CN112063546B

CN112063546B - 一种葡萄糖酸杆菌cdt2及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN112063546B
Application number: CN202010803065.5A
Authority: CN
Inventors: 张汝兵; 咸漠; 初龙
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2020-08-11
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-08-11
Also published as: CN112063546A

Abstract

本发明属于微生物及发酵技术领域，提供了一种葡萄糖酸杆菌CDT2及其筛选方法与应用。本发明为了发现能够耐受高浓度甘油并可直接发酵生产高浓度和高产率1,3‑二羟基丙酮的菌株和技术，筛选出一株葡萄糖酸杆菌CDT2(Gluconobacter sp.)，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC NO:M 2020235，并发现葡萄糖酸杆菌CDT2不但能以甘油作为唯一碳源生长和直接发酵生产1,3‑二羟基丙酮，而且对甘油的脱氢能力较强，在本发明的工艺条件下，甘油的转化率可达99.2％，1,3‑二羟基丙酮的产量可达203.6g/L，1,3‑二羟基丙酮的产率可达92.5％。

Description

一种葡萄糖酸杆菌CDT2及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于微生物及发酵技术领域，具体涉及一种葡萄糖酸杆菌CDT2及其筛选方法与应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮，也称二羟基丙酮，简称DHA，是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结晶，pH为6.0时稳定。因其为还原糖，且无不对称碳原子，故无旋光性。是一种重要的精细化工产品，可作为农药合成中间体、精细化工原料和医药前体，用途广泛。

DHA的生产主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成法存在原料成本高、反应条件苛刻、设备要求高、产品收率低以及污染环境等问题，其应用受到一定限制。生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高。

目前DHA生物合成的主要途径有三种：第一种是以甘油为底物，在甘油脱氢酶的作用下生成DHA，具有这种途径的微生物主要有氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）、大肠杆菌（Escherichia coli）、木醋杆菌（Acetobacter xylinum）及产气克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）等；第二种是以甲醇为底物，在二羟基丙酮合成酶的作用下生成DHA，能进行这种生化反应的微生物主要有多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）及膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）；第三种是以果糖为底物生成DHA，是代谢果糖生成乙醇过程中形成的副产物，主要存在于运动发酵单胞菌中。

郑裕国等（CN200510061969.0）利用筛选到的能产DHA的微生物菌株，包括葡萄牙棒孢酵母、地衣芽孢杆菌和膜醭毕赤酵母，在摇瓶和发酵罐上进行了DHA的直接发酵法生产，甘油转化率达到50%～90%，并对发酵液进行分离提取。冯屏等（食品与发酵工业, 2005,31:22-26）利用醋酸杆菌游离细胞转化甘油生产DHA，甘油起始浓度60g/L，平均转化率为91%。郑裕国（CN200910097379.1）利用外循环气升式反应器转化甘油生产DHA，采用流加甘油至总浓度300g/L，DHA平均转化率为67%。徐虹等（CN201010271671.3）利用Gluconobacter oxydans NG-10游离细胞转化甘油生产DHA的产率达90%，DHA最高浓度可达166.2g/L。刘宇鹏等（CN201110388519.8）利用弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii），采用甘油直接发酵法生产，DHA最高产量达到170g/L，产率为88.5%。刘宇鹏等（CN201811353424.0）利用日本葡萄糖酸杆菌HD1025的游离细胞转化甘油生产DHA的产率达到90%，DHA最高发酵浓度达到180g/L。

以上菌株实现了以甘油为底物产生高浓度的1,3-二羟基丙酮的生产目的，但是DHA的产量和产率及甘油转化率无法同时达到一个较高的水平，或者菌株无法耐受高浓度的甘油。此外，有的生产方法是采用游离细胞来提高1,3-二羟基丙酮的产量和产率的，但增加了工艺的复杂性。因此筛选出能够耐受高浓度甘油并可直接发酵生产高浓度和高产率DHA的菌株和技术具有重要意义。

发明内容

为提高以甘油为底物生物合成1,3-二羟基丙酮的产量、产率及甘油转化率，本发明提供了一种葡萄糖酸杆菌CDT2（Gluconobacter sp.），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2020235，保藏日期为2020年6月28日，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路199号武汉大学保藏中心。

本发明还提供了一种上述葡萄糖酸杆菌CDT2的筛选方法：先从土壤中筛选出耐受高浓度甘油的菌株，再利用斐林试剂筛选出以甘油为唯一碳源发酵得到1,3-二羟基丙酮的菌株。

在本发明的一个实施例中，所述菌株CDT2的具体筛选方法为：将采集自青岛的土壤样品与生理盐水混合后进行梯度稀释，取稀释液涂布于筛选培养基中培养，然后挑取培养获得的单菌落，经种子培养基培养后，利用斐林试剂进行筛选，获得葡萄糖酸杆菌CDT2。

