4 10g/L，余量为水，pH调5.0)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为10％(湿菌体，w/w)，转化液初始pH为5.0，温度为30℃，摇床转速160r/min，转化时间为36h。测定二羟基丙酮、甘油酸和残余甘油的含量，每个实验做三次平行样，取平均值。转化结束时，DHA浓度为78.4g/L，甘油酸浓度为20.4g/L，甘油转化率100％，DHA产率为78.4％。
实施例2：
培养基成分同实施例1。将菌株HD1025先按5％的接种量接种到种子培养基中，30℃培养24h，摇床转速180r/min。然后，将培养好的种子按10％的接种量接入液体发酵培养基，在摇瓶(500ml摇瓶，装液量100ml)中，30℃好氧培养16h。培养结束后，离心，洗涤，收集菌体细胞。将获得的HD1025菌体细胞，用转化培养基(转化培养基成分：150g/L甘油，KH2PO410g/L，K2HPO4 10g/L，余量为水，pH调5.0)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为10％(湿菌体，w/w)，转化液初始pH为6.0，温度为30℃，摇床转速180r/min，转化时间为60h。转化结束时，DHA浓度为118.6g/L，甘油酸浓度为28.0g/L，甘油转化率97.6％，DHA产率为81.0％。
实施例3：
培养基成分同实施例2。将培养好的种子按10％的接种量接入液体发酵培养基，在30L发酵罐(装液量20L，通风量1vvm，搅拌转速为400r/min)中，30℃好氧培养16h。培养结束后，离心，洗涤，收集菌体细胞。将获得的HD1025菌体细胞，用转化培养基(转化培养基成分：150g/L甘油，KH2PO410g/L，K2HPO4 10g/L，碳酸钙0.5g/L，余量为水，pH调6.0)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为15％(湿菌体，w/w)，转化液初始pH为6.0，温度为30℃，摇床转速180r/min，转化时间为60h。转化结束时，DHA浓度为131.1g/L，甘油酸浓度为18.9g/L，甘油转化率99.2％，DHA产率为88.1％。
实施例4：
培养基成分及培养菌体细胞的过程同实施例3。将获得的HD1025菌体细胞，用转化培养基(转化培养基成分：200g/L甘油，KH2PO4 10g/L，K2HPO4 10g/L，碳酸钙2g/L，余量为水，pH调6.5)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为15％(湿菌体，w/w)，转化液初始pH为6.5，温度为30℃，摇床转速200r/min，转化时间为60h。转化结束时，DHA浓度为180.1g/L，甘油酸浓度为16.3g/L，甘油转化率98.8％，DHA产率为91.2％。
实施例5：
培养基成分及培养菌体细胞的过程同实施例3。将获得的HD1025菌体细胞，用转化培养基(转化培养基成分：200g/L甘油，KH2PO4 10g/L，K2HPO4 10g/L，碳酸钙2g/L，余量为水，pH调7.0)中悬浮，在摇瓶中(500ml摇瓶，装液量100ml)进行生物转化。摇瓶转化时菌体浓度为20％(湿菌体，w/w)，转化液初始pH为7.0，温度为30℃，摇床转速200r/min，转化时间为60h。转化结束时，DHA浓度为184.3g/L，甘油酸浓度为12.5g/L，甘油转化率99.7％，DHA产率为90.8％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，将日本葡萄糖酸杆菌菌株HD1025在好氧条件下培养后离心收集HD1025细胞，利用游离细胞法转化甘油生成二羟基丙酮，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCCNo.12425，保藏日期是2016年5月9日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，将菌株HD1025先按1～10％的接种量接种到种子培养基中，于28～30℃好氧培养4～24h；然后将培养好的种子按5～10％的接种量接入液体发酵培养基培养；28～30℃好氧培养4～24h，发酵罐通风量0.5～1vvm，搅拌转速为200～700r/min；然后将发酵液离心获得的HD1025菌体细胞，将HD1025菌体细胞用转化培养基悬浮，在摇瓶中进行生物转化，摇瓶转化时菌体浓度为5～20％，转化初始pH为4～8，温度为28～30℃，摇床转速150～220r/min，中总转化时间为10～72h。
3.如权利要求2所述的生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述的种子培养基为甘油10～50g/L，酵母粉5～15g/L，KH2PO40.1～0.3g/L，余量为水，pH自然；所述液体发酵培养基组成为：甘油10～150g/L，葡萄糖1～10g/L，氮源5～15g/L，碳酸钙0.1～15g/L，余量为水，培养基pH自然。
4.如权利要求3所述的生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，种子培养于28～30℃好氧培养4～24h，摇床转速150～220r/min。
5.如权利要求2所述的生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述的转化培养基的成分为50～200g/L甘油，KH2PO4 1～20g/L，K2HPO4 1～20g/L，碳酸钙0～3g/L，余量为水。
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