上述筛选培养基的组成为：甘油100g/L，酵母粉15g/L，KH₂PO₄ 3g/L，琼脂粉 20g/L，余量为水，pH 6.0；上述种子培养基的组成为：甘油20g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，余量为水，pH 6.0。

本发明还提供了上述葡萄糖酸杆菌CDT2在制备1,3-二羟基丙酮中的应用。

在上述应用中，葡萄糖酸杆菌CDT2依次经种子培养和发酵培养制备1,3-二羟基丙酮。

在上述应用中，种子培养选用的种子培养基的组成为：以质量分数计，甘油2%~5%，酵母粉1%，KH₂PO₄0.1%~0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，余量为水。

在上述应用中，种子培养的方法为：将所述葡萄糖酸杆菌CDT2接至种子培养基中，30℃培养16h获得一级种子液；然后将一级种子液接至种子培养基中，30℃培养10h获得二级种子液。

在本发明的一个实施例中，发酵培养选用的发酵培养基配方的组成为：以质量分数计，甘油2%~21%，酵母粉1%，KH₂PO₄0.1%~0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，碳酸钙0~1%，余量为水。

在本发明的一个实施例中，发酵培养的方法为：将经种子培养获得的种子液以5%体积比接至发酵培养基，前18h保持pH 6.0，之后保持pH 5.0，甘油含量低于5g/L时流加80%甘油，30℃培养72h得到发酵液。

有益效果

本发明筛选到一株耐受高浓度甘油、对甘油的脱氢能力较强并能以甘油为底物生产1,3-二羟基丙酮的葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter sp.）CDT2，利用该菌株直接发酵生产1,3-二羟基丙酮，可以达到提高1,3-二羟基丙酮产量、产率及甘油转化率的目的。经实验证明，利用菌株CDT2发酵制备1,3-二羟基丙酮，可使1,3-二羟基丙酮的产量达到203.6g/L，产率达到92.5%，甘油转化率达到99.2%，高于此前的同类报道（CN201010271671.3，CN201110388519.8，CN201811353424.0）。

附图说明

图1.葡萄糖酸杆菌CDT2发酵上清液中1,3-二羟基丙酮核磁氢谱谱图；

图2.1,3-二羟基丙酮高效液相色谱图，A为1,3-二羟基丙酮标准品高效液相色谱图；B为葡萄糖酸杆菌CDT2菌株发酵液上清中1,3-二羟基丙酮色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

筛选培养基：甘油100g/L，酵母粉15g/L，KH₂PO₄ 3g/L，琼脂粉 20g/L，余量为水，pH6.0。

种子培养基：甘油20g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，余量为水，pH 6.0。

发酵培养基：甘油30g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCO₃10g/L，余量为水。

斐林试剂：使用时取等量A、B液混合后立即使用。A液组成：34.6g五水硫酸铜溶于200mL水中，再加0.5mL浓硫酸，混匀后，用水稀释到500mL。B液组成：173g酒石酸钾钠和71g氢氧化钠固体溶在400mL水中，再稀释成500mL溶液。

DHA测定方法：取发酵液1.5mL，8000r/min离心10min，取上清液，用超纯水稀释到测定线性范围(0～10g/L)，膜过滤，然后进HPLC测定。外标法计算发酵液中DHA的含量。色谱分离条件为：HPX-87H色谱柱，UV检测器检测波长为210 nm，流动相为5 mM硫酸。柱温50℃，流速0.5mL/min，进样量10μL。

甘油检测方法：取发酵液1.5mL，8000r/min离心10min，取上清液，用超纯水稀释到测定线性范围（2～15g/L）；取CuSO₄溶液（0.05g/mL）1 mL与NaOH溶液（0.05g/mL）3.5mL，摇匀，加入10mL样品，振荡12min，过滤，然后在波长630nm处测定吸光度。配制甘油标准品绘制标准曲线计算发酵液中甘油的含量。

实施例1、目的菌株的筛选

菌株的筛选

从山东青岛市平度市同和街道果园采集土壤样品，称取样品10g，加入90mL无菌生理盐水，震荡1h。取上层悬浮液，10倍梯度稀释。取10^-5、10^-6、10^-7三个梯度0.1mL的悬浮液涂布于筛选培养基平板。30 ℃培养，挑选生长良好的单菌落保存。种子培养基培养于50 mL无菌离心管，30℃，200rpm的摇床中培养24h。取100μL菌液加入96孔板中，加入60μL现配斐林试剂混匀后静置半小时，观察颜色变化。获得与斐林试剂反应呈现砖红色的菌株。

菌株的鉴定

挑取单菌落采用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）进行菌落PCR；PCR条件为：95℃，5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸5min。PCR产物由华大基因进行16S rDNA测序分析，将测序结果在NCBI中与已有序列进行Blast比对分析，结果表明其与Gluconobacter japonicus的16S rDNA相似性最高，将其命名为葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter sp.）CDT2。提交并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2020235。

实施例2、利用葡萄糖酸杆菌CDT2制备1,3-二羟基丙酮（DHA）

一级种子：种子培养基培养一级种子，50mL无菌离心管培养，装液量为4mL，挑取单菌落加入上述离心管内，30℃摇床培养约16h；

二级种子：500mL三角瓶培养，装液量为100mL，加入2mL上述获得的一级种子，30℃摇床培养10h；

发酵罐培养：装液量2L，接种前加入7g/L的CaCO₃粉末，上述获得的二级种子以5%体积比进行接种，30℃培养，前18h保持pH 6.0，之后保持pH 5.0，甘油含量低于5g/L时补加甘油，40h时再补加3g/L的CaCO₃粉末，共培养72h，发酵过程通气量为1.5vvm，发酵罐中消耗的甘油总量为220g/L。发酵结束测得DHA含量203.6g/L，甘油转化率达到99.2%，1,3-二羟基丙酮产率为92.5%。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

本发明筛选获得的葡萄糖酸杆菌CDT2，其16S rRNA对应的DNA序列如SEQID NO.3所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种葡萄糖酸杆菌CDT2及其筛选方法与应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 1492R

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1334

<212> DNA

<213> CDT2

<400> 3

gcgtccttgc ggttcgctca ccggcttaag gtcgaaccaa ctcccatggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120

tccaccttca tgtactcgag ttgcagagta caatccgaac tgagacggct tttagagatc 180

agcactgtgt caccacatag cttcccactg tcaccgccat tgtagcacgt gtgtagccca 240

ggacataagg gccatgagga cttgacgtca tccccacctt cctccggctt gtcaccggca 300

gtctctctag agtgcccacc tgaaagtgct ggcaactaaa gacaagggtt gcgctcgttg 360

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtgcgg 420

gaggtccgaa gaaataccca tctctgagta cgtcctcccc atgcaagccc tggtaaggtt 480

ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540

ctttgagttt caaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtg tgcttagcgc gttagcttcg 600

acactgagta actaagttac ccaacatcca gcacacatcg tttacagcgt ggactaccag 660

ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtat cgagccaggt 720

tgccgccttc gccaccggtg ttcttcccaa tatctacgaa tttcacctct acactgggaa 780

ttccacaacc ctctctcgaa ctctagtcaa tgcgtctcaa atgcagttcc caggttaagc 840

cccggggatt tcacatctga ctgcatcaac cgcctacgcg ccctttacgc ccagtcattc 900

cgagcaacgc tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta gccggggctt 960

cttctacggg taccgtcatc atcgtccccg tcgaaagtgc tttacaatcc gaagaccttc 1020

ttcacacacg cggcattgct ggatcaggct ttcgcccatt gtccaatatt ccccactgct 1080

gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcat cctctcaaac 1140

cagctatcga tcatcgcctt ggtaggcctt taccccacca actagctaat cgaacgcagg 1200

ttcctccaca ggcgacttgc gcctttgacc ctcaggtatc atgcggtatt agctccagtt 1260

tcccggagtt gtcccccacc catggataga tccctacgcg ttactcaccc gtccgccact 1320

aatcccgaaa gatc 1334

Claims

1.一种葡萄糖酸杆菌CDT2（Gluconobacter sp.）在制备1,3-二羟基丙酮中的应用，其特征在于，所述葡萄糖酸杆菌CDT2的保藏号为CCTCC NO: M 2020235；所述应用是将所述葡萄糖酸杆菌CDT2依次经种子培养和发酵培养制备1,3-二羟基丙酮；所述种子培养选用的种子培养基的组成为：以质量分数计，甘油20 g/L，酵母粉10 g/L，KH₂PO₄1 g/L，MgSO₄·7H₂O0.5 g/L，余量为水；所述发酵培养选用的发酵培养基的组成为：以质量分数计，甘油30 g/L，酵母粉10 g/L，KH₂PO₄5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，碳酸钙10 g/L，余量为水；所述发酵培养的方法为：将经种子培养获得的种子液以5%体积比接至发酵培养基，前18h保持pH6.0，之后保持pH 5.0，甘油含量低于5g/L时流加80%甘油，30℃培养72h得到发酵液。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述种子培养的方法为：将所述葡萄糖酸杆菌CDT2接至种子培养基中，30℃培养16h获得一级种子液；然后将一级种子液接至种子培养基中，30℃培养10h获得二级种子液。